全 文 ：山西农业科学 2012，40（12）：1235- 1239 Journal of Shanxi Agricultural Sciences
欧李 ChPSY基因的原核表达
陈俊奇，王鹏飞，杜俊杰，李润丰，洪文泓，李 佩，马精选，张建成
（山西农业大学园艺学院，山西太谷 030801）
摘 要：为了解欧李果实类胡萝卜素合成过程中八氢番茄红素合成酶基因的作用和功能，将从欧李成熟果
实中分离的 ChPSY cDNA序列，连接到原核表达载体 pET- 28a（+），导入大肠杆菌 BL21（DE3）体内诱导表
达。SDS- PAGE分析表明，1.0 mmol/L IPTG诱导 4 h，表达了相对分子量约为 45.8 kD融合蛋白产物；IPTG的
浓度和诱导时间优化表明，1.2 mmol/L IPTG诱导 6 h时，融合蛋白的表达量最大。此外，Western- blot试验证
实，表达的融合蛋白能与抗 6×His的单抗发生特异性反应。这为欧李八氢番茄红素合成酶基因 ChPSY生物
学功能的深入研究奠定了基础。
关键词：欧李；八氢番茄红素合成酶；cDNA序列；原核表达
中图分类号：S662.3 文献标识码：A 文章编号：1002- 2481（2012）12- 1235- 05
Prokaryotic Expression of ChPSY Gene from Cerasus humilis
CHEN Jun- qi，WANGPeng- fei，DU Jun- jie，LI Run- feng，HONGWen- hong，
LI Pei，MA Jing- xuan，ZHANG Jian- cheng
（College of Horticulture，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）
Abstract：To understand the role and function of the Cerasus humilis phytoene synthase gene（ChPSY）, the full- length
coding region of ChPSY cDNA from the Cerasus humilis mature fruit was linked into the prokaryotic expression vector pET- 28a
（+）. The recombinant plasmid pET- ChPSY was transformed into E. coli BL21（DE3）for induced expression. The analysis of
SDS- PAGE demonstrated that the fusion protein（6×His- PSY）was produced at 4h after induction by 1.0 mmol/L IPTG and mi-
grated at a size of about 45.8 kD. The optimization of IPTG concentration and induction time showed the fusion protein quantity
was maximal after 6 h induction by 1.2 mmol/L IPTG. The results of Western- blot demonstrated that the fusion protein （6×
His- PSY）could be recognized by anti- 6×His monoclonal antibody. The research provided a basis for further study on the bio-
logical function of ChPSY gene in fruit carotenoid biosynthesis of Cerasus humilis（Bge）Sok.
Key words：Cerasus humilis; phytoene synthase; cDNA sequence; prokaryotic expression
收稿日期：2012- 09- 26
基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20101403120006）；山西省自然科学基金项目（2012011032- 4）；山西省人力资源和社会
保障厅优秀人才专项补助基金项目；山西省高等学校大学生创新创业训练项目；山西农业大学大学生科技创新项目（9- 031）
作者简介：陈俊奇（1991-），男，山西临汾人，在校学生，研究方向：园艺植物分子生物技术。张建成为通讯作者。
doi:10.3969/j.issn.1002-2481.2012.12.02
类胡萝卜素是自然界中分布最为广泛的一
大类色素，不仅赋予植物花、果实等器官鲜艳的
色彩，还在光合作用、ABA和芳香物质合成中
起重要作用[1- 2]。八氢番茄红素合成酶（Phytoene
synthase，PSY）是类胡萝卜素生物合成途径中的
第 1个限速酶，它催化 2 个分子 GGPP（牻牛儿
基牻牛儿基焦磷酸）聚合形成八氢番茄红素，其
编码基因已成为人们应用基因工程技术调控植
物类胡萝卜素的生物合成，改善果树、蔬菜和花
卉等园艺植物观赏性能、营养品质和经济价值的
首选靶基因[1，3]。目前，已从番茄、烟草、柑橘、向日
