全 文 ：·研究论文·
[ 基金项目] 广东省科委重大科技攻关项目(编号 9622007 002)　[ 作者简介] 杨寿 ,男 ,学士,副主任医师 ,电话:13727839380 , E-mail:w pin g62
@126.com
半边旗二萜类化合物 5F体外抗支气管哮喘小鼠气道纤维化的作用
杨寿1 ,吴平2 ,何惠娟2 ,周爱莲3 　(1.茂名市妇幼保健院 ,广东 茂名 525000;2.广东医学院附属医院中心实验室 , 广东 湛
江 524001;3.广东医学院呼吸疾病研究所 , 广东 湛江 524001)
[ 摘要] 　目的:观察半边旗二萜类化合物 5F 对体外培养的支气管哮喘小鼠气道成纤维细胞增殖和胶原合成及结缔组织生长
因子(CTGF)表达的影响。方法:将不同浓度(8 , 32 , 128 mg·L-1)的 5F 作用于体外培养的支气管哮喘小鼠气道成纤维细胞 ,
通过噻唑蓝比色法(M TT)检测 5F 对细胞增殖的作用;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测其对细胞中 CTGF mRNA 表达水
平的影响;化学比色法检测其对细胞胶原蛋白含量的影响。结果:半边旗 5F 对支气管哮喘小鼠气道成纤维细胞的增殖具有
显著的抑制作用 ,还能显著降低胶原蛋白的含量(P <0.01);细胞中的 CTGF mRNA 的表达水平显著下调 , 并且均呈现量效
的依赖关系。结论:半边旗 5F具有体外抗支气管哮喘小鼠气道纤维化的作用 , 这为寻找有效治疗哮喘的药物提供了新的思
路。
[ 关键词] 　半边旗;二萜类;支气管哮喘;成纤维细胞;结缔组织生长因子;胶原
[中图分类号] R 563　　[文献标识码] A　　[ 文章编号] 1001-5213(2006)07-0786-03
Effects of 5F on the proliferation of airway fibroblast and the expression of CTGF and collagen
synthesis in asthmatic mice
YANG Shou
1 , WU Ping2 , HE Hui-juan2 , ZHOU Ai-lian3(1.Depar tment of Maternal and Childrens Health H ospi-
tal of Guangdong Maoming , Guangdong Maoming 52500 , China;2.The Central Labo rato ry of The A ffilia ted Hospital of
Guangdong Medical Co lleg e , Guangdong Zhanjiang 524001 , China;3.The Institute o f Respirato ry Disease o f Guangdong Medical
Co llege Zhanjiang , Guangdong Zhanjiang 524001 , China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To obse rve the effect of 5F on the collagen synthe sis and the expression of CTGF in asthmatic mice
of airway fibroblast cultured in v itro.METHODS　Different concentrations of 5F(8 , 32 , 128 mg·L -1)we re used to treat the
cells.Thiazole bule colo rimerg was used to de tect the effect o f 5F on cell pro liferation;RT-PCR to de tect the expr ession of CT-
GF mRNA;Chemical colo rir netr y to detect the content of collag en pro tein of cells.RESULTS　There w ere significant depress
function of 5F on cell pro life ration and the content of collag en protein w as depressed significantly to o(P<0.01).The expres-
sion of CTGF mRNA depre ssed strikingly and bo th showed the dependent rela tion w ith do se.CONCLUSION　I t show s that 5F
has the function o f antifibro sis in vitro , w hich pro vides a new way of finding effectiv e drug for asthma.
