全 文 ：第32卷第2期
2 0 1 1年 3月
西 安 交 通 大 学 学 报 (医 学 版 )
Journal of Xian Jiaotong University(Medical Sciences)
Vol.32 No.2
Mar.2011
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葎草花粉主要变应原核酸疫苗 pcDNA3.1-LC2的
真核细胞表达和免疫分析
卢家美 ,孙秀珍 ,李满祥 ,刘 昀 ,徐 晶 ,张永红 ,吴媛媛
(西安交通大学医学院第二附属医院呼吸内科 , 陕西西安 710004)
摘要:目的 验证葎草花粉主要变应原核酸疫苗(pcDNA3.1-LC2)能否在真核细胞内表达 , 并进行免疫原性 、免疫保
护作用 、安全性等分析。方法 应用磷酸钙沉淀法将 pcDNA3.1-LC2 转染至 HEK293 细胞 , 提取 RNA 并行 RT-
PCR ,利用琼脂糖凝胶电泳分离 PCR产物 , 验证所分离出的条带与目的片段是否一致;应用pcDNA3.1-LC2 免疫正常
小鼠 , ELISA 方法测定血清中 IgG 、IgE 浓度和脾组织匀浆中 IL-4、IFN-γ浓度;制备葎草花粉变应性哮喘小鼠模型 ,应
用 pcDNA3.1-LC2对葎草花粉变应性哮喘模型小鼠进行免疫治疗 , 行肺泡灌洗液沉渣细胞计数 , 肺泡灌洗液沉渣滴
片瑞士染色并嗜酸性粒细胞分类计数;取左肺上叶行肺脏病理 HE 染色 , ELIS A 方法测定肺泡灌洗液中 IL-4、IFN-γ
浓度 ,并测定血清中 I gG 、IgE 浓度。结果 琼脂糖凝胶电泳分离 PCR 产物 , 于 750 bp 处分离出一明显的条带 , 与目
的片段一致;采用 pcDNA3.1-LC2 免疫正常小鼠后 , 血清 IgG 浓度升高 , IgE 浓度无明显变化 , 脾组织匀浆中 IL-4 浓
度降低 , IFN-γ浓度升高;免疫过程中未引起过敏反应 、免疫损伤及急性肺损伤;应用该核酸疫苗免疫葎草花粉变应性
哮喘小鼠模型 ,可明显降低气道炎症级别 、减轻炎症细胞浸润 、降低嗜酸性粒细胞百分比 ,引起血清中 IgG 浓度升高和
IgE浓度降低 ,肺泡灌洗液中 IL-4浓度降低和 IFN-γ浓度升高 ,再次激发时哮喘症状明显减轻。结论 pcDNA3.1-LC2
可在真核细胞内表达 ,诱导 TH1/ TH2 平衡向 TH1 方向转化 , 具有免疫原性及免疫保护作用 ,安全性较好 。
关键词:支气管哮喘;葎草花粉变应原;核酸疫苗;真核表达;免疫原性
中图分类号:R562.1 文献标志码:A 文章编号:1671-8259(2011)02-0155-06
Eukaryotic expression and immunization analysis of the DNA vaccine of
the major grass pollen allergen of humulus scandens
LU Jia-mei , SUN Xiu-zhen , LI Man-xiang , LIU Yun , XU Jing ,
ZHANG Yong-hong , WU Yuan-yuan
(Department of Respiratory Medicine , the Second Affiliated Hospi tal ,
Medical School o f Xian Jiaotong Univ ersity , Xian 710004 , China)
ABSTRACT:Object ive To test whether the DNA vaccine of the major gr ass pollen allergen of humulus
scandens(pcDNA3.1-LC2)can be expressed in eukaryatic cells and to fur ther analyze its immunogenicity , immune
protection and saf ety.Methods HEK293 cells were transfected with the DNA vaccine of the ma jor gr ass pollen
allergen of humulus scandens using Ca3(PO4)2.RNA was extr acted and used for RT-PCR.Products of PCR were
