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鄂西北产猫眼草提取物体外抗氧化性及光稳定性测试



全 文 :西北农业学报 2012,21(4):137-141
Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica
鄂西北产猫眼草提取物体外抗氧化性及光稳定性测试

余海忠,阮士龙,刘 统,孙永林
(襄樊学院 化学工程与食品科学学院,湖北襄阳 441053)
摘 要:猫眼草为鄂西北地区常见的野生有毒植物种,经测定具有较强的杀虫、抑菌活性。为了深入开发此
植物资源,室内测定其提取物的体外抗氧化性及光稳定性。采用α-脱氧核糖法、邻苯三酚自氧化法、DPPH自
由基清除法和铁氰化钾还原法等方法体外评价猫眼草提取物的抗氧化性。同时,采用高效液相色谱法测定其
光稳定性。结果表明:①随着猫眼草提取物质量浓度的升高,羟自由基、氧自由基、DPPH自由基的清除率上
升,分别高达82.04%、87.99%、87.73%。在一定范围内,随着猫眼草提取物质量浓度的升高,对铁氰化钾的
还原能力也在升高。②猫眼草提取物的光稳定性较差,Tween-20(表面活性剂)和水杨酸苯酯(光稳定剂)对
其具有一定的光稳定增效作用。
关键词:猫眼草;提取物;体外抗氧化性;光稳定性
中图分类号:Q94    文献标志码:A     文章编号:1004-1389(2012)04-0137-05
In vitro Antioxidant and Photostability Testing for Extracts
of Enphorbia lunulata Bgel from Northwestern Hubei
YU Haizhong,RUAN Shilong,LIU Tong and SUN Yonglin
(School of Chemical Engineering and Food Science,Xiangfan University,Xiangyang Hubei 441053,China)
Abstract:Enphorbia lunulata Bgel,a common toxic plant species distributed in Northwestern Hubei,
was detected to have good insecticidal and fungicidal activities.To exploit this resource,it’s neccessa-
ry to evaluate in vitro antioxidant and photostability of its extract.The folowing methods was used to
measure the antioxidantion of E.lunulataextracts including a-deoxyribose method,adjacent pyrogal-
lol auto-oxidation method,DPPH radical scavenging method and iron potassium ferricyanide reduction
method and its photostability was tested by HPLC method as wel.The results showed as folowed:
(i)With the concentration increase of the E.lunulataextracts,the clearance rate of the hydroxyl rad-
icals,the oxygen free radicals,and DPPH free radicals rises up,reaching up to 87.73%,87.99%,
and 82.04%,respectively.Within a certain range,along with the concentrations of E.lunulataex-
tracts,the iron potassium cyanide reductive ability is also on the rise.(i)The testing revealed that
E.lunulata extracts had bad photostability and the Tween-20 (surfactant)and phenyl salicylate
(light stabilizer)were found to have a certain degree of light atability on E.lunulataextracts.
