全 文 ：重组葎草花粉主要变应原免疫特性研究
吴媛媛，孙秀珍，李满祥，刘 昀，王贵佐，卢家美
西安交通大学医学院第二附属医院呼吸病研究所，陕西 西安 710004
收稿日期：2012-05-17
基金项目：国家自然科学基金（30371336）
Supported by National Natural Science Foundation of China (30371336).
作者简介：吴媛媛，在读博士研究生，E-mail: yuan.11120929@stu.xjtu.
edu.cn
通讯作者：孙秀珍，教授，E-mail: doc-ly@sohu.com
吸入致敏花粉是诱发变应性哮喘及其他呼吸道变
态反应性疾病最重要的因素，葎草花粉是国内夏秋季花
粉症的重要致敏原之一［1］。特异性免疫治疗（SIT）是唯
一针对病因、可以改变变态反应性疾病进程的治疗方
法，成功的SIT可以调节哮喘外周血中Th1/Th2平衡。
目前临床上主要用粗提变应原进行SIT，但粗提变应原
除含有致敏组分外，还有次要组分及与抗原无关的组
分，用于SIT可导致毒副作用。基因重组变应原已被证
实可以显著提高变态反应性疾病的特异性诊断率和SIT
的疗效［2-3］。本研究拟在此基础上，在动物水平验证重组
表达的葎草花粉主要变应原pTSX2的免疫学特性及初步
摘要：目的 鉴定重组葎草花粉主要变应原pTSX2的免疫特性，并初步评价其安全性。方法 应用Western blotting鉴定pTSX2
的免疫特性；ELISA法检测经pTSX2免疫的小鼠血清sIgE、sIgG水平；pTSX2免疫治疗小鼠哮喘模型后：ELISA法测定小鼠血
清sIgE、sIgG水平；计数小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中细胞总数及嗜酸性粒细胞（Eos）比值；ELISA法检测小鼠BALF中及
脾组织匀浆中细胞因子（IL-4、IFN-γ）水平；评价小鼠肺组织炎症程度。结果 Western blotting结果显示重组表达的pTSX2可与
70%的葎草花粉特异性过敏的变应性哮喘患者血清发生抗原抗体反应；pTSX2免疫正常小鼠后主要诱导产生血清sIgG；pTSX2
免疫治疗小鼠哮喘模型后：血清中 sIgE、sIgG的抗体水平分别为（146.74±28.57）和（548.76±11.98）μg/ml，与哮喘模型组的
（603.06±10.00）和（260.32±6.40）μg/ml相比差异有统计学意义（P<0.05）；BALF中细胞总数及Eos百分比与哮喘模型组相比明
显下降（P<0.05）；BALF 中 IL-4、IFN-γ水平分别为（56.74±28.57）和（49.7±11.98）pg/ml，与哮喘模型组的（89.03±10.00）和
（23.10±6.40）pg/ml相比差异有统计学意义（P<0.05）；脾组织匀浆中 IL-4、IFN-γ水平分别为（126.24±37.00）和（1547.72±490.43）
pg/ml，与哮喘模型组的（457.95±70.06）和（720.34±93.96）pg/ml相比差异有统计学意义（P<0.05）；肺组织炎症程度减轻。结论
重组葎草花粉主要变应原pTSX2具有较好的免疫治疗作用，且安全性较高，其机制可能是抑制变应原 sIgE抗体、诱导变应原
sIgG抗体产生，降低气道炎症细胞浸润，调节Thl/Ih2平衡。
关键词：支气管哮喘；葎草花粉变应原；重组变应原；特异性免疫治疗
中图分类号：R392 文献标志码：A 文章编号：1673-4254（2012）10-1431-04
doi: 10.3969/j.issn.1673-4254.2012.10.010 http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1627.R.20121012.2117.026.html
Abstract: Objective To identify the immunological characteristics of the recombinant major pollen allergen pTSX2 of Humulus
scandens and evaluate its safety in immunotherapy of allergic asthma in mice. Methods Western blotting was used to
characterize the immunological properties of pTSX2, and its immunogenicity in normal mice was evaluated by detecting sIgG
and sIgE levels. The mouse models of allergic asthma were immunized with pTSX2 and examined for sIgE and sIgG levels,
total cells and eosinophils percentage in BALF, interleukin-4 (IL-4) and interferon-γ (IFN-γ) levels in BALF and spleen
homogenate, and changes in lung pathologies. Results Western blotting showed that pTSX2 reacted with the majority (about
70% ) of sera from patients allergic to Humulus pollen. In normal mice, pTSX2 mainly induced the production of sIgG. In
mouse models of allergic asthma, intervention with pTSX2 caused a significant reduction of sIgE and an increase of sIgG (P<
0.05), significantly decreased the total cells and eosinophils in BALF (P<0.05), obviously lowered IL-4 but increased IFN-γ in
BALF and spleen homogenate (P<0.05), and diminished inflammatory cell infiltration and percentage of eosinophils in the
lung tissues. Conclusion pTSX2 shows a definite therapeutic effect and safety in the treatment of allergic asthma in mice
possibly by inhibiting sIgE and inducing sIgG production, suppressing airway allergic inflammation and regulating the
balance between Thl and Th2.