separ ated on agarose gel electr ophoresis.The normal BALB/C mice were immunized with the DNA vaccine.The
concentr ation of IgG , I gE , IL-4 and IFN-γwas measur ed.BALB/C mice of asthma model were immunized with the
DNA vaccine.Lung pathology and BALF cell sedimen t drop f ilms were advanced;cell count and diff erential count
of eosinophils were conduc ted , too.The concentr ation of IL-4 and IFN-γ in the BALF was measur ed.The
concentr ation of IgG and IgE in the serum was measur ed a t the same time.Results Our study showed a cle ar str ip
at 750 bp and confirmed the expression of the DNA vaccine of the ma jor gr ass pollen allergen of humulus scandens in
eukaryotic cells using agarose gel electr ophoresis.The normal m ice could produce IgG rather than IgE after be ing
immunized with the DNA vaccine , which suggested the immunogenicity of it.At the same time , IFN-γ
concentr ation increased and IL-4 concentr ation decr eased.Allergic r eactions , immune injury and acute lung injury
were not caused in the immune process , which suggested tha t the potential injury r isk of the DNA vaccine did not
收稿日期:2010-07-23 修回日期:2010-09-17
基金项目:国家自然科学基金资助项目(No.30772010)
Supported by the Nat ion al Natur al Science Foundat ion of Ch ina(No.30772010)
通讯作者:孙秀珍 ,教授.E-mail:doc-ly@soh u.com
作者简介:卢家美 ,(1980-),女(汉族),博士.研究方向:哮喘的特异性治疗与免疫机制研究.E-mail:lu-jia1980@163.com
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exist.I t c aused the following changes a fter the model of asthma of BALB/C mice be ing immunized with the DNA
vaccine:Levels of lung inflamma tion and inf iltr ation of inf lammatory cells and the percentage of eosinophils were
signif icantly reduced.The gener ation of IL-4 and IgE was inhibited and the gener ation of IgG and IFN-γwas evoked
signif icantly.The symptoms were r elieved greatly if the mice were excited again af te r being immunized with the