KEY WORDS:pe ris semipinnata L;dite rpeniod;asthma;fibroblasts;connective tissue g row th facto r;co llagen
　　慢性气道炎症 、气道重塑是哮喘的两个主要特
点 ,而气道重塑主要表现为气道平滑肌细胞 、成纤维
细胞(fibroblast , FB)的增生和大量细胞外基质的
沉积 ,而 FB 是气道黏膜下主要结构细胞之一 。近
年来的研究发现 ,结缔组织生长因子(connective
tissues g row th facto r , CTGF)是转化生长因子
(t ransfo rming g row th factor β , TGF-β)发挥生物效
应的下游因子 ,对纤维细胞的分化增生及细胞外基
质的合成和降解具有很强的调控作用 ,其在各种类
型的纤维化疾病中的过度异常表达可能是引起组织
纤维化的重要机制之一[ 1 ～ 3] 。半边旗是凤尾蕨科凤
尾属植物 ,产于四川及长江以南各省 ,民间用于治疗
蛇伤 、外伤出血 、菌痢和肝炎等 ,梁念慈教授所领导
的课题组经过多年的研究发现 ,半边旗中的有效成
分二萜类化合物 5F [化学名为:11α-羟基-15-氧-16-
烯-对映贝壳杉烷-19酸(ent-11alpha-hydroxy-15-oxo-
kaur-16-en-19-oic acid),简称 5F] ,具有显著的体内
外抗肿瘤活性 ,并且不良作用小[ 4.5] ,但目前它对哮
喘的治疗作用机制的研究尚鲜有报道 。本研究通过
建立小鼠哮喘模型 ,提取其 FB作体外原代培养 ,选
用不同浓度的半边旗 5F 对细胞作用的影响 ,并初
步探讨半边旗 5F 对 FN 的增殖 、CTGFmRNA 和胶
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原合成的影响及其可能的机制 ,以期为下一步寻找
治疗哮喘的有效药物提供实验依据 。
1　材料和方法
1.1　材料　半边旗 5F(广东医学院生物化学与分
子生物学研究所梁念慈教授提供);Trizol RN A 提
取液 、SuperScript TM First-Strand Synthesis Sy stem
fo r RT-PCR 试剂盒 、Tag DN A 聚合酶 、Marker 、
Dulbeccos M odified Eag le M edium(DMEM)培养
基 、胰蛋白酶(均购自 Gibco 公司);胎牛血清[ (Fe-
tal Calf Serum FBS)为杭州四季青生物制品公司产
品] ;二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑蓝(MT T)
(Sigma 公司产品);羟脯氨酸测定试剂盒(南京建成
生物工程研究所);引物 CTGF :上游 5 -AAC TA T
GA T TAG AGC CAA CTG CCT G-3 ,下游 5 -
TCA TGC CAT G TC TCC G TA CA T CT T C-3 ,
用这对引物可扩增出长度为 475 bp 的 CTGF cD-
NA 片段;内参照 β-actin:上游 5 -CCG CGA GAA
GA T GAC CCA GAT -3 , 下游 5 -GAA GCA
T TT GCG G TG GAC GA -3 ,用这对引物可扩增
出长度为 781bp 的 β-act in cDNA片段 ,引物均由上
海生工生物工程技术服务有限公司合成 。
1.2　方法
1.2.1　标本来源及细胞培养[ 6.7] 　建立小鼠哮喘
模型 ,然后无菌取出支气管 ,经局部处理后剪成小组
织块(<1 mm 3);利用贴壁法培养细胞 ,利用时差法
将平滑肌细胞除去 , 经细胞形态学及细胞免疫组化
方法(抗Ⅲ型胶原抗体阳性 、抗波形丝蛋白抗体阳
性 、抗α肌动蛋白抗体阴性)鉴定 ,证实为成纤维细
胞 ,实验选用第 4 ～ 9代细胞。
1.2.2　MT T 测定不同浓度 5F 对 FB 增殖的影
响[ 8] 　取对数生长期的成纤维细胞用0.25%胰蛋白
酶消化后 ,将细胞以 1×108·L-1密度接种于 96 孔
培养板中 ,每孔 200 μL ,于37 ℃、5%CO 2孵箱中培
养 24 h ,更换 10%FBS DMEM 培养基并加入 5F ,
