全 文 ：第27卷第4期
2 0 0 6年 8月
西 安 交 通 大 学 学 报 ( 医 学 版 )
Journal of Xian Jiaotong University(Medical Sciences)
Vol. 27 No. 4
Aug. 2006
葎草花粉 cDNA 表达文库的构建和初步鉴定
刘　昀1 ,孙秀珍1 ,张王刚2 ,冯向莉1
(西安交通大学医学院第二附属医院:1. 呼吸内科;2. 血液内科 ,陕西西安　710004)
摘要:目的　构建葎草花粉 cDNA 表达文库 , 为进一步筛选葎草花粉的主要致敏蛋白组分 、制备重组变应原奠定基
础。方法　采集新鲜葎草花粉 ,过筛后液氮保存 , 利用 T rizol法抽提葎草花粉总 RNA , 纯化后 PCR 法反转录合成
cDNA 。经 S f iⅠ酶切 , 过凝胶柱层析 ,去除小于 400 bp 的片断 , 收集大于 400 bp 的 cDNA 片段 , 加工后与λT ripIEx2
连接 ,文库体外包装 , 取出一小部分感染宿主菌 XL1-Blue MRF , 检测文库容量;PCR分析插入的 cDNA 片段的大小及
多样性。结果　成功构建一个含有 5 ×105重组子的葎草花粉表达文库 , 重组率为 90%, 平均插入片段长度约为
1. 02 kb。结论　所建文库容量及插入片段大小合适 , 适用于筛选克隆的目的 cDNA 。
关键词:葎草花粉;cDNA;表达文库
中图分类号:R593. 1　　　文献标识码:A　　　文章编号:1671-8259(2006)04-0327-03
Construction and primary characterization of cDNA
expression library of Humulus pollen
Liu Yun
1 , Sun Xiuzhen1 , Zhang Wanggang 2 , Feng Xiang li1
(1. Depar tment of Respirat ion;2. Department o f Hemato logy , Second Affiliated Hospi tal ,
Medical School o f Xian Jiaotong Univ ersity , Xian 710004 , China)
ABSTRACT:Object ive　To construct a cDNA expression library of Humulus pollen and provide the basis for
screening the ma jor allergenic components and producing recombinant allergen of Humulus pollen. Methods　
Verdure Humulus pollen were collected and preserved in liquid nitr ogen afte r be ing sift out. Total RNA was
extr acted f rom the Humulus pollen with tr izol re agent , and cDNA was synthesized by RT-PCR with pur if ied tot al
RNA. Then the cDNA was digested by Sfi Ⅰ and the fr agments smaller than 400 bp were r emoved by chroma spin-
400 column , and the fr agments longer than 400 bp were ligated withλTr ipIEx2 Vector . The libr ary was packaged in
vitro and a small por tion of packaged phage was used to inf ect E . coli XL1-Blue MRF′f or titr ation. The dive rsity of
the libr ary and the length of the inser ted fr agments were analyzed by PCR . Results　The cDNA expression libr ary
conta ined 5×105 r ecombinants and the per centage of recombina tion was 90%. The aver age length of inser ted cDNA
fragments was about 1. 02 kb. Conclusion　The constructed cDNA expression libr ary contains appropr iate contents
and sizes of cDNA fragments and is qualif ied for screening t arget cDNA clone.
