全 文 ：　第 25卷　第 1期
2007年 3月
广西师范大学学报: 自然科学版
Journal o f Guangxi No rma l Univ er sity: Na tural Science Edition
Vo l. 25　 No . 1
Ma r. 2007
收稿日期: 2006-09-01
基金项目: 广西科学基金资助项目 (桂科青 0640062) ;广西农业科学院科技发展基金资助项目 ( 2002008)
作者简介: 邓智年 ( 1976— ) ,女 ,广西南宁人 ,广西农业科学院助理研究员 ,广西大学博士研究生。
通讯作者: 李杨瑞 ( 1957— ) ,男 ,广西北流人 ,广西大学教授 ,博士 ,博士生导师。
野苋菜凝集素基因的克隆及抗蚜性
邓智年 1, 2 ,李　楠 3 ,魏源文 1, 2 ,吕维莉 1 ,李杨瑞1
( 1. 广西农业科学院广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室 ,广西 南宁 530007; 2.广西大学 农学院 ,广西 南宁 530004;
3.广西大学 生命科学与技术学院 ,广西 南宁 530004)
摘　要: 通过 PCR从苋科植物野苋菜 Amaranthus viridis L .基因组 DNA中扩增出野苋菜凝集素的核基因片
段 AV A。序列分析结果表明该基因为 1 831 bp,含有一个 922 bp的内含子和两个分别为 212 bp和 697 bp的外
显子。采用反向 PCR技术获得了该基因的编码区克隆。分别构建含有内含子和不含内含子的 AV A基因植物
表达载体 pBI121AV A-GUS和 pBI121AV Ac-GU S,通过根癌农杆菌介导法转化烟草。 PCR、 GU S检测结果均
表明A VA基因不仅已整合到烟草基因组 DNA中 ,而且初步表明转基因烟草有 AV A蛋白表达。抗蚜实验表明
含内含子和无内含子的 AV A基因在转基因烟草中的抗蚜能力不同 ,转 AV A和 AV Ac烟草对蚜虫的抑制率分
别为 60. 81%和 50. 63% ,有的植株高达 97%。实验结果表明所克隆的 AV A基因是具有抗蚜能力的苋菜凝集素
基因家族中的新成员。
关键词: 植物学 ;野苋菜 AV A基因 ;转基因烟草 ;抗蚜性
中图分类号: Q781　　　文献标识码: A　　　文章编号: 1001-6600( 2007) 01-0086-05
蚜虫是对农作物危害最大的害虫之一。利用基因工程手段培育抗蚜作物已成为当前防治蚜虫的一个
重要途径。已报道具有抗蚜活性的植物凝集素基因有CoA、GNA、ACA、 AHA、 HTA、 PTA等 [1～ 8 ] ,它们的
转基因植物对一些同翅目害虫尤其是蚜虫的生长、发育和繁殖均表现出一定的抑制作用。苋菜类凝集素是
一个小的凝集素家族 ,目前发现的不超过 10种 [ 9] ,只存在于苋科的一些植物中 ,对 2-乙酰氨基-2-脱氧 -D-
半乳糖 ( GalN Ac)具有特异性 ,它们在氨基酸序列和三维结构上都和其他植物凝集素不同。苋菜类凝集素
千穗谷 Amaranthus hypochondriacus AHA与尾穗苋Amaranthus caudatus ACA蛋白在氨基酸序列上有高
达 97. 7%的同源性 ,但转基因烟草对蚜虫的抗性水平却表现出明显的差距 [6, 8, 10 ]。 本文描述了来源于野苋
菜 Amaranthus viridis L .的野苋菜凝集素 AVA基因的克隆和表达 AVA基因的转烟草对桃蚜Myzus persi-
cae繁殖的影响。
1　材料与方法
1. 1　实验材料
测试蚜虫为采自非转基因烟草上的桃蚜。制备总 DNA的野苋菜采自广西农业科学院田边。烟草无菌
苗 Nicotiana tobacum由本实验室繁殖。大肠杆菌 DH5α、根癌农杆菌 EHA105、植物表达载体 pBI121由本
实验室保存 ,克隆载体 pGEM-T Easy Vecto r购自 Promega公司。
1. 2　苋菜总 DNA的提取
采用改良 SDS方法 [11 ]提取苋菜叶片 DN A。
1. 3　野苋菜凝集素基因的克隆
根据报道的尾穗苋 ACA序列 [6 ]和千穗谷 A HA基因序列 [8 ] ,设计 PCR反应引物 P1: 5′-ACCATG
