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HPLC 法同时测定断节参中 5 种苯乙酮
毛坤军， 李富强， 白钢钢， 李 祥* ， 陈建伟
(南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023)
收稿日期:2014-03-31
基金项目:江苏省高校优势学科建设工程资助项目 (DE63063683)
作者简介:毛坤军 (1988—) ，男，硕士生，主要从事中药药效物质基础研究。E-mail:maokunjun2012@ 163． com
* 通信作者:李 祥 (1953—) ，女，博士生导师，主要从事中药药效物质基础和中药新药研究。Tel: (025)85811512，Email:lix-
iang_ 8182@ 163． com
摘要:目的 建立断节参中 5 种苯乙酮类化合物的 HPLC定量测定方法。方法 断节参甲醇提取液分析采用 Hanbon-
C18色谱柱 (4. 6 mm × 250 mm，5 μm) ，以甲醇 (A)-0. 1%乙酸水溶液 (B)为流动相，柱温 30 ℃，体积流量 1. 0
mL /min，检测波长 265 nm。结果 2，5-二羟基苯甲酸甲酯、4-羟基苯乙酮、白首乌二苯酮、2，5-二羟基苯乙酮、2，4-
二羟基苯乙酮分别在 2. 66 ～ 53. 2 μg /mL、4. 56 ～ 91. 2 μg /mL、4. 10 ～ 82. 0 μg /mL、2. 18 ～ 43. 6 μg /mL，1. 53 ～ 30. 6
μg /mL范围内与峰面积呈良好线性关系 (r ＞ 0. 999 0)，它们的平均加样回收率为 98. 5% ～ 101. 4%，ＲSD为 1. 4% ～
2. 8%。结论 5 种苯乙酮成分在 22 min内就能达到完全分离，方法简便易行且稳定可靠。
关键词:断节参;HPLC;苯乙酮类化合物
中图分类号:Ｒ284. 1 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2015)02-0346-04
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2015. 02. 026
Simultaneous determination of five acetophenones from Cynanchum wallichii
Wight by HPLC
MAO Kun-jun， LI Fu-qiang， BAI Gang-gang， LI Xiang* ， CHEN Jian-wei
(Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China)
ABSTＲACT:AIM To establish an HPLC method for simultaneously determining five acetophenones from
Cynanchum wallichii Wight． METHODS The analysis of C． wallichii methanol extract was performed on a Han-
bon-C18 (4. 6 mm × 250 mm，5 μm)with mobile phase consisting of methanol (phase A)-0. 1% acetic acid
(phase B)in a gradient elution manner at the flow rate of 1. 0 mL /min，column temperature was maintained at 30
℃，and the detection wavelength was set at 265 nm． ＲESULTS 2，5-dihydroxy-benzoate、4-hydroxyphenylace-
tic acid、baishouwubenzophenone、2，5-dihydroxyacetophenone、2，4-dihydroxyacetophenone had good linear rela-
tionship (r ＞ 0. 999 0)in the ranges of 2. 66-53. 2 μg /mL、4. 56-91. 2 μg /mL、4. 10-82. 0 μg /mL，2. 18-43. 6
μg /mL，and 1. 53-30. 6 μg /mL，respectively． Their average recoveries were from 98. 5% to 101. 4% with relative
standard deviations ranging from 1. 4% to 2. 7% ． CONCLUSION The HPLC method developed for simultane-
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ous determination of five acetophenones is simple and valid． The separation of measured constituents is completed
in twenty-two minutes．
KEY WOＲDS:Cynanchum wallichii Wight;HPLC;acetophenones
断节参系萝藦科 Asclepiadaceae 鹅绒藤属
Cynanchum Linn． 植物昆明杯冠藤 Cynanchum wall-
ichii Wight的根。主要分布于我国四川、贵州、云