KEYWORDS:Humulus pollen;cDNA;expression libr ary
收稿日期:2005-12-21　　修回日期:2006-01-04
基金项目:国家自然科学基金资助项目(No. 30371336)
作者简介:刘昀(1972-), 女(汉族),博士 , 主治医师. 研究方向:变态
反应疾病的防治. E-mail:yan gkun113@sohu . com
　　花粉致敏引起的 Ⅰ型变态反应病如过敏性哮喘 、
过敏性鼻炎 、过敏性皮肤病等是影响人类健康的主要
问题之一[ 1] 。采用基因重组技术制备重组变应原疫
苗并应用于变态反应性疾病的诊断和治疗 ,不仅可以
提高诊断的特异性和敏感性 ,而且还能显著降低粗制
变应原疫苗用于特异性免疫治疗(specif ic immuno-
therapy , SI T)的副作用 ,因此成为国内外变态反应
领域研究的重要课题 。目前 ,国外很多花粉的 cDNA
文库已经构建 ,主要变应原成分及致敏蛋白组分已经
被克隆 、纯化 , 如桦树花粉[ 2] 、豚草花粉[ 3] 杉树花
粉[ 4] 、樱桃花粉[ 5]等 。既往研究发现葎草花粉是西北
地区最主要的气传致敏原之一 。本课题的主要目的
是构建葎草花粉 cDNA 表达文库 ,为筛选葎草花粉
主要变应原阳性克隆及基因重组变应原疫苗的研制
奠定基础。
1　材料与方法
1. 1　葎草花粉标本的采集　在 2004年 9月的葎草
花粉季节 ,选晴天在西安市郊区采集葎草花粉 ,晾晒 ,
9号分样筛过滤 ,乙醚脱脂后立即装入瓶中 ,投入液
氮罐内 , - 180 ℃冷冻保存。
　 西 安 交 通 大 学 学 报 ( 医 学 版 ) 第 27 卷
1. 2　试剂　TRIZOL Reagent 购自 Invit rog en 公
司;SMART cDNA Library Const ruction Kit 购自
C lontech 公司;四环素购自 Sigma 公司;异丙醇 、氯
仿 、乙醇 、酚 、MgSO 4 、麦芽糖均由西安交通大学医学
院采供中心提供 。
1.3　总 RNA的提取　葎草花粉经超声粉碎破壳 ,液
氮研磨成组织匀浆 ,分别加入氯仿 、异丙醇 、乙醇及适
量无 RNA酶的水 ,充分溶解沉淀 ,利用 Trizol 法抽提
葎草花粉 RNA ,经分光光度计测定 A260和 A280值 ,甲醛
变性 ,琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA质量。
1.4　dsDNA的合成　以 CDSⅢ/3′[ 5′-ATTCTAGAG-
GCCGAGGCGGCCGACATG -d(T)30N-1N-3′] 为引
物 ,dNTP混合物为底物 , RNA 为模版 , PCR扩增合成
cDNA第一链(ss cDNA),以 5′PCR(5′-AAGCAGTGG-
TATCAACGCAGAGT-3′)为扩增引物 ,合成 ds cDNA ,
经20个循环后 ,100μL中取5μL经100mg /L琼脂糖凝
胶电泳检测 ds cDNA。
1. 5　cDNA样品的加工与定量　蛋白酶 K消化未灭
活的 DNA聚合酶活性 ,S f iⅠ酶切 ,使 ds cDNA成双粘
性末端 ,然后过凝胶柱层析 ,收集大于 400 bp的 cDNA
片段 ,沉淀纯化后用于连接。取部分乙醇沉淀 cDNA样
品 ,重溶于7μL dd H2O中 ,与对照 cDNA比较 ,经 FR-
200紫外可见分析装置观察 ,计算 cDNA样品浓度。
1. 6　cDNA片段与载体的连接及体外包装　cDNA
片段与λTripIEx2 载体连接 ,建立 3 个平行(不同连
接比例)连接反应 ,选择最佳连接比例连接 cDNA片段
和λTripIEx2载体 ,体外包装 ,构建 cDNA表达文库。
1. 7　cDNA表达文库库容量 、重组率的测定及插入
片段大小的 PCR鉴定　取部分包装产物 ,不同倍数