DNA vacc ine.Conclusion The DNA vaccine of the major gr ass pollen allergen of humulus sc andens can be
successfully expressed in eukaryotic cells.I t c an induce the TH1/ TH2 balance to the tr ansformation of TH1
direc tion.I t has proved to have immunogenicity , immune protection and sa fety.
KEYWORDS:bronchial asthma;humulus scandens gr ass pollen allergen;DNA vaccine;eukaryotic expression;
immunogenicity
支气管哮喘(bronchial asthma)简称哮喘 ,是主
要变态反应性疾病之一。目前全世界约有 3亿人罹
患哮喘[ 1] ,且其发病率和死亡率呈明显上升的趋势 ,
是危害公共健康的重要问题之一 。花粉是哮喘的主
要变应原之一 , 而葎草花粉是夏秋季的主要变应
原[ 2] 。特异性免疫治疗是唯一针对病因的治疗方
法[ 3] ,但粗制变应原成分复杂 ,用于诊断及治疗时安
全性较差 。因此 ,变应原核酸疫苗成为目前的研究热
点。本课题组已经成功构建了葎草花粉主要变应原
核酸疫苗 pcDNA3.1-LC2 , 并初步证实其具有免疫
活性[ 4] 。本研究将针对 pcDNA3.1-LC2能否在真核
细胞内表达目的基因 ,是否具有较强的免疫原性和免
疫保护作用 ,安全性如何等进行深入的研究。
1 材料与方法
1.1 细胞株 人胚肾 HEK293细胞系购自西安沃
尔森生物科技有限公司。
1.2 主要试剂 Fast filter Endo-Free Plasmid Maxi
Ki t(D6926-03)25 preps购自美国E.Z .N.A 公司;磷
酸钙法细胞转染试剂盒购自上海奔大生物科技有限
公司;T rizol试剂盒购自美国 BioBasic 公司;SYBR
PrimeScript TM RT-PCR Kit Ⅱ购自日本 TaKaRa 公
司;小鼠 IFN-γ、IL-4 、IgG 、IgE ELISA 试剂盒购自美
国 R&D公司;葎草花粉变应原提取液由本实验室自
行制备。
1.3 实验动物 4 ～ 6周龄雌性 BA LB/C小鼠 ,体重
(18±2)g ,购于西安交通大学医学院实验动物中心 ,
并饲养于西安交通大学医学院屏障性动物房(barrie r
facili ty),符合无特定病原体(specific pathogen free
S PF)动物级别要求。
1.4 pcDNA3.1-LC2的真核细胞表达
1.4.1 pcDNA3.1-LC2的提取 将已经转化成功
的 DH5α大肠杆菌接种于 200 mL 含氨苄青霉素(50
μg/mL)的 LB培养基中(500 mL 锥形瓶内),37 ℃水
浴 180 r/min ,培养 12 ～ 16 h。参照说明书应用去内
毒素质粒大量提取试剂盒(Fast fil ter Endo-Free
Plasmid M axi Ki t)提取质粒 ,使用微量核酸/蛋白检
测仪测定 DNA 浓度及纯度(分别测定 A260和 A280)。
1.4.2 HEK293细胞的培养 采用含 100 g/L 胎牛
血清(FCS)的 DMEM 完全培养基(高糖),于 37 ℃、
50 mL/L CO 2 培养 ,每 24 h换液 1 次 ,丰度较好时 ,
可进行消化 、传代 。
1.4.3 pcDNA3.1-LC2真核细胞的转染 在 6 孔
板中接种 HEK 293细胞 5×105 cells/孔 ,培养过夜 ,
于转染前 4 ～ 6 h 换液(含 100 mL/L FCS 的完全培
养液),于细胞融合约 80%时进行转染 ,使用磷酸钙
法细胞转染试剂盒将 pcDNA3.1-LC2 转染至
HEK293细胞 ,于 37 ℃、50 mL/ L CO2 培养箱中培
养 24 h。
1.4.4 总 RNA 的提取及反转录 于转染后 24 ～
48 h弃细胞培养液 ,用 PBS(pH =7.4)漂洗细胞 3
次 ,参照说明书用 Trizol试剂盒提取细胞总 RNA ,微