GCGGGAT TACCAG TG-3′、 P2: 5′-T TAGT TGTTGGATCCCAAT TC-3′。PCR扩增条件为: 95°C5min;
DOI : 10. 16088 /j . i ssn. 1001 -6600. 2007. 01. 023
95°C 1 min, 49°C 40 s, 72°C 2 min( 36个循环 ) , 72°C 12 min。 PCR产物与 pGEM-T Vector连接 ,转化
大肠杆菌感受态细胞 DH5α,在含有 IPTG、X-gal和氨卞青霉素的 LB平板上筛选重组质粒。
1. 4　 DNA的序列分析
通过酶切和 PCR鉴定 ,挑选正确的重组质粒送大连 TaKaRa公司测序。有完整 AVA基因插入的重组
质粒命名为 pAV A。
1. 5　反向 PCR扩增 AVA基因编码区序列
根据 AVA基因序列 ,设计反向 PCR引物 P3: 5′-GTGGTCCCCCAATCAT TAT TG-3′、 P4: 5′-CT A
ACCAAAT ATT TGT TAGTG-3′。以质粒 pAV A DNA为模板进行 PCR。扩增条件为: 94°C 5 min; 94°C
1min, 56°C 40 s, 72°C 2. 5 min( 36个循环 ) ; 72°C 12 min。所得 PCR片段经 T4 DNA多核苷酸激酶进行
磷酸化 ,然后在 T4 DNA连接酶作用下自连环化。质粒命名为 pAV Ac。
1. 6　植物表达载体的构建
以重组质粒 pAV A和 pAV Ac为模板 ,克隆去除了 3′端终止子 TAA的 AVA和 AVAc基因 ,使融合蛋
白具有正确的 ORF框。重组质粒用 EcoRI酶切 , T4 DN A聚合酶补平 , Xbal I酶切后回收 AVA和 AVAc基
因片段 ,并与 Sma I和 XbalI双酶切的载体 pBI121分别连接。 将构建得到的植物表达载体 pBI121AV A-
GUS和 pBI121AV Ac-GU S分别转入根癌农杆菌 EHA105后用于烟草的转化。
图 1　野苋菜 A VA基因 PCR产物
Fig. 1　 AV A gene PCR product
1. PCR产物 ; 2. Marker DL-2000
1. 7　烟草外植体的转化和再生
参照文献 [11 ]进行。
1. 8　转基因烟草的 PCR检测
转基因烟草总 DNA提取按文献 [12]的方法进行。两种转基因烟草均
用 P1和 P2引物扩增。
1. 9　 GUS活性的组织化学染色
GUS染色按照文献 [13]进行。
1. 10　转基因植株的抗蚜实验
转基因烟草在温室中长出七八叶时 ,用毛笔小心将 10头 1龄桃蚜接到
测试烟草叶片上 ,每隔 3 d记录蚜虫的数量 ,共进行 5次计数。为防止蚜虫
在植株间转移 ,接虫后每棵植株均用透明的袋子罩住。蚜虫密度抑制率 /% = (对照植株虫数 -参试植株虫
数 ) /对照植株虫数× 100% 。
2　结果与分析
2. 1　野苋菜凝集素 AVA核基因的克隆
以野苋菜总 DNA为模板进行 PCR扩增 ,获得大小约为 1 800 bp的特异条带 ,回收这条片段与 pGEM-
T载体连接。 通过 Amp抗性筛选和重组质粒的酶切分析 ,获得了 AVA基因 (图 1)。
图 2　 AV A基因结构示意图
Fig . 2　 AV A gene structur e
2. 2　苋菜凝集素 AVA基因的序列分析
对获得的克隆进行序列测定。 全序列分
析发现 AVA基因全长为 1 831 bp,含有一个
922 bp的内含子 ,外显子 1为 212 bp,外显子
2为 697 bp(图 2) ,内含子剪切位点符合 GT /
AG的规则。 内含子的 AT 碱基含量高达
75% ,符合一般内含子中 AT 含量高的特征。 AVA 基因外显子序列与千穗谷苋菜 A HA cDN A
( AF143954)和尾穗苋菜 ACA cDN A( AY048755)的序列同源性均为 95% ,其中 AVA基因第二外显子在
1 743 bp位处与前两者相比缺失 6个碱基 ( ggct ta ) ,而且 AVA与 A HA、 ACA序列差异主要集中在内含
子区域 ( A HA内含子长度为 1 538 bp)。 AVAc基因编码 302个氨基酸 ,与 A HA cDN A的氨基酸序列有