稀释后感染宿主菌 XL1-Blue ,37 ℃孵育 15 min后与
含有 IPTG 和 X-gal的顶层琼脂混合 ,倒在 LB /M g-
SO 4 琼脂平板上 , 37 ℃孵育过夜 ,计算蓝白斑比例 、
噬菌斑数 、噬菌体滴度及库容量 。噬菌体滴度(Pfu /
mL)=(噬菌斑数×稀释因子×103μL /mL) /稀释噬
菌体体积(μL)。随机挑选单克隆噬斑体外切割后进
行 PCR鉴定 ,推算出文库的重组率及插入片段大小 。
2　结　　果
2. 1　RNA 的提取　葎草花粉总 RNA 的 A260 nm 与
A280 nm 的比值为1. 82。甲醛变性凝胶电泳结果显示
有明显的 28S 和 18S 条带(图 1),且 28S 是 18S条带
亮度的两倍 ,提示 RNA 质量合格 ,无降解发生。
2. 2　ds DNA 的合成　总 RNA 经直接 PCR反转录
扩增合成 ds DNA , 然后琼脂糖凝胶电泳检测 ,
ds cDNA呈弥散分布(图 2),条带正常且量足 。
图 1　葎草花粉总 RNA的电泳图
Fig . 1 Electrophoretic g raph of total RNA of Humulus pollen
图 2　经 20 轮循环的 ds cDNA 电泳图
Fig . 2 Electropho retic g raph of ds cDNA after 20 cycles
2. 3　cDNA 样品浓度的测定　通过凝胶柱层析收集
大于 400 bp 的 cDNA 样品 , 乙醇沉淀 ,重溶于 dd
H2O 中。经 FR-200紫外可见分析装置观察 ,并与标
准 cDNA比较 ,样品 cDNA 浓度在对照 DNA 25 mg /L
和50 mg /L之间(图 3)。以 25 mg /L 计算 , 共得到
cDNA 大约 160 ng 左右。因此 ,样品 cDNA 的量符
合建库的要求。
图 3　葎草花粉的 cDNA 纯化后的浓度检测结果
Fig . 3 The concentra tion o f H umulus pollen cDNA af te r
being purified
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4 期 刘　昀 , 孙秀珍 ,张王刚 , 等. 葎草花粉 cDNA 表达文库的构建和初步鉴定
2. 4　cDNA文库的鉴定　测得的文库滴度为 1×106
Pfu /mL ,文库体积 500 μL , 因此库容量为 5 ×105
Pfu。从葎草花粉文库中随机挑选 20个克隆 ,经体外
切割 , PCR扩增分析 ,文库重组率为 90%。扩增出的
片段主要集中在 0. 5 - 2 kb之间 ,经凝胶成像及分析
系统分析 ,平均插入片段长度约为 1. 02 kb(图 4)。
图 4　葎草花粉文库中 cDNA 插入片段的 PC R产物的电泳结果
Fig. 4 PC R results of cDNA fragments of humulus pollen library
3　讨　　论
由 IgE介导的 I型变态反应性疾病如过敏性哮
喘 、过敏性鼻炎 、过敏性结膜炎 、过敏性皮肤病等影响
了世界 25%的人群[ 6] 。SIT 是唯一针对病因治疗的
有效方法 ,但传统 SIT 用天然变应原提取液的成分
非常繁杂 ,包括致敏蛋白组分 、非致敏蛋白组分及杂
质等 ,影响其安全性和疗效。随着分子生物学技术的
发展 ,重组变应原是目前国内外变应原研究的热
点[ 7] 。重组变应原不仅可以提高诊断的敏感性与特
异性 ,而且还可以确保 SI T 的疗效及安全性 。近几
年 ,我国夏秋季花粉调查中发现空气中葎草花粉计数
仅次于蒿属花粉 ,其变应原皮内试验阳性者达 70%,
血清 sIgE阳性率达 67%,所以认为葎草花粉是我国
北方极为重要的致敏原[ 8] 。在本课题组近十多年的