Key words: bronchial asthma; humulus pollen allergen; recombinant allergen; specific immunotherapy
基础研究
Immunological characteristics of the recombinant major pollen allergen pTSX2 of
Humulus scandens
WU Yuanyuan, SUN Xiuzhen, LI Manxiang, LIU Yun, WANG Guizuo, LU Jiamei
Institute of Respiratory Diseases, Second Affiliated Hospital of Xian Jiaotong University College of Medicine, Xian 710004, China
2012;32(10) 南方医科大学学报（J South Med Univ） ··1431
评价其安全性。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 对象 4~5周龄雌性BALB/C小鼠（SPF级），体质
量16~19 g，由西安交通大学医学院动物实验中心提供。
1.1.2 主要试剂 重组葎草花粉主要变应原pTSX2由本
课题组实验室保存，血清标本取自就诊于西安交通大学
医学院第二附属医院呼吸科的葎草花粉变应性哮喘患
者。sIgE、sIgG、IL-4及 IFN-γ ELISA试剂盒均购自美
国R&D公司。
1.2 方法
1.2.1 Western blotting鉴定重组葎草花粉主要变应原
pTSX2 的免疫特性 pTSX2行SDS-PAGE，再转移到
PVDF膜上，转移条件为0.20 A、1 h，用16份葎草花粉变
应性哮喘患者血清（编号为 1-16）分别作一抗，行
Western blotting实验。
1.2.2 pTSX2免疫正常小鼠鉴定其免疫原性 30只4~5
周龄雌性BALB/C小鼠，随机分为正常对照组（A组）、
粗提葎草花粉变应原免疫组（B组）、pTSX2免疫组（C
组），每组10只。C组用pTSX2 300 μg+等体积的弗氏
完全佐剂予小鼠颈背部皮下多点注射免疫第1次；1周
后用pTSX2 300 μg+等体积的弗氏不完全佐剂予小鼠
颈背部皮下多点注射强化免疫，隔周1次，共强化3次。
A组用生理盐水代替，B组用粗提葎草花粉变应原，方法
及剂量同C组。末次免疫后2周，摘眼球采血，离心取
上清，测血清总 sIgE、sIgG浓度（按试剂盒内附说明书
操作）。
1.2.3 初步评价pTSX2的安全性 观察免疫治疗期间及
免疫治疗结束后2周内（共9周）小鼠哮喘模型的表现：
有无过敏反应，小鼠精神状态及饮食情况，有无毛发脱
落、瞎眼等症状，观察肺脏及脾脏色泽及形态是否正常，
肺组织病理HE染色镜检有无充血、出血、水肿等。
1.2.4 pTSX2免疫小鼠哮喘模型鉴定其免疫治疗作用
1.2.4.1 实验对象及分组 36只雌性BALB/c随机等分
为空白对照组（A组）、哮喘模型组（B组）和pTSX2免疫
治疗组（C组）。根据本课题组的方法构建小鼠哮喘模
型［4］，3组小鼠均予粗提葎草花粉变应原50 μl/只连续滴
鼻激发5 d，1次/d。小鼠被激发后2周，C组用pTSX2
300 μg予小鼠颈背部皮下多点注射，A、B组用生理盐水
代替，隔天1次，共7次。免疫治疗结束后2周，3组小
鼠均用粗提葎草花粉变应原 50 μl/只再次滴鼻激发，
共5次。
1.2.4.2 免疫保护作用的评价指标
1.2.4.2.1 症状 观察空白对照组（A组）、哮喘模型组（B
组）和pTSX2免疫治疗组（C组）3组小鼠免疫治疗后，再
次予粗提葎草花粉变应原激发后的表现：有无烦躁不
安、抓耳挠腮、呼吸加快加深甚至大小便失常等哮喘急
性发作时的表现。
1.2.4.2.2 小鼠血清sIgE、sIgG水平 最后一次激发24 h
后，用0.5%戊巴比妥钠0.1 ml腹腔注射麻醉小鼠，然后
摘眼球取血，离心取上清，用ELISA法测定血清 sIgE、
sIgG水平（按试剂盒内附说明书操作）。
1.2.4.2.3 小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中细胞计数
及细胞因子 固定小鼠，行右主支气管插管，缓慢推入预
冷的PBS液 l ml，反复抽吸3次，收集BALF约0.8 ml。
BALF 经 4 ℃、800 r/min 离心 5 min，留取上清保存
在-70 ℃冰箱中，测 IL-4、IFN-γ水平；取沉淀细胞，用
1 ml PBS重悬细胞，用细胞计数板计数细胞总数，取
0.02 ml PBS重悬液用嗜酸细胞计数液做Eos绝对值
计数。
1.2.4.2.4 小鼠脾组织匀浆IL-4、IFN-γ水平 取脾，称质
量，剪成碎片，置于玻璃匀浆器中，按0.2 mg/μl比例加
入RIPA裂解液，研磨使组织匀浆化，4℃离心，取上清保
存于-70℃冰箱中，测IL-4、IFN-γ水平（按试剂盒内附说
明书操作）。