量核酸/蛋白检测仪测定 RNA 的浓度及纯度(分别
测定 A260和 A280),10 g/L 普通琼脂糖凝胶电泳对所
提取 RNA 的完整性进行快速检测。使用 SYBR Pri-
meScript TM RT-PCR Kit Ⅱ(T aKaRa , Japan)试剂盒
对所提取的总 RNA 进行反转录 ,具体操作参照说明
书进行 ,将反转录产物保存于 4 ℃。
1.4.5 PCR扩增反转录产物 以 pcDNA3.1-LC2
cDNA 为模板 ,进行目的片段的扩增 , PCR扩增反转
录产物所用引物由上海生工生物科技有限公司合成 。
引物序列为:P1:A TGGGGGCT TACAAG TACG T-
TTCG;P2:TCAAATGAAACATGACTCAAGTAT 。
PCR反应体系总体积为 50μL ,具体包括:cDNA 模
板 0.5μL , P1(20 mmo l/mL)1μL , P2(20 mmo l/mL)
1 μL , rTaq Po lymerase(TaKaRa)1 μL , 10 ×rTaq
PCR Buf fer 5μL , Mg 2+ 3 μL , dN TP(10 mmol/ L
each)1μL ,ddH 2O 37.5μL 。PCR反应程序如下:预
变性 94 ℃5min ,变性 94 ℃30 s ,退火 55 ℃30 s ,延
伸72 ℃30 s , 30 个循环 ,最终延伸 72 ℃10 min ,于
4 ℃保存 。
1.4.6 琼脂糖凝胶电泳分离 PCR产物 配制 10 g/L
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普通琼脂糖凝胶 ,向待电泳分析的核酸样品中加入上
样缓冲液 ,并分别将其和 DNA参比物(Marker)轻轻
加入到样品孔中;开始电泳后可见溴酚蓝指示剂向正
极移动 ,给予 2 V/cm电压 ,指示剂迁移足够距离后 ,
关闭电源 ,取出凝胶 ,在凝胶成像系统中(紫外透射光
源下)观察结果 。
1.5 葎草花粉主要变应原核酸疫苗的免疫分析
1.5.1 葎草花粉变应原提取液的制备[ 5] 采集葎草花
粉 ,使用 10号分样筛(200目/英寸)过筛以净化花粉 ,乙
醚脱脂 ,碳酸氢钠-盐水提取法提取葎草花粉变应原 ,考
马斯亮蓝法测定蛋白浓度 ,最终调整葎草花粉变应原提
取液蛋白质质量浓度为1 mg/mL与 10mg/mL。
1.5.2 pcDN A3.1-LC2 免疫原性检验 取 4 ～ 6周
龄雌性 BA LB/C小鼠 24 只 ,随机分为核酸疫苗组 、
正常对照组 、空质粒组 ,每组 8只 ,分别进行标记 。用
7.5 g/ L布比卡因 40μL 多点肌肉注射小鼠肱四头肌。
核酸疫苗组于次日在该部位多点肌肉注射 pcDNA3.1-
LC2 100μg;正常对照组给予等体积 N.S 肌注;空质
粒组给予 100μg pcDNA3.1肌注 。于第 8天重复上
述操作。于末次免疫后第 30 天眼球采血制备血清 ,
行血清总 IgE 、IgG 浓度测定;无菌条件下取脾脏制
备脾组织匀浆 ,测定 I L-4 、IFN-γ浓度 。
1.5.3 pcDNA3.1-LC2 安全性的检验 分别对
pcDNA3.1-LC2免疫原性检验的小鼠进行观察 ,观
察期为 35 d。与正常对照组相比 ,观察核酸疫苗组肌
肉注射后有无过敏反应 ,小鼠精神状态及毛发情况 ,
有无嘴巴周围脱毛 、瞎眼等内毒素中毒症状;有无小
腿瘫痪的神经交叉免疫损伤现象发生 。处死小鼠后
观察肺脏组织有无充血 、出血 、水肿表现;镜下肺脏
HE染色有无明显充血 、出血等类似于急性肺损伤的
病理表现 。
1.5.4 葎草花粉变应性哮喘小鼠模型的制备[ 6] 取
4 ～ 6周龄雌性 BALB/C 小鼠 48 只 ,分别进行标记。
吸取新鲜配制的 40 g/L 氢氧化铝凝胶 50μL(含氢氧
化铝 2mg),并吸取定容至 1 g/L葎草花粉变应原提取
液300μL(含300μg致敏蛋白),充分混匀 ,用 1 mL注
射器腹腔注射 ,分别于第 7天 、第 14天加强致敏 ,方法
及剂量同上 。于第 22天所有小鼠给予 30μL(10 g/L)
葎草花粉变应原提取液滴鼻激发 ,每天 1次 ,连续 3 d。
1.5.5 pcDNA3.1-LC2的免疫保护作用 取已经
制备成功的葎草花粉变应性哮喘小鼠模型 48 只 ,随
机分为 6组 ,依次为:模型疫苗免疫组 、模型疫苗免疫
