全 文 ：收稿日期:2016 － 06 － 27
基金项目:黔南医专基金项目 (QNYZ201306)。
作者简介:王小果 (1982 －)，女，硕士研究生，讲师，从事天然药物研究及相关教学工作。E －mail:450718418@ qq. com
大孔吸附树脂分离纯化苗药雪人参中
α －葡萄糖苷酶抑制物质的研究
王小果1 张汝国1 王 明2 司高飞3
1. 黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558000;
2. 黔南州外侨台港服务中心，贵州 都匀 558000;3. 黔南州民族医药研究协会，贵州 都匀 558000
【摘 要】 目的:筛选出纯化苗药雪人参中 α －葡萄糖苷酶抑制物质的最佳大孔树脂，并对影响分离纯化的主要因
素进行探讨，确定最优工艺参数。方法:采用分光光度法和酶标法测定雪人参乙醇提取液中 α －葡萄糖苷酶抑制物质的含
量，并通过静态吸附和动态吸附两种方法筛选出最佳大孔树脂，以 α －葡萄糖苷酶抑制物质酶活性抑制率为指标对优化后
的工艺条件进行验证。结果:大孔树脂 HPD600 在室温下吸附效果最好，优化后的工艺参数为提取液 pH = 8. 0、提取液体
积与大孔树脂质量之比为 1∶10，洗脱剂为 70%乙醇溶液，洗脱体积为 3BV。结论:纯化前后 α －葡萄糖苷酶抑制物质酶活
性抑制率提高约 3 倍，工艺稳定。
【关键词】 雪人参;大孔吸附树脂;α －葡萄糖苷酶抑制物质
【中图分类号】Ｒ284. 2 【文献标志码】A 【文章编号】1007 － 8517 (2016)18 － 0017 － 04
Separation and purification of α －Glucosidase inhibitor in Ｒadix Indigofera by macroporous adsorption resin
WANG Xiaoguo1 ZHANG Ｒuguo1 WANG Ming2 SI Gaofei3
1． Qiannan Medical College For Nationalities，Duyun 558000，China;
2． The servicer of Foreign and Taiwan，Hongkong and Macao Affairs of Qiannan Prefecture，Duyun 558000，China;
3． Qiannan Medical Ｒesearch Association For Nationalities，Duyun 558000，China
Abstract:To separate and purify the α － glucosidase inhibitor from Ｒadix Indigofera by macroporous adsorption resin and estab-
lish optimum process for separating and purifying α － glucosidase inhibitor． The adsorption and desorption capacities of macroporous
resins were investigated through examining the contents of the α － glucosidase inhibitor and the effects of several influencial factors on
the abosorption of α － glucosidase inhibitor by macroporous resin were studied． Among 5 types of resins tested，HPD600 was shown to
be the best，one for purification of α － glucosidase． The optimum ratio of herb to macroporous resin and pH value for HPD600 adsorp-
