全 文 ：食品研究与开发2010年 8月第 31卷第 8期
D11、D31，并对其进行纯度鉴定，通过 Sephaeryl S-300凝
胶柱层析，D11、D31均为均一的多糖组分，测得 D11分子
量为 76 468 u。光谱分析表明，油松花粉多糖组分 D11
不含蛋白质，并且含有多糖类物质的特征吸收峰。
参考文献：
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收稿日期：2010-06-16
HPLC法测定绿豆芽中四种大豆异黄酮的含量
周光明，李艳艳，辛丹敏
（发光与实时分析教育部重点实验室，西南大学化学化工学院，重庆 400715）
摘 要：建立同时测定绿豆芽中 4种大豆异酮（大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素）含量的高效液相色谱方法，
对从绿豆芽中提取 4种大豆异黄酮的工艺进行优化，最佳工艺为：用 60 ％的乙醇在 55 ℃条件下超声提取 60 min，
料液比为 1∶12（g/mL），同时探究绿豆发芽不同天数 4种大豆异黄酮的含量。采用日本岛津 LC-20A高效液相色谱仪
进行测定的色谱条件为：色谱柱为 phenomenex C18（150 mm×4.6 mm，5.0 μm），采用乙腈－0.2 ％甲酸为流动相进行梯度
洗脱，流速为 0.8 mL/min，检测波长为 260 nm。大豆苷，染料木苷，大豆苷元，染料木素的线性范围分别是
0.74 μg/mL～100.00 μg/mL，0.74 μg/mL～200.00 μg/mL，0.167 μg/mL～500.00 μg/mL，0.198 μg/mL～160.00 μg/mL（r＞0.999 6），
线性关系良好；加样回收率（n＝9）分别为 100.02％，98.95％，99.28％，99.63％。
关键词：HPLC；绿豆芽；大豆异黄酮；正交试验
Determination of Four Isoflavone in Mung Bean Sprout by HPLC
ZHOU Guang-ming，LI Yan-yan，XIN Dan-min
（Key Laboratory on Luminescence and Real-Time Analysis (Southwest University), Ministry of Education，School of
Chemistry and Chemical Engineering, Southwest University, Chongqing 400715, China）
Abstract：To develop an HPLC method for determination of four isoflavones, daidzin, genistin, daidzein,
genistein in mung bean sprout. An phenomenex C18 column（150 mm×4.6 mm，5.0 μm）was applied，a gradient
mobile phase composing of acetonitrile and 0.2 % formic acid was used, and the flow rate was 0.8 mL/min,
detective wavelength was set at 260 nm. The best condition of extracted four isoflavones of mung bean sprout was
studied, the results showed the best condition was the ethanol concentration 60 %, 55 ℃, extraction for 60 min
with the solid -liquid ratio 1 ∶12 （g/mL）. The results were obtained that quantitative linear range of four
isoflavones was 0.74 μg/mL -100.00 μg/mL，0.74 μg/mL -200.00 μg/mL，0.167 μg/mL -500.00 μg/mL，
0.198 μg/mL-160.00 μg/mL（r＞0.999 6）respectively, and the average recoveries（n=9）were 100.02％，98.95％，
99.28％，99.63％ respectively. A specific, sensitive, simple and reproducible HPLC method has been established
for determination of four isoflavones in mung bean sprout.