后再激发组 、模型空质粒组 、模型空质粒再激发组 、模
型空白组 、模型空白再激发组。取同批次的雌性
BA LB/C 小鼠 8只作为空白对照组 ,分别进行标记。
于末次激发后(从制备葎草花粉变应性哮喘小鼠模型
时最后一次激发算起)第 7天 ,模型疫苗免疫组 、模型
疫苗免疫后再激发组 ,按照上述葎草花粉核酸疫苗免
疫方法免疫小鼠;模型空质粒组 、模型空质粒再激发
组 ,使用等量 pcDNA3.1 质粒肌注;模型空白组使用
等体积N.S 肌注 。末次免疫后 30 d将模型疫苗免疫
后再激发组 、模型空质粒再激发组 、模型空白对照再
激发组进行再次激发 ,连续 3 d ,末次激发 24 h 后眼
球取血并测定血清 IgG 、IgE 浓度 。使用 PBS 液进行
肺泡灌洗 ,于 4 ℃下 1 000 r/min 离心 6 min ,收集上
清液并采用 ELISA方法分别测定 IL-4 、IFN-γ浓度 。
使用 0.5 mL 生理盐水重悬肺泡灌洗液沉渣的细胞
并进行细胞计数 ,制备重悬的肺泡灌洗液沉渣滴片并
进行瑞氏染色 ,行嗜酸性粒细胞分类计数;取肺脏行
肺脏 HE染色检查。
1.6 统计学处理 应用 SPSS13.0软件进行统计学
分析。实验数据以均数±标准差表示 ,每组数据均符
合正态性及方差齐性 ,多组数据的组间比较采用单向
方差分析(One-way A NOVA),P <0.05为差异有统
计学意义。
2 结 果
2.1 pcDNA3.1-LC2的真核细胞表达
2.1.1 提取的 pcDNA 3.1-LC2 的浓度及纯度 所
提取的 DNA 质量浓度为 1 026 ng/μL , A260/ A280为
1.83 , A260/ A230为 2.17 ,提示样品较纯净 ,符合真核
细胞转染及动物实验的要求。
2.1.2 提取的总 RNA 的浓度及纯度 所提取 pcD-
NA3.1-LC2-1和 pcDNA3.1-LC2-2的 RNA 质量浓
度分别为 820 ng/μL 、855 ng/μL , A260/ A280比值分别
为1.92和 1.96 ,表明其纯度较高 ,无蛋白质污染;
A260/A230比值分别为 2.25和 2.39 ,提示无异硫氰酸
胍盐污染。
2.1.3 总 RNA 的琼脂糖凝胶电泳 分别取 2μL
pcDNA3.1-LC2-1 和 pcDNA3.1-LC2-2 总 RNA 进
行琼脂糖凝胶电泳 , 检测 RNA 条带 。结果显示 ,
28S 、18S 、5S 条带浓度较高 ,其中 28S 浓度最高 , 18S
次之 , 28S/18S EB 的显色强度比约为 2/1 , 提示无
RNA降解(图 1)。
2.1.4 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳 取 PCR
扩增产物 5μL 进行琼脂糖凝胶电泳 ,于大致 750 bp
位置分离出清晰的目的条带 ,提示该目的基因在真核
细胞内成功表达(图 2)。
2.2 葎草花粉主要变应原核酸疫苗的免疫分析
2.2.1 葎草花粉主要变应原核酸疫苗免疫原性的检
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验 采用 pcDNA3.1-LC2 免疫正常小鼠后 30 d ,核
酸疫苗组血清 IgG 浓度高于正常对照组 ,差异具有
统计学意义(P <0.001),而血清 IgE 浓度与正常对
照组相比差异不明显(P>0.05);空质粒组血清 IgG 、
IgE浓度与正常对照组的差异不明显(P>0.05 ,表 1)。
表 1 核酸疫苗免疫后小鼠血清 IgE、IgG浓度的变化
Tab.1 Concentration of IgE and IgG in serum of mice after
immunization with the DNA vaccine (n =8 , x ±s)
分组 IgE(μg/ mL) IgG(μg/m L)
正常对照组 24.58±2.57 5.64±1.75
空质粒组 23.97±5.11 5.33±2.22
核酸疫苗组 23.45±4.55＊ 433.76±35.26＊
与正常对照组比较 , ＊P<0.001。
采用 pcDNA3.1-LC 2免疫正常小鼠后 30 d ,核
酸疫苗组脾组织匀浆中 IL-4浓度低于正常对照组 ,
而 IFN-γ浓度则高于正常对照组 ,差异均具有统计