tion were 1 /10 and 8. 0 ethanol． After HPD600 resin purification the activity of Ｒadix Indigofera α － glucosidase up to about 3 times．
This research provided references for large － scale production of α － glucosidase of Ｒadix Indigofera．
Key words:Ｒadix Indigofera;Macroporous Adsorption Ｒesin;α － Glucosidase Inhibitor
近年来，糖尿病发病率逐年增大，已成为继
肿瘤和心脑血管疾病后的第三大慢性疾病，因此
侧重长期治疗且措施个体化，以达到控制病情、
防止或减少并发症的目的［1］。而传统降糖药物对
血糖的控制并不理想［2］。临床研究表明，α －葡萄
糖苷酶抑制剂是一类新型口服降糖药物［3］，可以
缓解高胰岛素血症和防治餐后高血糖症，还可以
减少血糖波动对机体器官的损伤，提高糖耐量，
具有非常广阔的应用前景。近年开发的伏格列波
糖和米格列醇等作为治疗Ⅱ型糖尿病的首选药和
Ⅰ型糖尿病的辅助药物已广泛应用于临床。
雪人参 (Ｒadix Indigofera)为豆科木蓝属植
物茸毛木蓝的根，又名铁刷子、血人参、红苦刺
和山红花，主要分布于云南、贵州、广西等地，
具有抗氧化［4］、补虚活血、降血糖及调经舒筋等
功效，在贵州苗族地区，药用历史悠久。其化学
成分研究表明，其富含黄酮类、萜类、酚类等化
合物［5 － 7］。李园园等［8］报道雪人参乙醇提取物具
有 α －葡萄糖苷酶抑制作用，但尚未见对雪人参
乙醇提取物经大孔树脂纯化后对 α －葡萄糖苷酶
的抑制作用研究。本实验探讨了大孔树脂分离纯
化雪人参中 α －葡萄糖苷酶抑制物质的工艺条件，
为 α － 葡萄糖苷酶抑制剂的制备及应用提供新
思路。
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1 仪器与材料
1. 1 仪器 Multiskan MK3酶标仪 (美国 Thermo E-
lectron公司);SP － 75PC 型紫外可见分光光度计
(上海光谱仪器有限公司);FW －177 型中草药粉碎
机 (天津泰斯特仪器有限公司);BSA224S － CW 型
电子天平 (赛多利斯科学仪器 (北京)有限公司);
TGL －16G 高速台式离心机 (上海安亭科学仪器
厂) ;HH系列数显恒温水浴锅 (金坛市科析仪器有
限公司);PH － 618 型酸度计 (上海仪电科学仪器
有限公司);96微孔酶标板，各型号微量进样器。
1. 2 材料 雪人参采集于贵州省都匀市周边，用
中草药粉碎机粉碎，过 20 ～ 60 目标准筛。4 －硝基
苯基 α － D －吡喃葡萄糖苷 (4 － N － trophenyl － α
－ D － glucopyranoside，PNPG，美国 Sigma 公司);
α － 葡萄糖苷酶 (α － glucosidase，美国 Sigma 公
司);阿卡波糖 (Acarbose，德国 Serva 公司);二
甲基亚砜 (DMSO，美国 Sigma 公司)，无水乙醇
等均为分析纯试剂。
2 方法
2. 1 大孔树脂的预处理 将 D101、AB －8、HPD600、
HPD100、X －5五种大孔树脂用95%乙醇浸泡24h后，
用 95%乙醇淋洗至流出液不浑浊为止，然后用蒸馏水
洗至无醇，备用。
2. 2 雪人参中 α －葡萄糖苷酶抑制物质的提取
称取雪人参粉末 100g，加入一定量 60%乙醇溶液，
回流提取 3 次，每次 2h，合并提取液，离心，上
清液减压蒸干，用 20%二甲基亚砜溶液溶解后定
容到 1000mL容量瓶中，备用。
2. 3 大孔树脂的筛选 分别称取 5g上述 5 种大孔
树脂于 100mL锥形瓶中，加入 80mL雪人参乙醇提
取液 (质量浓度为 2. 252mg /mL，下同)，常温下
在振荡器上提取 2h，静止 24h后，离心分离，以 α
－葡萄糖苷酶抑制物质酶活性抑制率 (简称酶活
性抑制率)为指标，测定上清液中 α －葡萄糖苷酶
抑制物质的含量。酶活性抑制率越小，表明上清