南以及广西等地。其根味甘、微苦，性温，有补肝
肾、强筋骨之功效，主要用于治疗风湿关节炎及肾
虚腰痛、病后体虚、跌打损伤等［1］。为了深入开
发和综合利用断节参，本课题组先对断节参根的化
学成分进行了系统研究，从中分离得到 4 个 C21甾
体苷类化合物和 5 个苯乙酮类化合物，其中 5 个苯
乙酮类化合物均为首次从断节参中分离得到。而现
代药理研究表明苯乙酮类化合物具有神经保护［2］，
降血脂［3］，保护心肌［4］等作用，且紫外吸收强，
HPLC测定时分离度好、干扰较小，可作为断节参
药材控制的指标性成分。故本实验建立断节参中 5
种苯乙酮类化合物的 HPLC定量测定方法。
1 仪器与试药
1. 1 仪器 Waters2695 高效液相色谱仪，包括
Waters2489 型 PDA检测器，Empower工作站 (Wa-
ters公司);AG285 电子天平 (瑞士 Mettler Toledo
公司) ;KQ-2200B 型超声波清洗器 (昆山市超声
仪器有限公司) ;纯水仪 (南京易普易达科技发展
有限公司)。
1. 2 试药 2，5-二羟基苯甲酸甲酯，4-羟基苯乙
酮，白首乌二苯酮，2，5-二羟基苯乙酮，2，4-二羟
基苯乙酮对照品均为实验室自制，经 HPLC 分析纯
度均大于 98%;甲醇、冰醋酸、乙酸乙酯为北京
化工厂产品;水为去离子重蒸水。不同产地断节参
药材来源见表 3。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件 Hanbon-C18色谱柱 (4. 6 mm × 250
mm，5 μm) ，流动相为甲醇 (A)-0. 1%乙酸水
溶液 (B)，梯度洗脱 (0 ～ 7 min，25% ～ 32% A;
7 ～ 25 min，32% ～ 50% A;25 ～ 40 min，50% ～
85% A;40 ～ 45 min，85% ～ 25% A) ;体积流量
1. 0 mL /min，柱温 30 ℃，检测波长 265 nm，进样
量均为 10 μL。
2. 2 溶液制备
2. 2. 1 混合对照品溶液制备 精密称取 2，5-二羟
基苯甲酸甲酯 5. 32 mg，4-羟基苯乙酮 9. 12 mg，
白首乌二苯酮 8. 20 mg，2，5-二羟基苯乙酮
4. 36 mg，2，4-二羟基苯乙酮 3. 06 mg，置 100 mL
量瓶中，加甲醇至刻度，配制成质量浓度分别为
53. 2、91. 2、82. 0、43. 6、30. 6 μg /mL 的混合对
照品溶液，混匀，即得。
2. 2. 2 供试品溶液制备 取断节参根药材，粉碎，
过 60 目筛，精密称取 1. 0 g，置 50 mL 三角瓶中，
精密量取甲醇 10 mL，称定质量，超声处理 30
min，称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，
0. 45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品
溶液。
2. 3 方法学考察
2. 3. 1 专属性考察 按照 “2. 1”项下色谱条件，
吸取对照品溶液、供试品溶液各 10 μL，分别注入
高效液相色谱仪，结果见图 1。表明此条件下 5 种
苯乙酮类化合物分离度好、干扰较小。
1. 2，5-二羟基苯甲酸甲酯 2. 4-羟基苯乙酮 3． 白首乌二苯酮
4. 2，5-二羟基苯乙酮 5． 2，4-二羟基苯乙酮
1. 2，5-dlihydroxy-benzoate 2. 4-hydroxyphenylacetic acid
3． baishouwubenzophenone 4. 2，5-dihydroxyacetophenone
5. 2，4-dihydroxyacetophenone
图 1 混合对照品 (A)和供试品 (B)的 HPLC图谱
Fig. 1 HPLC chromotograms of reference substances
(A)and sample (B)
2. 3. 2 线性关系考察 分别精密吸取 2，5-二羟基
苯甲酸甲酯，4-羟基苯乙酮，白首乌二苯酮，2，5-
二羟基苯乙酮，2，4-二羟基苯乙酮混合对照品溶液
0. 5、1. 0、2. 5、5. 0、10. 0 mL 至 10 mL 量瓶中，
用甲醇定容到 10 mL，离心后取 10 μL 注入高效液
相，按“2. 1”项下色谱条件进行分析，以峰面积
Y对进样量 X进行回归计算，回归方程见表 1。
2. 3. 3 精密度试验 取 “2. 2. 1”项下的混合对
照品溶液，按“2. 1”项下色谱条件分别连续进样
测定 6 次，记录各自的峰面积并计算其 ＲSD 值。
结果 2，5-二羟基苯甲酸甲酯、4-羟基苯乙酮、白首
乌二苯酮、2，5-二羟基苯乙酮、2，4-二羟基苯乙酮
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的 ＲSD 分别 为 1. 1%、1. 1%、1. 5%、1. 4%、
1. 4%。表明仪器精密度良好，能满足定量测定
要求。
表 1 线性关系和线性方程
Tab. 1 Ｒegression equations and correlations of five con-
stituents
对照品
线性范围 /
(μg·mL －1)
线性关系 r
2，5-二羟基苯甲酸甲酯 2. 66 ～ 53. 2 Y = 35 594X + 45 155 0. 999 4
4-羟基苯乙酮 4. 56 ～ 91. 2 Y = 42 807X + 83 005 0. 999 1
白首乌二苯酮 4. 10 ～ 82. 0 Y = 12 647X + 17 872 0. 999 1
2，5-二羟基苯乙酮 2. 18 ～ 43. 6 Y = 29 274X + 36 105 0. 999 3