西安地区气传致敏花粉调查研究及变态反应临床实
践中 ,发现变态反应性疾病患者葎草花粉过敏原皮肤
试验 、sIgE 阳性率均达50%以上 ,提示葎草花粉是西
北地区最主要的气传致敏原之一 。为进一步研究葎
草花粉主要变应原 ,制备重组葎草花粉变应原 ,用于
葎草花粉过敏引起的变态反应性疾病的诊断和治疗 ,
本研究构建了葎草花粉表达文库。
本实验采用一种全新的 SMART 技术构建了
cDNA 表达文库。SMART 引物和 CDS Ⅲ 引物分别
带有一个不完全相同的 S f iⅠ酶切位点。S f i Ⅰ是一
个在真核生物基因组中极为稀少的酶 ,出现的频率要
远远小于 Not Ⅰ 、EcoRⅠ等识别 6个碱基位点的酶。
经过 SMART 技术合成两端分别带有 SMART 引物
和 CDS Ⅲ引物的 cDNA , 经过扩增后用 S f i Ⅰ单酶
切 ,得到的是两个不同粘性末端 cDNA 。这样就可以
定向插入特定的载体中 。本实验采用 λTripIEx2 噬
菌体载体 ,可以用 3个不同的表达框架分别同时表达
一段插入的 DNA 。这样就保证插入片段正确的表达
产物能被筛选出来而不会被漏掉。
构建高质量的 cDNA 表达文库的首要条件就是获
得完整且不被降解的总 RNA 。本实验利用 Trizol 法
抽提葎草花粉总 RNA ,经分光光度计测定 A260 nm 与
A280 nm的比值为 1. 82 ,提示产物纯度较高。电泳结果
显示28S是 18S条带亮度的两倍 ,且无拖尾现象发生 ,
提示 RNA无降解 ,质量合格 ,适合用于建库需要。
重组子插入片段的大小是评价文库质量的标准 。
我们采用 SMART 技术 ,构建了全长 cDNA 文库 。
本实验合成 ds cDN A经电泳检测 ,呈弥散分布(图 2),
条带正常且量足够。同时本实验采用凝胶过滤对
cDNA进行分离 ,除去一些长度小于 400 bp的短片段 ,
保证了文库的质量。本实验随机挑选文库单克隆进行
PCR扩增 ,经分析平均插入片段长度约为 1. 02 kb ,符
合建库要求 。这为进一步筛选出全长目的基因提供
了保证 。
足够大的库容量是保证筛选目的基因的关键 。
低丰度 mRNA 在 cDNA 文库中出现的某一给定概
率所需克隆数为 N=ln(1 - P)/ ln[ 1 - (1 /n)] [ 9] (N
为所需克隆数 , P 为要求的概率 , 1 /n 为低丰度
mRNA在总 mRNA中所占的比例)。若要以 99%的
概率获得这些低丰度的克隆 ,则要求的文库克隆数为
1. 7×105 。我们所建的表达文库已超过了这一标准 ,
保证了低丰度基因的筛选 。
本研究构建的葎草花粉 cDNA 表达文库 , 适用
于进一步进行葎草花粉主要致敏蛋白组分克隆的筛
选 ,为研究葎草花粉主要致敏蛋白组分 、研制重组葎
草花粉变应原奠定了基础 。
(下转第 348 页)
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　 西 安 交 通 大 学 学 报 ( 医 学 版 ) 第 27 卷
细胞活性及细胞周期中各期细胞比例与未表达 GFP
的细胞无差异。说明 GFP 长期高表达对转染细胞无
明显毒性作用。它不但可以作为瞬时表达用的标记
物 ,而且可以用于标记长久的高水平表达。由于 GFP
分子相对较小 ,且它具有可以与很多蛋白融合表达而
不影响各自性质的特性 ,因而利用标准亚克隆技术即
可将感兴趣的基因与 GFP 融合 ,然后将其转入感兴趣
的生物体内进行瞬间或稳定表达 ,以便进行活体定位
观察 、蛋白质定位 、细胞间的物质运输及运输的动力学
研究等。现代医学正在向个体化医学转变 ,从分子水
平探讨基因功能以及基因突变致心律失常的机制将为
进一步基因水平的个体化治疗开辟前景。
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