13个氨基酸差异 ,与 ACA cDN A有 11个氨基酸差异 ,氨基酸序列的同源性分别为 95%和 96% ,预测蛋白
87第 1期　　　　　　　　　　　　　 邓智年等: 野苋菜凝集素基因的克隆及抗蚜性　　　　　　　　　　　　　
质的相对分子质量为 34. 55 KD。序列同源性分析表明 , AVA基因是苋菜凝集素基因家族中的新成员 ,基
因序列存在变异。
2. 3　AVA基因编码区序列的克隆
为获得 AV A基因的编码区序列 ,对含 AVA基因的 pAV A进行反向 PCR扩增 ,产物经电泳分析约为
4. 1 kb( 3 197 bp载体+ 909 bp编码区 )。对所得的克隆进行全序列分析 ,证明两个外显子已经正确地连接
完整的 AVA编码区 ,未发生碱基突变。
图 3　 p AVAc PCR扩增　　　　　　　　图 4　 AVA-GUS融合基因植物表达载体结构　　
　　 Fig. 3　 PCR of p AVAc pla smid　　　　　　　 Fig . 4　 Structur e of plant expr ession vecto r
　　 1. Marker DL-2000; 2. AV Ac PCR产物 with AVA-GUS fused gene
2. 4　植物表达载体的构建
为研究 AV A基因可能的抗蚜作用及内含子对 AVA基因表达的影响 ,利用 pBI121构建了含有 AVA-
GUS和 AVAc-GU S融合基因的植物表达载体 pBI121AV A-GU S和 pBI121AV Ac-GU S。两种植物表达载
体的 T-DNA区结构见图 4。 AVA基因去除了 3′端终止子 T AA,使得 GUS基因的 A TG碱基能正确翻译 ,
不发生移码 ,保证了整个融合蛋白基因的完整性与正确性。 将含有不同植物表达载体的农杆菌 EH-A105
分别转化烟草 ,在含 300 mg /L卡那霉素的 MS培养基上选择抗性芽 ,分别获得一批转化再生植株。
2. 5　转化烟草植株的 PCR检测
用 P1、 P2引物扩增转化烟草植株的总 DNA,分别得到一条 1 831 bp和 909 bp的片段。图 5、 6的结果
初步证明外源基因可能已整合到植物染色体中。分别获得转 AVA和 AVAc基因再生植株 48株和 40株。
　图 5　转 AV A基因烟草 PCR检测　　　　　　　　　　　图 6　转 AV Ac基因烟草 PCR检测
Fig. 5　 PC R o f tobacco plants transformed w ith AVA　　　 Fig. 6　 PCR o f tobacco plants t ransfo rmed with AV Ac
1. CK; 2～ 7.转化植株 ; 8. Marker DL-2000 1. CK; 2～ 7. 转化植株 ; 8. Mark er DL-2000
2. 6　 GUS活性检测
为了检测转基因烟草中是否有 AVA-GU S和 AVAc-GUS融合蛋白的表达 ,利用 GU S作为基因融合
标记。 设计非转化烟草植株为对照 ,通过 GUS组织化学定位法 ,检测到 PCR阳性植株叶片出现蓝色沉淀
(图 7) ,表明 AVA和 AVAc基因已经整合到烟草基因组中 ,转基因植株中有 AV A-GUS和 AVAc-GU S融
合蛋白的合成。
2. 7　转基因烟草对蚜虫生长发育的抑制作用
pBI121AV A-GU S和 pBI121AV Ac-GUS转基因烟草植株抗蚜试验结果显示 ,转 AVA和 AVAc基因
88 　　　　　　　　　　　　　　　 广西师范大学学报: 自然科学版　　　　　　　　　　　　　　　 第 25卷
植株对蚜虫密度有明显抑制作用 ,平均抑蚜率分别为 60. 81%和 50. 63% ,有些转 AVA基因植株表现出强
烈的抗蚜活性 ,最高可抑制 97%以上的蚜口密度 ,并发现少量桃蚜若虫死亡。大部分转 AVA基因烟草植株
的蚜虫抑制率在 46. 00%～ 80. 06% ,而转 AVAc基因烟草植株蚜虫抑制率则在 40. 00% ～ 69. 80% 。取部分
抗性植株进行蚜虫活性的连续观察 ,结果如图 8所示。转AVA的植株比转 AVAc的植株能更好地抑制蚜口
密度 ,表明转含有内含子的 AVA基因比不含内含子的编码区基因 AVAc有更好的抗蚜性 ,可能是由于内