葵、玉米、甜瓜等多种植物中相继克隆获得编码
PSY的完整基因或部分片段序列[4- 9]。研究表明，
大部分植物中仅含有单一的 PSY基因，而番茄、
玉米和水稻等少数植物中发现了 2个或 3个表
达有差异的 PSY基因，其表达不仅具有器官或
质体特异性，而且受环境胁迫的影响[10- 12]。番茄中
克隆到 2个 PSY基因，其中，PSY1在花和果实
中特异性表达，而 PSY2主要在叶片中表达[13- 14]。
此外，在玉米、水稻等谷类植物中分离获得 PSY3
基因，该基因主要是在根系中表达，参与调控
植株对干旱、盐渍、温度和强光等非生物胁迫的
反应[11- 12]。
欧李（Cerasus humilis（Bge）Sok）属于蔷薇科
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山西农业科学 2012年第 40卷第 12期
樱桃属，是我国特有的一种果、牧、药兼用的树
种[15]。欧李果实色泽鲜艳、风味独特、营养丰富，
是一种倍受消费者青睐的特色保健水果，尤其是
果实富含花青素、黄酮醇和类胡萝卜素等多种色
素物质，其具有很高的开发利用和研究价值[15]。
目前，欧李果实类胡萝卜素代谢生理及调控研究
的报道相对较少，而有关欧李果实类胡萝卜素生
物合成途径中相关基因分离及鉴定的研究报道
甚少。
本研究将从欧李果实分离的八氢番茄红素
合成酶基因 ChPSY cDNA克隆到原核表达载体
pET- 28a（+），并进行了蛋白诱导表达的研究，旨
在为欧李八氢番茄红素合成酶基因生物学功能
的深入研究奠定基础。
1 材料和方法
1.1 试验材料
欧李 ChPSY cDNA全长序列由山西农业大
学果树学分子生物实验室从欧李农大 4号成熟
果实中克隆保存[16]。大肠杆菌菌株 DH5α和 BL21
（DE3），pMD- 18T克隆载体及 pET- 28a（＋）原核
表达载体由山西农业大学果树学分子生物实验
室保存；限制性内切酶 BamH I和 Xho I，Taq聚
合酶和 T4 DNA连接酶购自宝生物工程（大连）有
限公司；硝酸纤维素膜为 Pallman公司产品；考
马斯亮蓝 R- 250和 DAB为 Sigma进口分装；单
克隆抗体鼠源抗 6×His为 QIAGEN公司产品，
HRP标记羊抗鼠 IgG为 Sigma公司产品；其他试
剂或药品均为国产分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1 欧李 ChPSY 基因的序列比较分析 利用
ORF Finder（http：//www.ncbi. nlm. nih. gov/gorf/gorf.
html），BLASTx（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/ BL-
AST）和 MEGA 4.0 软件（Neighbor- Joining，邻接
法）对欧李 ChPSY cDNA全长序列进行生物信息
分析。
1.2.2 欧李 ChPSY基因重组表达载体的构建
根据已克隆欧李 ChPSY基因的核苷酸序列和原
核表达载体 pET- 28a（+）的特点合成 1对引物，
即上游引物为 PSY- F：5′- CGGGATCCATGTCAG
GTGTT- 3′（下划线处为 BamHⅠ位点）和下游引
物为 PSY- R：5′- CCGCTCGAGTCTTGACACCAA-
3′（下划线处为 XhoⅠ位点），扩增欧李 ChPSY基
因的完整开放读码框序列。反应条件：94℃ 3 min；
94 ℃ 1 min，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35 个循环；
72℃延伸 10 min。PCR扩增产物经 BamHⅠ和
XhoⅠ双酶切，回收酶切片段与经 BamHⅠ和
XhoⅠ双酶切的 pET- 28a（+）在 T4连接酶作用下
16℃连接过夜。然后，按常规的方法进行转化和
筛选，挑取单菌落进行 PCR、酶切和测序鉴定，
确保重组质粒 pET- ChPSY的序列及其读码框
正确。
1.2.3 欧李 ChPSY基因的诱导表达 将构建正
确的 pET- ChPSY转化 E. coli BL21，挑取阳性克
隆接种于含有 Kanr（50 μg/mL）的 LB液体培养
基，37℃振荡培养过夜，再按 1∶100的比例接
种于相同的 LB培养基，37 ℃振荡培养至 OD600
约为 0.5时，加入 IPTG至终浓度 1.0 mmol/L诱导
表达 4 h，同时设 pET- 28a（+）空白对照，分别取
样进行 SDS- PAGE电泳检测蛋白有无表达[17- 20]。
设置 0，0.4，0.8，1.0，1.2 mmol/L的 IPTG 诱导蛋
白表达，观察不同浓度的 IPTG在诱导 4 h后蛋
白的表达量；IPTG浓度为 1.2 mmol/L条件下，分
别诱导 0，1，2，4，6 h后取样，观察不同诱导时间
下蛋白的表达量[21]。
1.2.4 欧李 ChPSY基因表达产物的鉴定 将蛋
白质凝胶电泳带转印到硝酸纤维素膜（NC膜），
转印后的 NC膜用 PBS封闭，室温轻摇过夜，加
入鼠源抗 6×His的单克隆抗体，室温轻摇反应
2 h，PBS洗涤 3次，加入 HRP标记羊抗鼠 IgG抗
体，室温轻摇作用 2 h，PBST洗涤 3次。然后，将
转印膜置于 DAB显色液中，加入 10～20 μL
30%的 H2O2，迅速轻轻摇匀，直至条带清晰，用
PBS漂洗终止反应[22]。