1.2.4.2.5 小鼠肺组织HE染色 取小鼠左肺组织，石蜡
包埋，切片用10%甲醛固定，HE染色，光学显微镜下观
察血管周围和气道周围炎性细胞浸润、上皮损伤、组织
水肿情况。
1.3 统计学分析
应用SPSS 16.0进行统计学处理，实验数据以均
数±标准差表示，采用单因素方差分析，P<0.05时认为
差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 Western blotting
16张Western blotting胶片中11张（编号为3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13）可见清晰的显色条带（图1），说
明pTSX2可与11份血清发生抗原抗体反应，提示该重
组变应原具有抗原性。
2.2 pTSX2具有免疫原性
粗提葎草花粉变应原免疫组（B组）小鼠其血清sIgE、
sIgG抗体分别为（89.03±10.0）和（23.10±6.40）μg/ml，
明显高于正常对照组（A组）血清 sIgE、sIgG抗体水平
［分别为（25.19±10.14）和（8.61±1.77）μg/ml，P<0.05）；
pTSX2免疫组（C组）小鼠血清sIgE抗体水平为（46.74±
18.57）μg/ml，与粗提变应原免疫组（B组）的（89.03±
10.0）μg/ml相比具有显著性差异（P<0.05）；pTSX2免疫
组（C组）小鼠血清sIgG抗体水平为（49.77±11.98）μg/ml，
与正常对照组（A组）的（8.61±1.77）μg/ml相比具有显
著性差异（P<0.01）。上述结果表明，与粗提葎草花粉变应
南方医科大学学报（J South Med Univ） 第32卷··1432
原比较，pTSX2变应原性明显下降，具有强的免疫原性。
2.3 pTSX2具有一定的安全性
在9周的观察期间，经pTSX2免疫治疗的小鼠，精
神状态及饮食情况正常，无毛发脱落、瞎眼等症状；肺脏
及脾脏色泽及形态正常，肺组织病理HE染色，无充血、
出血、水肿等表现。初步说明该重组变应原具有一定的
安全性。
2.4 pTSX2的对小鼠哮喘模型有免疫治疗作用
2.4.1 症状 空白对照组（A组）未出现急性哮喘发作的
表现；哮喘模型组（B组）小鼠在激发后3 min内均不同
程度地出现烦躁不安、抓耳挠腮、呼吸加快加深甚至大
小便失常等哮喘急性发作时的表现；pTSX2免疫治疗组
（C组）中8的小鼠未出现急性哮喘发作的表现，其余4
只小鼠哮喘发作的时间延至5 min之后，且程度较轻，无
大小便失常。表明pTSX2可以缓解哮喘症状、预防哮
喘发作。
2.4.2 小鼠血清 sIgE、sIgG 抗体水平 哮喘模型组（B
组）小鼠其血清 sIgE、sIgG抗体水平为（603.06±10.00）
和（260.32±6.40）μg/ml，与空白对照组（A组）sIgE、sIgG
抗体水平［分别为（27.32±10.14）和（18.61±3.77）μg/ml］
相比，具有显著性差异（P<0.05）；pTSX2免疫治疗组（C
组）小鼠其血清 sIgE、sIgG抗体水平为（146.74±28.57）
和（548.76±11.98）μg/ml，与哮喘模型组（B组）比较，其
血清sIgE水平降低，sIgG抗体水平升高，具有显著性差
异（P<0.05）。表明该重组变应原可能通过诱导sIgG抗
体、抑制sIgE抗体生成，具有免疫治疗作用。
2.4.3 小鼠BALF中细胞总数和分类计数 由表1可见
重组变应原可以降低炎症细胞浸润，抑制气道炎症。
2.4.4 小鼠BALF中细胞因子水平 哮喘模型组小鼠经
pTSX2 免疫治疗后，其 BALF 中 IL-4 水平降低，而
IFN-γ水平升高，具有显著性差异（P<0.05，表2）。
2.4.5 小鼠脾组织匀浆上清细胞因子水平 哮喘模型组
小鼠经pTSX2免疫治疗后，其脾组织匀浆上清中 IL-4
水平降低，而IFN-γ水平升高，具有显著性差异（P<0.05，
表3）。
2.4.6 光镜下小鼠肺组织炎症变化 哮喘模型组（B组）
小鼠与空白对照组（A组）相比，其支气管及血管周围炎
性细胞明显浸润，以Eos、淋巴细胞和中性粒细胞为主，
还可见肥大细胞；气道上皮多处脱落，杯状细胞增多，
基底膜增厚，细支气管平滑肌增生肥大；pTSX2免疫治
疗组（C组）与哮喘模型组相比，其炎症细胞显著减少，
炎症明显减轻，上皮结构基本恢复正常。上述结果表明
pTSX2可以抑制炎症细胞，减轻炎性反应（图2）。
3 讨论
Thl/Th2 比例失衡是哮喘发病的主要免疫学机
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
图1 Western blotting检测pTSX2与血清的结合
Fig.1 Binding of the recombinant major pollen allergen pTSX2 with the sera from patients allergic to Humulus scandens detected by
Western blotting.