Key words:Enphorbia lunulata Bgel;Extract;In vitro antioxidantion;Photostability
  猫眼草(Enphorbia lunulata Bgel)为大戟科
多年生野生有毒植物种,在鄂西北地区常见,全草
含黄酮甙、猫眼草素、山奈粉、槲皮素、鼠李糖甙等
成分。相关报道及襄樊学院化学工程与食品学院
实验室测定结果表明,猫眼草对一些害虫和植物
病原微生物有显著的抑制作用,具有潜在的植物
* 收稿日期:2011-09-24  修回日期:2011-11-20
基金项目:湖北省教育厅优秀中青年人才项目(Q20082504);湖北省襄阳市科技攻关项目(200517;2011GG1C10);襄樊学院植物
资源研究开发培育团队项目(Kypytd200901)。
第一作者:余海忠,男,博士,从事植物次生代谢产物应用研究。E-mail:haizhongvip@126.com
性农药开发前景[1]。目前,关于猫眼草提取物抗
氧化性及光稳定性方面的研究尚为空白,为了给
猫眼草植物性杀虫剂、杀菌制剂的开发提供理论
依据,很有必要进行这方面的研究。因此,本试验
采用α-脱氧核糖法、邻苯三酚自氧化法、DPPH
自由基清除法、铁氰化钾还原法来评价猫眼草无
水乙醇提取物的抗氧化性。同时,以 Maoyancao-
suⅠ为示踪标定物,在紫外光和可见光照射下分
别考察各种表面活性剂、光稳定剂对猫眼草提取
物光稳定性的影响。
1 材料与方法
1.1 供试植物
猫眼草全草(根茎叶)采自湖北襄阳古隆中风
景区,按以下步骤对其进行处理:植株经自来水、
蒸馏水冲洗后置干燥箱中45℃干燥至恒量,微型
植物粉碎机粉碎。干粉经无水乙醇反复浸提,合
并提取液经旋转蒸发仪减压浓缩得浸膏,45℃干
燥至恒量后称量,4℃遮光保存。
1.2 仪器设备
微型植物粉碎机(天津市泰斯特)、电热恒温
鼓风干燥箱(上海博讯)、循环水式真空泵(英峪予
华),旋转蒸发仪(上海亚荣)、电子分析天平(梅特
勒-托利多上海公司)、可调式微量移液器(Finnpi-
pette)、光照培养箱(广东医疗)、高效液相色谱仪
(上海天美)、紫外-可见分光光度计(日本岛津)、
便携式紫外照射灯(北京六一)和2mL白色薄壁
容量瓶(天津玻璃)。
1.3 药品试剂
DPPH购自Sigma公司;硫代巴比妥酸、Fe-
SO4、EDTA、α-脱氧核糖、磷酸、H2O2、三氯乙酸、
Tris-HCl、邻苯三酚、HCl、甲醇、铁氰化钾、无水
乙醇,表面活性剂 Tween-80、Tween-20、Span-
80,光稳定剂对氨基苯甲酸(PABA)、8-羟基喹啉
(8-Hydroxyquinoline)、水杨酸苯酯(Salol)购自
上海国药集团,均为分析纯;甲醇,购自上海国药
集团,色谱纯;MaoyancaosuⅠ标准品,购自芜湖
甙尔塔医药科技有限公司。
1.4 抗氧化性能力评价
1.4.1 ·OH自由基清除能力的测定 采用α-
脱氧核糖法,取0.20mL的FeSO4-EDTA混合
液(10mmol·L-1)于具塞试管中,加入0.20mL
α-脱氧核糖溶液(10mmol·L-1),然后加入1mL
不同质量浓度(1、2、3、4、5g·L-1)的样品无水乙
醇 溶 液,并 用 磷 酸 缓 冲 液 (pH = 7.4,
0.1mol·L-1)定容到1.8mL,最后加入0.20
mL H2O2(10mmol·L-1),混匀后于37℃水浴
中恒温保持1h;然后再加入w=2.8%三氯乙酸
(TCA)溶液 1.0mL,w=1.0%硫代巴比妥酸
(TBA)溶液1.0mL,混匀后于沸水浴中加热
10min;冷水冷却后在532nm 处测定吸光值
AS[2]。不加样品溶液,同上操作处理,测定其对
比吸光值AC。不加样品溶液且不在37℃水浴中
反应作为参比。以清除率表示样品的羟自由基清
除能力。
清除率=[(1-AS)/AC]×100%
1.4.2 ·O2 自由基清除能力的测定 采用邻
苯三酚自氧化法,取4.5mL pH 8.2的Tris-HCl
缓冲液(50mmol·L-1)于具塞试管中,先后加入
3.2mL蒸馏水和1mL不同质量浓度(1、2、3、4、
5g·L-1)的样品无水乙醇溶液(空白管用无水乙
醇代替)。混匀后在25℃水浴中保温20min,取
出后立即加入25℃预热过的0.3mL邻苯三酚
(3mmol·L-1),空白管用10mmol·L-1 HCl
代替。迅速摇匀后倒入比色杯,在325nm处每
隔30s测定吸光值,共测4min,推迟30s[3]。以
清除率表示清除能力。
清除率=[(A0-A)/A0]×100%
其中,A=A1-A2,A0 为邻苯三酚自氧化速
率,A1 为加入样品后邻苯三酚自氧化速率,A2 为
样品的自氧化速率。
1.4.3 ·DPPH 自由基清除能力的测定 取