Key words: HPLC；mung bean sprout；isoflavone；orthogonal test
基金项目：发光与实时分析重庆市重点实验室（西南大学）（CSTC，2006CA8006）；西南大学校青年基金（SWNUQ，2005008）；重庆市自然科学基
金（CSTC，2007BB5370）
作者简介：周光明（1964—），男（汉），教授，博士，主要从事色谱方面的研究。
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检测分析
98
食品研究与开发 2010年 8月第 31卷第 8期
大豆异黄酮是一种弱的植物雌激素。一般认为，
大豆异黄酮是强力的抗氧化物，能够降低自由基对于
低密度脂蛋白的氧化，降低低密度脂蛋白-胆固醇在
动脉中沉积，减少动脉硬化的风险[1]。大豆异黄酮对人
体健康十分有益，尤其与女性一生的健康关系更为密
切[2]。人造雌激素药物总带有或多或少的副作用，例如
增肥、患乳癌几率增大等[3]。大豆异黄酮的生化结构与
人体内的雌激素完全相同，却没有人造雌激素药物之
副作用。长期的临床试验证明：大豆异黄酮具有对雌
激素的双向调节作用。当人体内雌激素水平过高时，
异黄酮以“竞争”方式占据受体位置，同样发挥弱雌激
素效应，但由于它的活性仅为体内雌激素的 2 %，因而
从总体上表现出降低体内雌激素水平的作用，可防治
乳腺癌、子宫内膜炎；而当人体内雌激素水平偏低时，
异黄酮占据雌激素受体，又表现出提高雌激素水平的
作用，可防治一些和激素水平下降有关疾病的病症，如
更年期综合症、骨质疏松、血脂升高等[4-6]；据报道每天
摄入占食物总量 2 %～4 %的大豆制品，患乳腺癌的危
险性可降低 50 %[7]。
随着大豆异黄酮的生理活性得到人们普遍认可，
测定豆类产品中大豆异黄酮的含量成为研究热点之
一[8]。但目前尚无在绿豆发芽期间对其 4种大豆异黄酮
进行检测、比较发芽前后 4种大豆异黄酮含量的变化
的报道，本文建立了一种快速、简便、灵敏的 HPLC法，
为绿豆发芽期间四种大豆异黄酮含量变化的研究提
供理论依据。
1 材料与方法
1.1 仪器和试剂
日本岛津 LC-20A高效液相色谱仪，包括 SPD-
20A紫外检测器、CTO-10AS柱温箱、LC-20AT泵、色
谱柱：phenomenex C18（150mm×4.6 mm，5.0μm），0.45μm
针头微孔滤膜过滤器，KH-3200B型超声波清洗器：昆
山禾创超声仪器有限公司；SZ-2自动双重纯化水蒸馏
器：上海泸西分析仪器；XY 型电热恒温干燥箱；
FA2004A型分析天平；DF-101S集热式恒温加热磁力
搅拌器：郑州长城科工贸有限公司。
甲醇（分析纯）：成都市科龙化工试剂厂；乙腈（分
析纯）：成都市科龙化工试剂厂；甲酸（分析纯）：成都市
科龙化工试剂厂；冰醋酸（分析纯）：重庆东方试剂厂；
乙醇（分析纯）：成都市科龙化工试剂厂；水为二次蒸馏
水；大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素对照品均
购自天津中新药业中药现代化技术工程中心；绿豆：重
庆市场随即购买。
1.2 对照品溶液的配制
分别精密称取对照品大豆苷，大豆苷元，染料木
苷，染料木素适量，加 70 ％的乙醇配置成大豆苷
100 μg/mL、大豆苷元 500 μg/mL、染料木苷 200 μg/mL、
染料木素 160 μg/mL的溶液，作为对照品溶液，待用。
1.3 绿豆发芽及前处理
选色泽新鲜、籽粒饱满、无虫蛀、无霉烂、无残破
豆粒、发芽势强的优质绿豆，将其放入盆中，用清水漂
洗 3遍～4遍，然后用 80 ℃热水浸泡 5 min，迅速冲入
冷水，将水温调为 45 ℃左右，浸泡 3 h～4 h，将绿豆捞
出，用绿豆重量 3倍的温水浸泡，在 25 ℃恒温条件下
发芽。每隔 5 h～6 h淋温水一次。从绿豆浸泡开始，24 h
为生长 1 d的绿豆芽，取样时采取随机取样法分别采
取 1 d～7 d的绿豆芽进行测定。发芽好了的种子立即
放在 40 ℃烘箱中烘干 10 h，然后，将种子用粉碎机粉
碎过 40目筛子。粉碎过筛后的种子作为每次试验的样
品。绿豆带皮测定，经发芽的绿豆芽不带皮。
1.4 供试品溶液的配置
分别定量称取不同样品粉末，加入 60 %的乙醇在
55℃超声提取 60 min，料液比为 1∶12（g/mL)，静置得上
清液，经 0.45 μm微孔膜过滤，待用。
2 结果与分析
2.1 色谱条件的确定
2.1.1 检测波长的选择
通过紫外扫描，知 4种大豆异黄酮在 260 nm处均
有较大吸收，故选取检测波长为 260 nm。结果见图 1。
2.1.2 流动相的选择
分别采用甲醇－水，甲醇－0.1 ％醋酸，甲醇－0.2 ％
甲酸，乙腈－0.1 ％醋酸，乙腈－0.2 ％的甲酸作为流动
相，试验结果见图 2。
A
检测分析
99
食品研究与开发2010年 8月第 31卷第 8期
表 2 提取工艺正交试验结果