含子的存在对 AVA基因在烟草中的表达有促进作用 ,从而提高了抗虫性。
　　图 7　转基因烟草 GU S检测　　　　　　　　　　　图 8　转基因烟草对蚜口密度的抑制
　　 Fig . 7　 GUS detection of t ransgenic plants　　　　 Fig. 8　 Inhibition effec ts o f transgenic tobacco plants on
1: CK;　 2, 3:转 AV Ac基因烟草 ;　 4, 5:转 AV A基因烟草 th e population dev elopmen t of M. per sicae
3　讨论
野苋菜凝集素 AVA基因在氨基酸序列上与 A HA和 ACA的同源性分别为 95%和 96% , AVA与 A HA
cDN A的氨基酸序列有 13个氨基酸差异 ,与 ACA cDN A有 11个氨基酸差异。由 CaM 35S启动的 AVA基
因转基因烟草对蚜虫平均抑制率为 60. 81% ,表现出与 ACA蛋白相似的抗蚜活性。尽管这 3种苋菜凝集素
的蛋白质氨基酸序列有很高的同源性 ,但却表现出不同的抗蚜能力 ,这可能是由于这 3种蛋白氨基酸残基
存在差异从而影响了它们各自的抗蚜活性。
AVA基因是一个有潜在应用价值的抗蚜基因 ,是苋菜凝集素基因家族的新成员 ,它能较明显地抑制
蚜虫的存活和群体形成。转 AVA基因烟草的蚜虫平均抑制率虽然达到 60. 81% ,但未达到完全抑制蚜虫生
长发育的水平 ,因此如何提高 AVA基因的抗蚜性将是下一步的研究重点。另外 ,GN A、CoA和苋菜凝集素
等分属不同的凝集素家族 ,在基因、蛋白质序列及结构上同源性不大 ,且分别结合不同的糖基位点 ,对蚜虫
的作用机制也可能不相同 ,因此构建多基因表达载体也有助于获得更有效的抗蚜转基因植物。
参　考　文　献:
[ 1 ]　 GAT EHOUSE A M R, DOWN R E, POW ELL K S, et al. T ransgenic po tato plants with enhanced resistance to the
peach-pota to aphid Myz us persicae [ J]. Entomo log ia Experimentalis et Applicata, 1996, 79: 295-307.
[ 2 ]　 HILDER V A, POWELL K S, GATEHOU SE A M R, et al. Expression of snow drop lectin in transgenic tobacco
plants results in added pro tection against aphid [ J]. T ransgenic Resear ch , 1995, 4( 1): 18-25.
[ 3]　 YUAN Zheng-qiang , ZHAO Cun-you, ZHOU Yan, et a l. Modifica tion of GNA gene and studies on its aphid resistance
[ J]. Acta Bo tanica Sinica, 2001, 43( 6): 592-597.
[ 4 ]　 CHANG Tuan-jie, CHEN Lei, C HEN Song-biao , et al. Tr ansfo rma tion o f tobacco with genes encoding Helianthus
tuber osus agg lutinin ( HT A) confers r esistance to peach-po tato aphid (Myz us persicae ) [ J]. Tr ansgenic Research,
2003, 12( 5): 607-614.
[ 5 ]　 YAO Jian-hong , ZHAO Xiu-yun, LIAO Zhi-hua, et al. Cloning and molecular characte rization o f a novel lectin g ene
from Pinelliaterna ta [ J]. Cell Research, 2003, 13( 4): 301-308.