组别
空白对照组
哮喘模型组
重组变应原治疗组
WBC（×104/ml）
13.67±4.43▲
97.32±20.62
23.65±10.23*
Eos%
0.01±0▲
19.78±8.65
3.85±0.12*
表1 小鼠BALF中细胞总数和Eos%
Tab.1 Total cell number and percentage of eosinophil in
BALF in different groups (Mean±SD, n=12)
与模型组比较, *P<0.05, ▲P<0.01
组别
正常对照组
哮喘模型组
重组变应原治疗组
IL-4 (pg/ml)
25.19±10.14*
9.03±10.00
6.74±28.57*
IFN-γ (pg/ml)
38.61±3.77*
23.10±6.40
49.70±11.98*
表2 小鼠BALF中IL-4和IFN-γ浓度
Tab.2 Cytokine (IL-4, IFN-γ) levels in BALF in different
groups (Mean±SD, n=12)
与模型组比较, *P<0.05
组别
正常对照组
哮喘模型组
重组变应原治疗组
IL-4 (pg/ml)
212.42±25.19*
457.95±70.06
126.24±37.00*
IFN-γ (pg/ml)
1021.33±127.37*
720.34±93.96
1547.72±490.43*
表3 小鼠脾组织匀浆上清IL-4、IFN-γ浓度
Tab.3 IL-4 and IFN-γ levels in spleen homogenate in
different groups (Mean±SD, n=12)
与模型组比较, *P<0.05
吴媛媛,等.重组葎草花粉主要变应原免疫特性研究第10期 ··1433
制［6］。支气管哮喘患者外周血、支气管黏膜、支气管肺
泡灌洗液中均存在以 IL-4等细胞因子增加的Th2优势
反应［8］。IL-4可以抑制IFN-γ分泌，并且是Th2细胞转化
的必须因子［9］。IFN-γ是Th1特征性的细胞因子，它可以
抑制B淋巴细胞分泌IgE抗体［10］，IFN-γ也是Th2细胞的
负生长调控因子，抑制人的支气管上皮细胞增殖，从而
抵制Th2介导的变态反应。
本研究结果显示，正常小鼠经pTSX2免疫后，主要
诱导血清sIgG抗体产生，而产生sIgE的水平与正常对
照组无明显差别，说明该重组变应原具有较好的免疫原
性。哮喘模型组小鼠予pTSX2免疫治疗后，当小鼠再
次接触葎草花粉变应原时症状明显减轻甚至消失，气道
及血管周围炎细胞浸润程度、病理炎症级别明显降低，
血清sIgE浓度降低、sIgG浓度升高，BALF及脾组织匀
浆中 IL-4降低和 IFN-γ升高。上述结果均表明，pTSX2
可诱导sIgG抗体的生成并使IFN-γ水平升高，降低哮喘
小鼠外周血及BALF中细胞总数和嗜酸性粒细胞的数
量，抑制气道炎症细胞浸润，具有较好的免疫保护作
用。免疫治疗后的小鼠，精神状态、饮食正常，无毛发脱
落等中毒表现。小鼠肺脏及脾脏外观正常，肺组织HE
染色未见明显充血等类似于急性肺损伤的病理表现，提
示pTSX2不存在诱发免疫损伤等潜在危险性，初步验证
pTSX2的安全性。因此，重组pTSX2对葎草花粉变应性
哮喘小鼠有较好的免疫治疗作用，且具有一定的安全
性，其机制可能是诱导sIgG抗体、抑制sIgE抗体生成、
降低气道炎症细胞的浸润、调节Thl/Th2平衡。
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（编辑：黄开颜）
图2各组小鼠肺组织病理HE染色结果
A: 空白对照组; B: 哮喘模型组; C: 免疫治疗组
Fig.2 Lung pathologies in the 3 groups (HE staining, original magnification: ×200).
A B C
南方医科大学学报（J South Med Univ） 第32卷··1434