Table 2 Orthogonal test results of extraction technology of
isoflavones
序号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
A
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
4
4
4
4
4
5
B
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
C
1
2
3
4
5
2
3
4
5
1
3
4
5
1
2
4
5
1
2
3
5
D
1
2
3
4
5
3
4
5
1
2
5
1
2
3
4
2
3
4
5
1
4
4种大豆异黄酮总含量/（mg/g）
0.22
0.26
0.60
0.63
0.64
0.82
1.16
1.12
1.35
1.48
1.40
1.19
1.12
0.74
1.02
0.71
1.02
1.44
0.76
1.08
0.82
从图 2知，甲醇－水作为流动相时，染料木苷峰形
拖尾现象严重；甲醇－0.1 ％醋酸作为流动相时，染料木
素的峰稍有前伸现象，峰形不尖锐；甲醇－0.2 ％的甲酸
作为流动相，大豆苷的峰稍有前伸现象，且洗脱时间较
长；乙腈－0.1％醋酸作为流动相，大豆苷的峰稍有前伸
现象，且洗脱时间较长；乙腈－0.2 ％甲酸作为流动相，
四种大豆异黄酮峰形尖锐，且洗脱时间最短。故最终
选取乙腈－0.2％甲酸最为流动相。
2.1.3 流动相比例的选择
分别采用等度洗脱和梯度洗脱分离四种大豆异
黄酮，结果见图 3。
从图 3知，等度洗脱时，大豆苷和染料木苷重叠，
大豆苷元和染料木素重叠，无法分开，且出峰时间太
早，不利于样品物质的分离。采用梯度洗脱，大豆苷和
染料木苷、大豆苷元和染料木素可以分离，且起始乙腈
浓度越低，大豆苷和染料木苷分离效果越好，当起始乙
腈浓度为 5 ％时，大豆苷和染料木苷就达到了良好的
基线分离，且峰形尖锐。
2.1.4 色谱条件的确定
根据上述结果，确定本试验的色谱条件为：流动
相由 0.2 %甲酸和乙腈组成（A：0.2 ％甲酸，B：乙腈），
采用梯度洗脱，洗脱程序为：0～10 min，B：5 ％～80 ％；
10 min～16 min，B：80 ％；16 min～22 min，B：80 %～5 ％；
体积流量：0.8mL/min；进样量：20μL；检测波长：260 nm；
柱温：室温。理论塔板数按大豆苷计算不低于 36 000。
2.2 大豆异黄酮提取工艺的确定
2.2.1 正交试验设计
在预备试验中，对乙醇浓度、提取温度、提取时
间、固液比 4个因素分别进行了 5水平试验，采用 L25（54）
表安排正交试验，以 4种大豆异黄酮总含量为评价指
标。正交试验因素与水平见表 1。
2.2.2 正交试验结果与分析
取同一样品按表 1设计试验，结果见表 2和表 3。
表 1 正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal test
1
2
3
4
5
A乙醇浓度/%
50
60
70
80
90
B提取时间/min
20
40
60
80
100
C提取温度/℃
35
45
55
65
75
D固液比
1∶5
1∶7
1∶10
1∶12
1∶15
水平
因素
检测分析
100
食品研究与开发 2010年 8月第 31卷第 8期
表 3 正交试验方差分析
Table 3 Analysis of variance of orthogonal test
变异来源
第 1列
第 2列
第 3列
第 4列
误差
偏差平方和
1.553
0.243
0.197
0.111
2.10
自由度
4
4
4
4
16
均方
0.388
0.061
0.049
0.028
0.131
F值
2.952
0.462
0.375
0.211
F（0.10）
2.330
2.330
2.330
2.330
表 4 4种大豆异黄酮成分线性关系
Table 4 Linear relationship of four isoflavones
成分
大豆苷
染料木苷
大豆苷元
染料木素
回归方程
Y=2.021×105＋1.343×105X
Y=2.031×105＋1.471×105X
Y=5.368×105＋6.000×105X
Y=7.687×105＋2.306×105X
r
0.999 9
1.000 0
0.999 9
0.999 6
线性范围/(μg/mL)
0.74～100.00
0.74～200.00
0.167～500.00
0.198～160.00
从表 2中的极差大小值可知，各因素影响顺序为
A>B>C>D，A2B3C3D4处理组合 4种大豆异黄酮总含量
最高，即乙醇浓度 60 %、提取时间 60 min、提取温度
55 ℃、料液比 1∶12（g/mL）；表 3方差分析表明，乙醇浓
度对试验结果有显著性影响，提取时间、提取温度、料
液比对试验结果无显著性影响。