学意义(P <0.05), ;空质粒组 IL-4 、IFN-γ浓度与正
常对照组无差异(P >0.05 ,表 2)。
pcDNA3.1-LC2可诱导小鼠产生 IgG ,而不产生
IgE ,诱导 IFN-γ分泌和减少 IL-4分泌 ,而 pcDNA3.1
无上述作用 ,提示该核酸疫苗具有较好的免疫原性。
表 2 核酸疫苗免疫后小鼠脾组织匀浆中 IL-4、IFN-γ浓度的
变化
Tab.2 Concentration o f IL-4 and IFN-γin spleen tissue ho-
mogenate s o f mice after immunization with the DNA vaccine
(n =8 , x ±s)
分 组 IL-4(pg/ mL) IFN-γ(pg/m L)
正常对照组 212.42±25.19 1 021.33±127.37
空质粒组 212.95±34.06 1 020.34±103.96
核酸疫苗组 126.24±37.00＊ 1 547.72±490.43 ＊
与正常对照组比较 , ＊P<0.05。
2.2.2 pcDNA3.1-LC2安全性的检验 与正常对
照组相比 ,用核酸疫苗肌肉注射免疫小鼠后 ,无过敏
反应出现 ,小鼠精神状态正常 ,毛发顺滑 ,无嘴巴周围
脱毛 、瞎眼等内毒素中毒症状;无小腿瘫痪的神经交
叉免疫损伤症状 ,肺脏组织无充血 、出血 、水肿表现 ,
小鼠肺脏 HE证实 ,肺组织无明显充血 、出血等类似
于急性肺损伤的病理表现 ,初步证实了 pcDNA3.1-
LC2免疫动物的安全性 。
2.2.3 pcDNA3.1-LC2的免疫保护作用 制作葎
草花粉变应性哮喘模型时 ,小鼠于激发后 3 m in开始
出现不同程度的烦躁不安 、呼吸加快加深 、点头呼吸 、
前肢缩抬 、弓背直立 、二便失禁等哮喘速发相反应表
现 ,并不停用前爪搔抓头 、鼻 、面部及躯干 ,初步判断
模型复制成功。与模型空白组小鼠相比 ,模型疫苗免
疫后再激发组小鼠再次激发时上述哮喘发作症状明
显减轻 ,半数小鼠不能诱发哮喘发作 ,其余多于激发
后 5 ～ 20 min开始出现哮喘发作症状。
使用葎草花粉主要变应原核酸疫苗免疫哮喘模
型小鼠后 ,核酸疫苗免疫组 BALF 细胞沉渣内 WBC
数量 、嗜酸性粒细胞百分比低于模型空白组 ,差异具
有统计学意义(P<0.01),模型疫苗免疫后再激发组
WBC数量 、嗜酸性粒细胞(Eos)百分比低于模型空
白再激发组 ,差异具有统计学意义(P <0.01);而模
型空质粒组与模型空白组上述指标差异不明显
(P>0.05),模型空质粒再激发组与模型空白再激发
组差异也不明显(P >0.05 ,表 3)。
使用葎草花粉主要变应原核酸疫苗免疫哮喘模
型小鼠后 ,核酸疫苗免疫组肺泡灌洗液内 IFN-γ浓
度高于模型空白组 , IL-4浓度低于模型空白组 ,其差
异具有统计学意义(P<0.05),模型疫苗免疫后再激
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发组 IFN-γ浓度高于模型空白再激发组 ,而 I L-4 浓
度低于模型空白再激发组 ,差异也具有统计学意义
(P<0.05);模型空质粒组与模型空白组上述指标差
异不明显(P>0.05),模型空质粒再激发组与模型空
白再激发组差异也不明显(P >0.05 ,表 4)。
表 3 核酸疫苗免疫模型小鼠后 BALF中 WBC及嗜酸性细
胞百分比
Tab.3 The percentage o f WBCs and eo sinophils in BALF of
mice after immunization with the DNA vaccine
(n =8 , x ±s)
分组 WBC(×104/mL) E os(%)
空白组 13.79±3.20 0.56±0.56
模型空白组 45.95±8.58 26.00±2.85
模型空质粒组 46.85±6.00 24.50±3.14
模型疫苗免疫组 30.48±3.97＊ 10.06±3.81＊
模型疫苗免疫后再激发组 38.29±2.59# 11.81±4.23#
模型空质粒再激发组 45.43±6.37 25.31±2.40
模型空白再激发组 45.42±4.39 25.25±1.96
与模型空白组比较 , ＊P <0.01;与模型空白再激发组比较 , #P <0.01。
表 4 核酸疫苗免疫模型小鼠后 BALF 中 IFN-γ、IL-4 浓度的