使药物终浓度分别为 0 ,8 , 16 ,32 ,64 ,128 mg·L -1 ,
每一浓度重复 6孔 。 37 ℃、5%CO 2孵箱培养 24 h
后 ,每孔加入 MT T(5 g·L-1)20 μL ,继续培养 4 h ,
吸去培养液 ,每孔加入 DMSO 100 μL ,于微量振荡
器上振荡 10 min ,待紫色结晶完全溶解后 ,立即用
酶联免疫测定仪(美国 BioRad550型)测定 570 nm
处的吸收度值 A 。求出增殖抑制率(IR%)。
1.2.3　RT-PCR法检测 5F 对 FB CTGF mRNA
表达的影响
(1)细胞总 RNA 的提取　用 PBS 洗涤实验各
组细胞 ,在培养瓶中加 TrizolRNA提取液提取细胞
总 RNA 。制备的细胞总 RNA 用紫外分光光度计
测定读数 A 260/A 280为1.8 ～ 2.0 ,调整 RNA 浓度
为 1 g·L-1后即作 RT-PCR反应。
(2)RT-PCR 及 PCR 产物半定量分析　RT-
PCR反应采用 RT-PCR试剂盒按说明书严格进行
操作 ,细胞总 RNA反应量均为 4 μg ,总反应体积为
50 μL 。反应条件:(1)cDNA 的合成和预变性:
42 ℃, 50 min , 94 ℃ 3 min;(2)PCR扩增:94 ℃ 45
s , 55 ℃45 s , 72 ℃1 min共 28个循环 ,循环完毕后
72 ℃延伸 7 min 。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电
泳 ,稳压电泳 5 V/cm 约1.5 h , 0.5 mg·L-1溴乙锭
染色 20 min后 ,紫外灯观察 、拍照。在 UVP 凝胶成
像系统中扫描 ,并分析电泳带灰度。以特异性 CT-
GF 扩增带灰度与 β-actin 扩增带灰度之比 ,即表示
CTGF mRNA表达量 。
1.2.4　半边旗 5F 对 FB胶原蛋白合成的影响　将
细胞接种于 24孔培养板 ,细胞密度 5×104/孔 ,每
孔加入 1 mL 培养基 。接种 48 h 后更换培养基 ,同
时加入不同浓度 5F ,每一浓度设计 4个平行孔。药
物作用 48 h ,从每孔各吸取0.5 mL 培养基 ,按羟脯
氨酸检测试剂盒说明书方法测定培养基中羟脯氨酸
的含量。用酶标仪 540 nm 检测 A 值 ,样品中羟脯
氨酸浓度(mg·L-1)=测定管 A 值×标准管浓度/
标准液 A 值;样品中胶原浓度=羟脯氨酸浓度×
7.46×稀释倍数(7.46是从羟脯氨酸换算为胶原时
的计算常数)。
1.3　统计学处理　用 SPSS11.0统计软件进行统
计分析。数据以均数±标准差( x ±s)表示 ,采用单
因素方差分析后 ,多个实验组和对照组比较用最小
显著差法(LSD法)检验 , P <0.05差异有统计学意
义。
2　结果
2.1　半边旗 5F 对 FB增殖的抑制作用　不同浓度
的半边旗 5F 0 ,8 , 16 ,32 ,64 ,128 mg·L -1分别处理
细胞后 ,对细胞的增殖抑制作用呈明显的剂量和时
间依赖性(两者呈正相关 ,24 ,48 , 72 h 的 r 值分别是
0.994 ,0.929 ,0.878)与对照组相比 ,差异具极显著
性(P<0.01)。结果见表 1。
2.2　半边旗 5F 对 FB CTGF mRNA 表达的作用
　RT-PCR 产物电泳结果显示 ,各组细胞 CTGF
mRNA 在 475 bp和 781 bp位置上均出现特异性条
带 ,与预期扩增片断的长度相符 。半边旗 5F 不同
药物浓度组 0 , 8 , 32 , 128 mg·L -1处理细胞 24 h
后 , 均可以抑制 CTGF mRNA 的表达 , 其 CTGF
mRNA表达量随着半边旗5 F作用浓度增加而减
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表 1　不同浓度的半边旗 5F 作用不同时间对 FB 增殖的影
响( x±s , n=6)
Tab 1　Effect o f 5F with diffe rent concentration and time on
prolifera tion in FB( x±s , n=6)