[ 6]　 GUO Hong-nian, JIA Yan-ta o, ZHOU Yong-gang , et a l. Effects of tr ansgenic tobacco plants expressing AC A gene
fr om Amatanthus cauda tus on the popula tion development of Myz us persicae [ J]. Ac ta Bo tanica Sinica , 2004, 46( 9):
89第 1期　　　　　　　　　　　　　 邓智年等: 野苋菜凝集素基因的克隆及抗蚜性　　　　　　　　　　　　　
1100-1105.
[ 7 ]　 N AGADHARA D, RAM ESH S, PASALU I C, et al. T ransgenic indica rice resistant to sap-sucking insects [ J]. Plant
Bio technolog y Journal, 2003, 1( 3): 231-240.
[ 8]　周永刚 ,田颖川 ,莽克强 .苋菜凝集素基因的克隆及在转基因烟草中抗蚜性研究 [ J].生物工程学报 , 2001, 17( 1): 34-
39.
[ 9]　 RINDERIE S J, GOLDST EIN I J, REMSEN E E. Physicochemica l prope rties of ama ranthin, th e lectin from Amaran-
thus caudatus Seeds [ J]. Biochemistr y , 1990, 29( 49): 10555-10561.
[ 10 ]　 RAINE A, DATT A A. Mo lecula r cloning o f a g ene encoding a seed-specific pr ot ein with nut ritio nally balanced
amino acid composition fr om Amaranthus [ J]. Pr oceeding o f the Na tional Academy of Sciences of USA , 1992, 89:
11774-11778.
[ 11 ]　袁正强 ,赵存友 ,周岩 ,等 .雪花莲凝集素基因 ( GN A)的改造及其抗蚜性 [ J].植物学报 , 2001, 43( 6): 592-597.
[ 12 ]　 M ETTLEP I J. A simple and rapid method fo r minipr epa ration o f DN A f rom tissue cultur ed plant cells [ J]. Plant
Mo lecula r Biolog y Repo r t, 1987, 5: 346-349.
[ 13]　 CLARK M S,顾红雅 ,翟礼嘉 ,等 .植物分子植物分子生物学实验手册 [ M ].北京:高等教育出版社 ,施普林格出版
社 , 1998: 332-334.
Cloning of AVA Gene f rom Amaranthus viridis and Effect of
Aphid Resistance on Transgenic Tobacco Plants
DENG Zhi-nian
1, 2 , LI Nan
3 , WEI Yuan-wen
1, 2 , LU
··
Wei-li
1 , LI Yang-rui
1
( 1. Guangxi Crop Genetic Improvement and Bio techno log y Key Labo ra tor y , Guangx i Ag ricultura l Academy of Science,
Nanning 530007, China; 2. Ag ricultura l Co llege, Guangx i Univ er sity , Nanning 530004, China;
3. Co lleg e of Science and Technolog y , Guangxi Unive rsity , Nanning 530004, China )
Abstract: The Amaranthus v iridis agglutinin ( AVA ) gene f rom Amaranthus viridis L . w as cloned by
PCR. The gene is 1 831 bp long , include one 922 bp int ron and tw o exons of 212 bp and 697 bp. The AVA
gene w ith and wi thout int ron w ere inserted downstream of 35S promoter into a vetor pBI121 to get
pBI121AV A-GU S and pBI121AV Ac-GU S veto r respectiv ely. Af ter t ransformed into tobacco (N icot inana
tobatum ) plant w ith leaf disc t ransfo rmation. Results o f PCR and GU S detection showed that the t rasfor-
mants w ere t ransgenic tobacco plants. The results f rom insect bioassa y wi th peach aphid ( Myzus
persicae ) show ed that th e t ransgenic plants of pBI121AV A-GUS and pBI121AV Ac-GUS were aphid re-
sistant, ev idenced by a 60. 81% ～ 50. 63% reduction in insect population density, some plants w ere more
than 97% . AVA gene o f aphid resistance is reg arded as a new member in Amaranthus lectin families.
Key words: botany; Amaranthus v iridis L . AVA gene; t ransgenic tobacco; aphid resistance
(责任编辑　马殷华 )
90 　　　　　　　　　　　　　　　 广西师范大学学报: 自然科学版　　　　　　　　　　　　　　　 第 25卷