变化
Tab.4 Concentr ation o f IFN-γ and IL-4 in BALF of mice
after immunization with the DNA vaccine (n =8 , x ±s)
分组 IFN-γ(pg/mL) IL-4(pg/mL)
空白组 598.74±104.18 74.59±8.04
模型空白组 411.94±69.60 135.30±34.42
模型空质粒组 421.80±57.36 153.60±41.50
模型疫苗免疫组 498.62±53.65＊ 97.21±18.43＊
模型疫苗免疫后再激发组 487.51±59.09# 110.07±7.85#
模型空质粒再激发组 414.97±61.63 139.30±30.65
模型空白再激发组 417.51±55.04 141.10±34.24
与模型空白组比较 , ＊P<0.01;与模型空白再激发组比较, #P<0.01。
使用葎草花粉主要变应原核酸疫苗免疫哮喘模
型小鼠后 ,模型疫苗免疫组血清中 IgE浓度低于模型
空白组 ,而 IgG 浓度高于模型空白组 ,差异均具有统
计学意义(P<0.05);模型疫苗免疫后再激发组血清
中 IgE 浓度低于模型空白再激发组 ,而 IgG 浓度则
高于模型空白再激发组 , 差异均具有统计学意义
(P<0.05);而模型空质粒组与模型空白组上述指标
差异不明显(P >0.05),模型空质粒再激发组与模型
空白再激发组差异也不明显(P>0.05 ,表 5)。
表 5 核酸疫苗免疫模型小鼠后血清内 IgE、IgG浓度的变化
Tab.5 Concentration of I gG and IgE in BALF of mice after
immunization w ith the DNA vaccine (n =8 , x ±s)
分 组 IgG (μg/mL) IgE(μg/mL)
空白组 5.65±1.58 24.46±5.23
模型空白组 681.82±96.04 801.43±152.70
模型空质粒组 688.10±66.89 780.80±123.41
模型疫苗免疫组 1 007.18±96.79＊ 379.50±48.46＊
模型疫苗免疫后再激发组 906.23±75.92# 338.57±41.23#
模型空质粒再激发组 675.06±91.43 786.14±135.54
模型空白再激发组 692.88±71.41 775.00±122.32
与模型空白组比较 , ＊P<0.01;与模型空白再激发组比较, #P<0.01。
模型空白组小鼠小支气管 、血管黏膜下和周围肺
组织有明显的炎性细胞(以嗜酸性粒细胞 、中性粒细
胞 、淋巴细胞和巨噬细胞为主)浸润 ,大量炎性细胞向
小支气管和血管迁移 ,上皮细胞部分有脱落 ,部分可
见黏液栓 ,血管壁明显水肿 。使用核酸疫苗免疫哮喘
模型小鼠后 ,炎症浸润及上皮损害明显减轻 ,当再次
激发后 ,炎症较模型空白再激发组明显减轻 ,支气管
黏膜上皮 、黏膜肌层较完好 ,支气管管腔较规则 ,周围
炎性细胞浸润明显减轻(图 3)。
图 3 各组小鼠肺脏组织的 HE染色
Fig.3 Mouse lung patholog y stained by H E(×400)
A:正常小鼠;B:模型小鼠;C:核酸疫苗免疫后小鼠;D:核酸疫苗免疫后再次激发小鼠。
采用 pcDNA 3.1-LC2免疫葎草花粉变应性哮喘
小鼠模型后 ,再次激发时症状明显减轻 ,病理炎症级
别 、炎细胞浸润和嗜酸性粒细胞百分比均明显降低 ,
并引起肺泡灌洗液和脾组织匀浆中 IL-4浓度降低和
IFN-γ浓度升高 ,血清中 IgE 浓度降低 、IgG 浓度升
高。提示该核酸疫苗诱导了特异性 TH1反应 ,导致
B细胞抗体同型转换为 IgG ,中和变应原并阻断其结
合到 IgE 抗体 ,证实该核酸疫苗具有免疫保护作用。
3 讨 论
在构建 pcDNA3.1-LC2 的过程中 ,引入的目的
基因位于 CMV 启动子的下游 Hind Ⅲ和 EcoR Ⅰ酶
159
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切位点之间[ 7] ,该目的基因与拟南芥 、稻属 、牵牛花 、
玉蜀黍属 、茄属 、番茄属 、苜蓿属 、葡萄属等有高度同
源性 ,经 ORF 分析该目的基因片段有一个 615 bp大