液中 α －葡萄糖苷酶抑制物质的含量越低，则该树
脂的吸附性能就越好［9］。
2. 4 α －葡萄糖苷酶抑制物质活性测定［10］ 在 96
微孔酶标板上，加入 112μL 磷酸钾缓冲液 (pH =
6. 8)，8μL上述上清液和 20μL 0. 1U /mL α －葡萄
糖苷酶，混合均匀后，于 37℃ 恒温箱中孵育
30min，再加入 20μL 4. 0mmol /L PNPG 开启反应，
置于 37℃恒温箱中反应 30min，最后加入 80μL
0. 2mol /L Na2CO3 溶液终止反应，于 405nm 处测
其 OD值，根据下式计算出上清液中酶活性抑制率
(用 Y表示)，A0 表示空白对照组 OD 值 (不加样
液)，Aj 表示样品组 OD 值，由于雪人参乙醇提取
液本身就有颜色，因此需要测定其背景吸收，并
对测定结果进行校正。
Y = 「(Ao － Ai) /A0」 × 100%
2. 5 静态吸附
2. 5. 1 吸附时间 准确称取 5g HPD600 大孔树脂
置于 100mL锥形瓶中，加入 80mL雪人参乙醇提取
液，常温下振荡 2h，静态吸附不同时间，离心，
测定上清液中 α －葡萄糖苷酶抑制物质的含量，根
据上述公式计算酶活性抑制率。
2. 5. 2 吸附温度和树脂质量 分别称取不同质量
的 HPD600 大孔树脂置于 100mL 锥形瓶中，加入
提取液 80mL，在 15、20、25、30、35、40、50℃
下振荡 2h，静态吸附 24h，离心，测定上清液中 α
－葡萄糖苷酶抑制物质的含量，根据上述公式计
算酶活性抑制率。
2. 6 动态吸附 分别称取 5g上述 5 种树脂，装入
30mm ×300mm层析柱中，80mL 提取液冲洗该柱，
流速控制在 2 － 3 BV /h，收集流出液，先用 2BV去
离子水冲洗层析柱，再用 3BV 70%乙醇溶液洗脱，
并收集流出液，减压蒸干后，用 20%二甲基亚砜
溶解，定容至 50mL，测定 α －葡萄糖苷酶抑制物
质的含量，根据上述公式计算酶活性抑制率。
2. 6. 1 提取液的 pH 值 称取 5g HPD600 大孔树
脂 7 份，湿法装柱，用 5% NaOH和 1mol /L HCl溶
液调节提取液的 pH 值分别为 1. 0、3. 5、5. 0、
6. 0、7. 0、8. 0、10. 0，使 80mL不同 pH值的提取
液经过层析柱，以下按 2. 6 步骤操作。
2. 6. 2 洗脱液的筛选 取 5g HPD600 大孔树脂，
湿法装柱，使 80mL提取液经过层析柱，吸附完全
后，先用 2BV去离子水冲洗，再分别用 3BV 70%
甲醇溶液、70%乙醇溶液和 70%乙酸乙酯溶液洗
脱，以下按 2. 6 步骤操作。
2. 6. 3 洗脱液的体积分数 称取 5g HPD600 大孔
树脂 8 份，湿法装柱，各使 80mL 提取液经过层析
柱，吸附完全后，先用 2BV 去离子水冲洗，再分
别用 3BV 20%、30%、40%、50%、60%、70%、
80%、95%乙醇溶液洗脱，以下按 2. 6 步骤操作。
2. 6. 4 洗脱液的用量 取 5g HPD600 大孔树脂，
湿法装柱，使 80mL提取液经过层析柱，吸附完全
后，先用 2BV去离子水冲洗，再分别用 1、2、3、
4、5BV 70%乙醇溶液洗脱，以下按 2. 6 步骤操作。
3 结果
3. 1 静态和动态吸附 5 种大孔树脂对雪人参提
取液中 α －葡萄糖苷酶抑制物质的吸附情况如表 1
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所示。被 5 种大孔树脂吸附后的提取液中 α －葡萄
糖苷酶抑制物质酶活性抑制率均有所下降，表明 5
种树脂对 α －葡萄糖苷酶抑制物质均有吸附。但由
于树脂的孔径、极性和比表面积等性质的不同，
吸附能力亦不相同，其中，HPD － 600 的酶活性抑
制率最低，说明该树脂对 α －葡萄糖苷酶抑制物质
吸附最多，效果最好，因此选为进一步实验的最
佳树脂。
3. 2 吸附速率 吸附速率是衡量吸附效果的重要
指标。不同的吸附时间，大孔树脂对雪人参乙醇
提取液中 α －葡萄糖苷酶抑制物质的吸附效果也不
相同，通过对大孔树脂 HPD600 吸附时间的考察后