2.3 检测方法的验证
2.3.1 线形关系的考察
分别精密吸取一系列浓度范围的对照品混和溶
液，进样量 20 μL，按 2.1.4项色谱条件注入液相色谱
仪，测定峰面积。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，
进行线性回归。回归方程及线性范围见表 4。
2.3.2 精密度试验
分别精密吸取对照品溶液 20 μL，按 2.1.4项色谱
条件注入液相色谱仪，测定峰面积，结果大豆苷，染料
木苷，大豆苷元，染料木素的 RSD（n=5）分别为 2.22 %、
2.14 %、2.75 %、1.65 %，表明仪器的精密度良好。
2.3.3 稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液 20 μL，每隔 4 h，按
2.1.4项色谱条件进样一次，共 5次，测定峰面积，结果
大豆苷，染料木苷，大豆苷元，染料木素的 RSD分别为
2.74 %、2.45 %、1.36 %、1.93 %，表明 20 h内测定结果
稳定性良好。
2.3.4 重复性试验
取同一样品 5份，按 1.4项制备供试品溶液，按
2.1.4项色谱条件进样，测定 4种大豆异黄酮含量，得
大豆苷，染料木苷，大豆苷元，染料木素的 RSD分别为
1.98 %、1.67 %、0.88 %、1.32 %，表明本方法的重复性
良好。
2.3.5 回收率试验
精密吸取已知含量的同一样品共 9份，每 3份为
1组，按高、中、低 3个水平分别精密加入对照品一定
量（样品中各成分含有量的 80 ％、100 ％、120 ％），按
2.1.4项色谱条件进样，结果 4种成分的回收率分别为
大豆苷 100.02 %（RSD=0.89 %），染料木苷 98.95 %
（RSD=1.03 %），大豆苷元 99.28 %（RSD=1.58 %），染料
木素 99.63 %（RSD=1.12 %）。
2.3.6 样品测定
按 1.4项方法制备供试品溶液并测定，用外标法
计算发芽不同天数的绿豆及绿豆芽样品，色谱图见
图4，测定结果见表 5、图 5。
续表 2 提取工艺正交试验结果
Continue table 2 Orthogonal test results of extraction technology
of isoflavones
序号
22
23
24
25
K1
K2
K3
K4
K5
k1
k2
k3
k4
k5
极差
A
5
5
5
5
2.35
5.93
5.47
5.01
4.46
0.470
1.186
1.094
1.002
0.892
0.716
B
2
3
4
5
3.97
4.54
5.23
4.30
5.18
0.794
0.908
1.046
0.860
1.036
0.252
C
1
2
3
4
4.79
3.81
5.06
4.61
4.95
0.958
0.762
1.012
0.922
0.990
0.250
D
5
1
2
3
4.79
4.39
4.14
5.07
4.83
0.958
0.878
0.828
1.014
0.966
0.186
4种大豆异黄酮总含量/（mg/g）
0.91
0.95
0.82
0.96
检测分析
101
食品研究与开发2010年 8月第 31卷第 8期
表 5 不同发芽天数绿豆芽中 4种大豆异黄酮的含量
Table 5 The content of four isoflavones in mung bean sprout of
different germinating days
发芽时
间/d
1
2
3
4
5
6
7
大豆苷/
(μg/mL)
22.13
36.40
46.83
57.48
81.14
104.89
62.72
染料木苷/
(μg/mL）
41.54
55.69
64.67
76.52
95.53
199.67
183.15
大豆苷元/
(μg/mL）
24.05
32.58
54.60
78.92
96.80
280.14
184.67
染料木素/
(μg/mL）
12.84
13.85
18.20
24.26
56.83
103.05
83.02
3 结论
1）4 种大豆异黄酮的最佳提取条件为乙醇浓
度 60 %、提取时间 60 min、提取温度 55 ℃、料液比
1 ∶12（g/mL），在此条件下，4种大豆异黄酮的提取含量
最高。
2）绿豆在发芽过程中，随着天数的增加，4种大豆
异黄酮的含量先升高后降低，在第 6天达到最高，之后
降低，从第 8天开始，绿豆芽根部开始发达长出侧根，
牙茎变硬，口感粗糙，使用价值降低，所以不予以考虑。
3）本试验操作简单、快捷、灵敏度高，为日常生活
中绿豆芽的最佳食用时间提供了科学依据。
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收稿日期：2010-05-27
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