3.9mL DPPH甲醇溶液(25mg·L-1)于具塞试
管中,与 0.1 mL 不同质量浓度 (1、2、3、4、
5g·L-1)的样品甲醇溶液剧烈混合。暗处反应
30min(读数较稳定)后,在515nm波长处测定吸
光值,空白管用甲醇溶液代替样品溶液。以清除
率和样品浓度做标准曲线,求IC50值[4]。
清除率=[(A0-A)/A0]×100%
其中,A0 为空白吸光值,A为样品吸光值。
1.4.4 还原能力测定 采用铁氰化钾还原法,取
1mL不同质量浓度(1、2、3、4、5g·L-1)的样品
无水乙醇溶液与2.5mL pH 6.6的磷酸盐缓冲
液(0.2mol·L-1)及2.5mL w=1%铁氰化钾
溶液混合,50℃保温20min,加入2.5mL w=
10%三氯乙酸,混匀,静置10min,于700nm处
测吸光值[5]。以吸光值大小表示还原能力大小。
·831· 西 北 农 业 学 报                  21卷
1.5 光稳定性测定
1.5.1 样品的处理 准确称取猫眼草浸膏,用无
水乙醇配成0.05g·mL-1样品溶液1 000mL,
并将溶液分成3部分,分别进行以下处理:不加助
剂、添加表面活性剂、添加光稳定剂。然后将上述
3种样品溶液分装到不同白色薄壁容量瓶中,定
容至2mL。所有容量瓶均用铝箔严实包裹,置冰
箱中待用。试验所需的可见光来自光照培养箱,
紫外线来自紫外灯(254nm)。设置4个光照时
间段:连续光照4、8、12、24h,每个时间段设5个
重复,同时设置空白对照。试验时,首先使用
HPLC仪测定各样品溶液中猫眼草素初始含量,
然后分别置可见光和紫外光下照射[6-7]中,经过一
段时间后,取出样品溶液加入无水乙醇重新定容
至2mL,再次使用 HPLC仪测定猫眼草素终含
量,按下式计算光解率。
光解率=(初始含量-终结含量)/初始含量
×100%
1.5.2 测定条件 采用 HPLC方法进行测定。
测定条件:选用柱型为Lichrospher C18(6.0mm
×150mm),柱温40 ℃,流动相为V(甲醇)∶
V(磷酸,w = 0.4%)= 59 ∶ 41,流 速 为
1.0mL·min-1,检测波长为370nm,进样体积
为20μL。取猫眼草素Ⅰ标准品用无水乙醇配制
成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05g/L。经检测猫眼
草素Ⅰ的保留时间为8.725min。以猫眼草素Ⅰ
质量浓度(y)与它对应的峰面积(x)进行线性回
归,得标准曲线方程为 y= -305 702.7 +
7.950 95×107 x,r=0.997。
2 结果与分析
2.1 猫眼草提取物的体外抗氧化性
2.1.1 对·OH、·O2、·DPPH 的清除活性 
利用脱氧核醣法、邻苯三酚自氧化法和 DPPH
法,室内测定猫眼草提取物对·OH、·O2、·DP-
PH的清除活性。由表1可知,猫眼草提取物对
3种自由基的清除率均随着其质量浓度的增高而
上升,在最高质量浓度为5.00g·L-1时,·OH
清除率达到82.04%,·O2 为87.99%,·DPPH
的为87.73%;IC50值即清除50%自由基时所需要
的自由基清除剂质量浓度。故IC50值越小,清除
自由基的能力越强。经计算猫眼草提取物质量浓
度分别达到 2.71、2.81和 2.73g·L-1时,
·OH、·O2、·DPPH的清除率达到一半。
表1 猫眼草提取物对不同自由基的清除活性
Table 1 Scavenging activity of E.lunulataextract on different free radicals
自由基
Free radical
不同质量浓度样品对自由基的清除率/%
Different free radicals’scavenging rate
1g·L-1  2g·L-1  3g·L-1  4g·L-1  5g·L-1
IC50/(g·L-1)
·OH  19.37  36.84  57.77  78.46  82.04  2.71
·O2 13.50  37.84  54.95  72.98  87.99  2.81
·DPPH  20.33  38.59  55.75  71.39  87.73  2.73
2.1.2 对铁氰化钾的还原活性 由图1可以看
出,在一定范围内,吸光值随猫眼草提取物质量浓
度的增高而上升,即对铁氰化钾的还原力随着提
取物 质 量 浓 度 的 增 高 有 上 升 的 趋 势,但 在
4g·L-1以后,还原能力随着猫眼草提取物质量
浓度的增高会下降。
2.2 猫眼草提取物的光稳定性
2.2.1 表面活性剂对光稳定性的影响 在农药
制剂中,加入表面活性剂能对有效成分起到助溶、
分散、匀湿和渗透的作用,表面活性剂的存在会影
响有效成分的紫外光吸收。选取 Tween-20、