发现，前 5h 吸附速率较大，之后渐缓，表明该树
脂在 5h内已基本吸附完全。如图 1。
3. 3 温度和树脂质量对吸附效果的影响 25℃时，
α －葡萄糖苷酶抑制物质酶活性抑制率最低，且随
着 HPD600 树脂质量的增大，酶活性抑制率逐渐降
低，在提取液体积 (80mL)和树脂质量 (5g)之
比为 16∶1 时基本不再变化，表明该树脂对 α －葡
萄糖苷酶抑制物质的吸附达到饱和。如图 2。
表 1 5 种树脂对 α －葡萄糖苷酶抑制物质静态和动态吸附测定结果
序号 树脂型号 树脂极性 比表面积 /m2 /g 静态吸附后酶活性抑制率 /% 动态吸附后酶活性抑制率 /%
1 HPD － 600 极性 550 ～ 600 34. 13 43. 11
2 X － 5 弱极性 500 ～ 600 67. 97 71. 67
3 HPD － 100 非极性 650 ～ 700 46. 35 46. 33
4 AB － 8 弱极性 480 ～ 520 52. 24 59. 64
5 D101 非极性 500 ～ 550 44. 44 50. 23
3. 4 提取液 pH值 当雪人参乙醇提取液的 pH值
为 8. 0 时，酶活性抑制率最低，表明 HPD600 树脂
对提取液中 α －葡萄糖苷酶抑制物质的吸附率最
高，因此选择提取液 pH 值为 8. 0 作为进一步实验
的最佳酸度。详见图 3。
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3. 5 洗脱条件的考察结果
3. 5. 1 洗脱液的确定实验 通过对 70%甲醇溶
液、70%乙醇溶液和 70%乙酸乙酯溶液的洗脱效
果进行考察后发现，70%乙醇溶液作为洗脱液时，
α －葡萄糖苷酶抑制物质酶活性抑制率最高，如表
2 所示，表明洗脱效果最好，故选用为进一步实验
的洗脱液。
3. 5. 2 洗脱液体积分数 随着乙醇溶液体积分数
的增大，洗脱液中 α －葡萄糖苷酶抑制物质酶活性
抑制率逐渐增大，当乙醇浓度为 70%时，曲线呈
平缓趋势，考虑到经济成本，采用 70%乙醇溶液
即可达到较好的解吸效果。见图 4。
表 2 3 种洗脱液对 α －葡萄糖苷酶抑制物质洗脱效果
序号 洗脱液
洗脱液中 α －葡萄糖苷酶
抑制物质酶活性抑制 /%
1 70%甲醇 63. 16
2 70%乙醇 91. 69
3 70%乙酸乙酯 56. 35
3. 5. 3 洗脱液用量 通过对 1、2、3、4、5BV
(1BV =25mL)洗脱液洗脱效果的考察后发现，从
第 3 份洗脱液开始，其中的 α －葡萄糖苷酶抑制物
质已非常微量，表明 3 倍柱体积的 70%乙醇溶液
已能基本洗脱树脂所吸附的 α －葡萄糖苷酶抑制物
质，因此确定洗脱液的体积为 3BV。
3. 6 工艺验证 按照优化后的工艺参数，将 100g
雪人参粉末经回流提取所得的浸膏制成提取液，
使 80mL该提取液通过装有 5g HPD600 大孔吸附树
脂的层析柱 (30mm × 300mm)中进行纯化，通过
测定提取液纯化前后 α －葡萄糖苷酶抑制物质酶活
性抑制率验证纯化工艺效果，通过计算，纯化前
雪人参乙醇提取液中 α －葡萄糖苷酶抑制物质酶活
性抑制率为 37%，纯化后为 71. 23%，提高约
3 倍。
4 结论
通过对 5 种大孔吸附树脂吸附性能的考察，筛
选出纯化苗药雪人参乙醇提取液中 α －葡萄糖苷酶
抑制物质的大孔树脂为 HPD600，并通过静态和动
态吸附对影响分离纯化的主要因素进行优化，从
而确定出 HPD600 树脂在室温下吸附，吸附时用
5%NaOH和 1mol /L HCl 溶液调节提取液的 pH 值
为 8. 0，提取液体积与大孔树脂质量之比为 16 ∶ 1，
采用 70%乙醇溶液作为洗脱剂，洗脱体积为 3 倍
柱体积。经过大孔树脂纯化后的提取液，对 α －葡
萄糖苷酶抑制物质抑制率提高了约 3 倍，优化工艺
稳定可行，希望为 α －葡萄糖苷酶抑制剂的制备和
应用提供一定的参考。
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(编辑:梁志庆)
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