小的完整开放阅读框 ,可编码 204个氨基酸。由此可
推断目的片段在 750 bp左右 。本研究采用磷酸钙沉
淀法 ,将 pcDNA3.1-LC2转染至 HEK293细胞 ,提取
RNA 后行 RT-PCR ,取 PCR扩增产物进行琼脂糖凝
胶电泳 ,于大致 750 bp处分离出清晰的目的条带 ,从
而验证该核酸疫苗可以在真核细胞内成功表达 ,进一
步证实所构建的 pcDNA3.1-LC2具有完整的结构 ,
具备在动物体内发挥生物学特性的结构基础 。
变应原核酸疫苗的研究己经取得了较大进
展[ 8-12] ,其对人类变态反应性疾病的预防及治疗的有
效性和安全性是核酸疫苗的研究重点[ 13] 。如编码低
变应原片段和突变低变应原的桦树花粉 Betv1 α核
酸疫苗 、编码 Betv1低变应原性衍生物质粒均可诱导
小鼠产生非 Betv1特异性抗体反应。该抗体是针对
重组片段 ,其三维空间结构显示该重组片段不同于野
生型分子 ,证实该疫苗不仅具有防护作用 ,也能抑制
Th2型反应。编码 17 ku的树木花粉相关变应原混
合质粒[ 14-16] ,如 Co ra1(榛子)、Mald 1(苹果)、Alng1
(桤木)和 Betv 1(桦木),可诱导 Th1免疫反应 ,作用
可媲美每个单一质粒诱导的免疫反应 。自我复制编
码梯田牧草花粉变应原 Phlp5质粒可诱导 Th1倾向
的免疫反应[ 17-18] , BA LF 中 IgE 降低约 90%,嗜酸性
粒细胞减少约 50%,并显著缓解变应原引起的肺病
理炎症。但是 ,针对葎草花粉变应原的核酸疫苗目前
暂无相关研究。
核酸疫苗属于基因免疫治疗 ,既可诱导体液免疫
应答 ,又可诱导持久的细胞免疫应答[ 19] ,还能诱发局
部免疫应答和免疫记忆。但核酸疫苗普遍存在着免
疫原性较低的特点 ,为克服这一缺点 ,可选用基因佐
剂以增强免疫效果[ 20] 。非甲基化 CpG 序列具有免
疫佐剂的能力 ,是细菌特异性 DNA 基序 。该序列可
诱导 B细胞增殖 ,并激活 T 细胞向 Th1细胞分化;该
序列具有重要的免疫调节特性 ,其可与变应原耦联用
于免疫治疗。本课题组在构建葎草花粉主要变应原
核酸疫苗时 ,pcDNA3.1质粒富含 CpG 序列 ,可视为
DNA 疫苗的内在佐剂 ,弥补了单基因疫苗免疫原性
较弱的缺点。本研究提示 , pcDNA3.1-LC2 诱导了
较高滴度的 IgG ,证实该核酸疫苗具有较好的免疫
原性 。
本研究从分子免疫学 、病理组织学及症状学等角
度证明 , pcDNA3.1-LC2具有免疫原性及免疫保护
作用 ,可显著抑制气道特异性炎症。将 pcDNA3.1-
LC2免疫葎草花粉变应性哮喘小鼠模型后 ,再次激
发时症状明显减轻 ,病理炎症级别及炎细胞浸润和嗜
酸性粒细胞百分比明显降低 , 并引起 I L-4 降低和
IFN-γ升高;而血清中 IgE浓度降低 、IgG 浓度升高 。
提示该核酸疫苗诱导了特异性 TH1反应 、导致 B 细
胞抗体同型转换为 IgG ,中和变应原并阻断其结合到
IgE抗体 ,证实对变应原引起的系统和局部炎症有明
显保护作用 。
在核酸疫苗的研究过程中 ,需注意其有无诱发插
入突变 、癌基因的活化 、抑癌基因的失活 、自身免疫反
应和免疫耐受等问题。葎草花粉主要变应原核酸疫
苗作为一种新型的变应原疫苗 ,还需进一步研究其作
用机制及安全性 ,为该核酸疫苗应用于临床奠定必要
的实验基础 。
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在于该菌株的蛋白 ,已经超过了 VEITH[ 7] 预测的 P.g
外膜蛋白数(127个),其中既含有已知蛋白 ,亦含有未
知功能蛋白及大量假设蛋白 。与 2-DE 联合质谱分
析方法相比 , sho tgun蛋白组学分析方法能够明显提
高外膜蛋白鉴定的数量 ,并且能够鉴定到 2-DE 不易
鉴定到的蛋白[ 12] 。进一步通过功能分析 ,发现鉴定
的 51种已知功能蛋白 ,主要为细菌能量代谢 、信号转
导 、遗传信息处理 、介导组织坏死有关的蛋白 ,其余的
85种未知功能蛋白有待进一步的功能及免疫原性
研究 。
本实验对 P.g47A-1外膜蛋白的全面鉴定 ,为进
一步研究 P .g 外膜蛋白的致病性及选择更有前途治
疗靶抗原奠定了基础 。
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