Tween-80、Span-80 为 供 试 表 面 活 性 剂,按
V(助剂)∶V(样品)=1∶1 000加入到样品溶液
中,其中,Span-80先按V(助剂)∶V(溶剂)
=1∶50配成异丙醇溶液。由图2和图3可知,无
论照射紫外光还是可见光,随着光照时间的延长,
猫眼草素的含量在不断下降。24h后空白对照
组 的光解率分别达到7 5.6 7%(紫外线)和
图1 猫眼草提取物对铁氰化钾的还原能力
Fig.1 Reducing powers of E.lunulataextract
on potassium ferricyanide
·931·4期        余海忠等:鄂西北产猫眼草提取物体外抗氧化性及光稳定性测试
65.99%(可见光)。加入表面活性剂后,Tween-
20和Tween-80均对猫眼草提取物具有一定的光
稳定增效作用,且前者的作用要强于后者。但
Span-80不能提高光稳定性,反之,却能加速猫眼
草提取物的光解。
2.2.2 光稳定剂对光稳定性的影响 选取对氨
基苯甲酸、8-羟基喹啉、水杨酸苯酯为光稳定剂,
用无水乙醇配成0.0 0 5g·mL-1的溶液,再按
图2 紫外线照射下表面活性剂对猫眼草
提取物光稳定性的影响
Fig.2 Effect of surfactant on E.lunulataextract
photostability by exposure to UV rays
图3 可见光照射下表面活性剂对猫眼草
提取物光稳定性的影响
Fig.3 Effect of surfactant on E.lunulataextract
photostability by exposure to visible light
图4 紫外线照射下光稳定剂对猫眼草
提取物光稳定性的影响
Fig.4 Effect of light stabilizers on E.lunulata
extract photostability by exposure to UV rays
V(助剂)∶V(样品)=1∶1 000加入到样品溶液
中,考察其对猫眼草提取物光稳定性的影响。由
图4和图5可知,3种光稳定剂均能一定程度提
高猫眼草提取物的光稳定性,以水杨酸苯酯的增
效作用最强,对氨基苯甲酸次之,8-羟基喹啉的
最弱。
图5 可见光照射下光稳定剂对猫眼草
提取物光稳定性的影响
Fig.5 Effect of light stabilizers on E.lunulataextract
photostability by exposure to visible light
3 小结与讨论
本试验采用α-脱氧核糖法、邻苯三酚自氧化
法、DPPH自由基清除法和铁氰化钾还原法对鄂
西北产猫眼草提取物进行初步体外抗氧化性测
定,结果显示猫眼草提取物具有较强的抗氧化性。
对羟自由基、氧自由基、DPPH自由基的清除率随
提取物质量浓度的增高而上升,在设置的最高质
量浓 度 时,分 别 达 到 82.04%、87.99% 和
87.73%。对铁氰化钾的还原能力随着提取物的
质量浓度的增高有上升的趋势,但在设置的质量
浓度4g·L-1以后,还原能力随着提取物质量浓
度的增高开始下降。
此外,以 MaoyancaosuⅠ为示踪标定物,在
紫外光和可见光照射下分别考察各种表面活性
剂、光稳定剂对猫眼草提取物光稳定性的影响。
从试验结果可明显看出,猫眼草提取物中猫眼草
素很不稳定,随着光照时间的延长,猫眼草素的含
量在不断降低,24h后空白对照组的光解率达到
75.67%(紫外线)和65.99%(可见光)。供试的
3种表面活性剂中 Tween-20和 Tween-80均对
猫眼草提取物具有一定的光稳定增效作用,且前
者的作用要强于后者。Span-80能加速猫眼草提
取物的光解;供试的3种光稳定剂均能一定程度
提高猫眼草提取物的光稳定性,以水杨酸苯酯的
·041· 西 北 农 业 学 报                  21卷
增效作用最强,对氨基苯甲酸次之,8-羟基喹啉的
最弱。
室内测定结果表明,猫眼草对一些害虫和植
物病原微生物具有显著的抑制作用,具有潜在的
植物性农药开发前景。因此,考察其体外抗氧化
性及光稳定性具有积极意义。然而,本试验的研
究对象———猫眼草提取物是由多种成分组成的混
合物,究竟是哪一种或几种成分在上述测试中起
作用?这些组分之间存在怎样的互作关系?同
时,本试验仅对猫眼草无水乙醇提取物进行了测
试,那么除了无水乙醇以外,猫眼草的其他极性部
位提取物的体外抗氧化性及光稳定性又是如何?
等等。这些均有待进一步研究。此外,本试验仅
分别考察了3种表面活性剂和光稳定剂,下一步
应继续扩大试剂选择面,通过设计正交试验,兼顾
生产成本和环保考虑,筛选出合适的生物农药
助剂。
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