C/mg·L -1 24 h IR/ % 48 h I R/ % 72 h IR/ %
8 5.7±0.5 10.2±0.7 13.4±0.9
16 10.8±1.1 29.1±0.8 32.1±1.4
32 19.3±1.3 47.2±1.1 52.3±3.8
64 36.2±2.9 79.3±1.3 82.6±2.1
128 59.7±3.3 92.6±1.9 84.5±1.6
注:与对照组相比 , P <0.01
少 ,与对照组相比差异具显著性(P<0.05)。
2.3　半边旗 5F 对 FB胶原蛋白合成的作用　结果
由表 2可见半边旗 5F 0 ,8 ,32 , 128 mg·L-1对 FB 胶
原蛋白合成有显著的抑制作用 ,随着用药浓度增加 ,
细胞的羟脯氨酸 、胶原蛋白含量逐渐减少 ,与对照组
相比 ,差异有极显著性(P<0.01)。
表 2　不同浓度半边旗 5F 对 FB 胶原蛋白的影响( x±s , n=
6)
Tab 2　Effects o f 5F with different concentra tion on collagen
in FB( x ±s , n=6)
C/mg·L -1 羟脯氨酸/mg·L -1 胶原蛋白/mg·L-1
0 2.20±0.09 16.4±0.5
8 1.91±0.06 14.2±0.5a
32 1.64±0.13 12.2±0.3b
128 0.97±0.02 7.2±0.5b
注:与对照组相比 , a P<0.05 , bP<0.01
3　讨论
FB是气道黏膜下的主要结构细胞之一 ,具有合
成和降解 ECM 的双重功能;在气道黏膜下增殖和
积聚使气道壁增厚 、管腔狭窄;并且 FB 产生的胶
原 、弹性和网状纤维等沉积于基底膜可限制管腔扩
张 ,增强气道高反应性 , 加重哮喘症状 。因此 , FB
增生在慢性支气管哮喘发展机制中占据重要的地
位。因此研究 FB增生的影响因素及寻求抑制其增
生的途径将是防治哮喘的新方向。CTGF 是一新
近发现的细胞因子 , 可由成纤维细胞等细胞分泌 。
研究发现 ,在 CTGF 启动子序列 128 ～ 162位置上
存在着一个重要的 TGFβ1调控元件 ,其点突变可以
导致 TGFβ1 活性完全丧失 , 故认为 CTGF 是
TGFβ1致纤维化作用的直接下游效应介质[ 9] 。根
据CTGF 及其作用的部位不同 ,它可显示出不同的
生物学效应 ,但主要表现为促有丝分裂作用 、趋化细
胞 、诱导细胞粘附 、促进细胞增殖 、促进肉芽组织形
成和纤维化以及参与细胞外基质产生 、积聚等功能 。
在肾 、肺 、心肌纤维化等病变均有高表达。叶旭军
等[ 3]用原位杂交的方法发现在博莱霉素诱导的小鼠
肺纤维化中有高水平的 CTGFmRNA 表达 , 表明
CTGF 可能参与了肺纤维化的形成和发展。
研究表明 ,半边旗 5F 在一定浓度范围内可以
抑制体外培养的 FB 的增殖和胶原合成 ,当药物浓
度高于 8 mg·L -1时 ,细胞呈现抑制状态 ,随药物浓
度增高 ,作用效果愈明显 , 药物浓度在 16 ～ 128 mg
·L-1时 ,与对照组相比 ,细胞抑制率呈显著性增加
(P<0.01),验证半边旗 5F 对细胞呈剂量依赖性抑
制。为进一步证明半边旗 5F 抑制 FB 胶原合成的
作用是由于其有效抑制了 FB 内 CTGF 的基因转
录 ,用 RT-PCR技术检测了 FB中 CTGF mRNA 的
表达 ,结果表明 ,半边旗 5F 在一定浓度范围内 8 ～
128 mg·L-1可以使体外培养的 FB 中 CTGF mR-
NA 的表达水平下调 ,提示半边旗 5F 对 FB的抑制
作用可能是从下调 CTGF mRNA 转录来实现。这
表明了半边旗 5F 具有抗慢性哮喘气道的纤维化作
用 ,该发现为进一步探索其对慢性哮喘气道的纤维
化的防治作用和作用机制提供了实验依据 ,并且提
示半边旗 5F 有可能成为抗慢性哮喘气道纤维化的
可行药物 。至于其具体确切的作用机制和疗效仍有
待进一步深入的实验验证。
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[收稿日期] 2005-11-23
·788· 中国医院药学杂志 2006年第 26卷第 7期 C hin Hosp Pharm J , 2006 Jul , Vol 26 , No.07