2 结果与分析
2.1 欧李 ChPSY基因序列分析
欧李 ChPSY基因由山西农业大学果树学分
子生物实验室从农大 4号欧李成熟果实中克隆，
该基因 cDNA序列全长 1 559 bp，最大开放读码
框为 1 194 bp，编码 398个氨基酸，5′和 3′端分别
为 195，170 bp 的非编码序列（图 1- A）。欧李
ChPSY基因所推导的氨基酸序列与草莓、胡萝卜
和高粱 PSY的氨基酸序列长度相似，同源性分
别为 92%，78%和 81%。此外，聚类分析也表明，
欧李与草莓、胡萝卜和高粱 PSY蛋白亲缘关系
较近，聚为同一类（图 1- B）。
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陈俊奇等：欧李 ChPSY基因的原核表达
2.2 欧李 ChPSY基因重组表达载体的构建
采用 PSY- F和 PSY- R 引物 PCR 扩增获得
1条约 1.2 kb的条带，与预期的扩增目的片段大
小吻合。
将 PCR产物和 pET- 28a（+）载体进行连接，
经 PCR扩增和酶切鉴定均获得约 1.2 kb 片段，
与预期结果相符（图 2）。测序结果表明，质粒
pET- ChPSY中确实含有目的片段，且读码框正
确，表明原核表达载体 pET- ChPSY构建成功。
2.3 欧李 ChPSY 基因的原核表达与 SDS-
PAGE分析
将重组质粒 pET- ChPSY转入大肠杆菌BL21
（DE3）过夜培养，然后加入 1.0 mmol/L IPTG诱导
4 h，取样进行 SDS- PAGE电泳检测。结果表明，
pET- ChPSY转化大肠杆菌 BL21（DE3）获得了表
达，在大约 45.8 kD处有 1条特异蛋白条带出现，
与预期分子量大小相吻合，而相应的对照
pET- 28a（+）则没有该条带（图 3）。
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山西农业科学 2012年第 40卷第 12期
进一步分析不同浓度 IPTG和不同诱导时间
对 ChPSY蛋白表达量的影响，结果表明，分别加
入 0，0.4，0.8，1.0，1.2 mmol/L IPTG诱导蛋白表达
时，当浓度为 1.2 mmol/L时，诱导蛋白的表达量
最大（图 4- A）；浓度为 1.2 mmol/L时，分别诱导
0，1，2，4，6 h后取样进行 SDS- PAGE电泳，结果
表明，诱导 6 h，ChPSY蛋白的表达效果最好（图
4- B）。因此，欧李 ChPSY蛋白在 IPTG浓度为
1.2 mmol/L诱导 6 h时，表达效果最好。
2.4 欧李 ChPSY 基因表达产物的 Western-
blotting
利用鼠源抗 6×His单克隆抗体为一抗和羊
抗鼠 IgG- HRP为二抗，对欧李 ChPSY基因表达
产物进行Western- blot检测。结果表明，在 45.8 kD
处出现 1条特异性的杂交条带，没有杂带，表明
该融合蛋白 PSY- 6×His 具有良好的反应活性
（图 5）。
3 讨论
在高等植物中，类胡萝卜素是在质体中通过
类异戊二烯途径合成的一大类萜类色素物质，其
不仅赋予水果、蔬菜和花卉等鲜艳的色彩，还对
癌症、心脑血管疾病和维生素 A缺乏症等多种
人类疾病具有预防或保健功效[3]。八氢番茄红素
合成酶（PSY）是植物类胡萝卜素生物合成过程
中的关键酶，其编码基因成为应用基因工程技
术改善植物类胡萝卜素含量的首选目的基因[1]。
Ye等[23]将植物黄水仙的 PSY，LCYb和细菌的CrtI
共同转入水稻，使得转基因水稻种子中形成类胡
萝卜素，因其内胚乳呈金黄色而被誉为“黄金水
稻”，内胚乳（干质量）中 β- 胡萝卜素含量高达
1.6 μg/g。之后，该研究小组利用玉米 PSY替代黄
水仙 PSY，获得黄金水稻 2代转基因植株，内胚
乳（干质量）中的 β- 胡萝卜素含量大幅度提升到
37 μg/g[24]。转基因黄金水稻的诞生极大地鼓舞了
人们开展作物类胡萝卜素品种改良的信心，油
菜、玉米、亚麻、拟南芥、番茄、马铃薯、山金柑等
多种其他作物相继获得转基因植株，转基因果
实、块茎、籽粒等器官或组织中的类胡萝卜素得
以明显改善或提高[25- 26]。
蛋白质是基因表达的最终产物，要阐明植物
胡萝卜素合成的分子调控机理，还需要从蛋白质
水平进一步研究，而利用大肠杆菌进行外源基因
原核表达是进行蛋白质研究常用的一种方法。
Misawa等[27]将番茄 PSY基因在大肠杆菌中进行
了融合表达，当 N端进行系列缺失后均能正常
表达，但全长基因却未能获得表达，表明番茄
PSY蛋白跨膜信号肽对该酶的催化活性具有明
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显的抑制作用。本研究将欧李 ChPSY基因编码
区在大肠杆菌 BL21（DE3）中进行了融合表达，
获得的目标蛋白主要以不溶的包涵体形式出现，
但仍有部分是可溶性的，且该重组蛋白 PSY- 6×
His具有良好的反应活性。本试验通过诱导条件
的优化，可以增加可溶性融合蛋白的含量，但还
有必要进一步优化欧李 ChPSY基因的原核表达
体系，以便提高诱导表达蛋白的可溶性含量，从
而有利于后续欧李 ChPSY酶蛋白纯化、酶活比
较分析以及位点突变等相关酶学特性研究，并为
通过转基因手段改良欧李和其他作物类胡萝卜
素品质奠定基础。
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