2，4-二羟基苯乙酮 1. 53 ～ 30. 6 Y = 25 000X + 13 898 0. 999 0
2. 3. 4 稳定性试验 取同一供试品 (云南
120914)溶液，按“2. 1”项下色谱条件分别于 0、
2、4、6、8、10、12 h 进样 10 μL，测定峰面积，
结果 2，5-二羟基苯甲酸甲酯、4-羟基苯乙酮、白首
乌二苯酮、2，5-二羟基苯乙酮、2，4-二羟基苯乙酮
的 ＲSD 分别 为 1. 0%、0. 8%、2. 2%、1. 4%、
1. 5%。表明 5 种苯乙酮在甲醇中 12 h内稳定。
2. 3. 5 重复性试验 取同一批次样品 (云南
120914)6 份，按“2. 2. 2”项下制备供试品溶液，
离心后取 10 μL注入高效液相，记录各自的峰面积
并计算其 ＲSD 值。结果 2，5-二羟基苯甲酸甲酯、
4-羟基苯乙酮、白首乌二苯酮、2，5-二羟基苯乙
酮、2，4-二羟基苯乙酮的 ＲSD 分别为 2. 1%、
0. 9%、2. 3%、2. 2%、1. 8%，表明方法重复性
良好。
2. 3. 6 加样回收率试验 取已知含有量的样品
(云南 120914)1. 0 g，共 6 份，按 1 ∶ 1 的比例加
入对照品，按“2. 2. 2”项下方法进行供试品溶液
的制备，按“2. 1”项下色谱条件进行 5 种苯乙酮
类化合物的 HPLC分析，根据测得量和加入量计算
回收率。结果见表 2。
表 2 加样回收率试验
Tab. 2 Ｒesults of recovery tests (n =6)
取样量
/g
原有量 /
mg
加入量 /
mg
测得量 /
mg
回收率 /
%
平均回
收率 /%
ＲSD /%
2，5-二羟基苯甲 1. 000 0 0. 091 3 0. 090 0 0. 182 3 101. 1 100. 1
酸甲酯 1. 000 8 0. 091 4 0. 090 0 0. 181 0 99. 6 (1. 4)
1. 000 5 0. 091 4 0. 090 0 0. 180 6 99. 1
1. 001 1 0. 091 4 0. 090 0 0. 183 4 102. 2
1. 000 5 0. 091 4 0. 090 0 0. 181 5 100. 2
1. 000 6 0. 091 4 0. 090 0 0. 179 8 98. 2
4-羟基苯乙酮 1. 000 0 0. 208 9 0. 200 0 0. 409 5 100. 3 99. 5
1. 000 8 0. 209 1 0. 200 0 0. 403 1 97. 0 (2. 6)
1. 000 5 0. 209 0 0. 200 0 0. 406 8 98. 9
1. 001 1 0. 209 1 0. 200 0 0. 412 9 101. 9
1. 000 5 0. 209 0 0. 200 0 0. 401 4 96. 2
1. 000 6 0. 209 0 0. 200 0 0. 413 9 102. 4
白首乌二苯酮 1. 000 0 0. 126 7 0. 125 0 0. 246 7 96. 0 98. 5
1. 000 8 0. 126 8 0. 125 0 0. 254 7 102. 3 (2. 8)
1. 000 5 0. 126 8 0. 125 0 0. 251 0 99. 3
1. 001 1 0. 126 9 0. 125 0 0. 248 9 97. 6
1. 000 5 0. 126 8 0. 125 0 0. 245 8 95. 2
1. 000 6 0. 126 8 0. 125 0 0. 252 6 100. 6
2，5-二羟基苯 1. 000 0 0. 081 1 0. 080 0 0. 162 1 101. 3 101. 4
乙酮 1. 000 8 0. 081 2 0. 080 0 0. 163 9 103. 4 (2. 0)
1. 000 5 0. 081 2 0. 080 0 0. 160 4 99. 1
1. 001 1 0. 081 2 0. 080 0 0. 162 9 102. 1
1. 000 5 0. 081 2 0. 080 0 0. 160 3 99. 0
1. 000 6 0. 081 2 0. 080 0 0. 164 1 103. 7
2，4-二羟基苯 1. 000 0 0. 099 4 0. 100 0 0. 195 6 96. 2 98. 9
乙酮 1. 000 8 0. 099 5 0. 100 0 0. 198 8 99. 2 (1. 7)
1. 000 5 0. 099 5 0. 100 0 0. 200 3 100. 8
1. 001 1 0. 099 6 0. 100 0 0. 198 2 98. 7
1. 000 5 0. 099 5 0. 100 0 0. 197 6 98. 1
1. 000 6 0. 099 5 0. 100 0 0. 199 9 100. 4
2. 3. 7 样品测定 称取不同批次样品约 1. 0 g，每
批平行 3 份，按 “2. 2. 2”项下方法制备供试品溶
液，按“2. 1”项下色谱条件进行 5 种苯乙酮类化
合物的 HPLC分析并用外标法一点法计算。结果见
表 3。
表 3 样品测定结果 (mg·g －1，n =3)
Tab. 3 Ｒesults of determination of samples (mg·g －1，n =3)
产地 2，5-二羟基苯甲酸甲酯 4-羟基苯乙酮 白首乌二苯酮 2，5-二羟基苯乙酮 2，4-二羟基苯乙酮
云南 110723 0. 088 3 0. 229 6 0. 134 3 0. 067 2 0. 081 8
广西 121220 0. 098 1 0. 218 5 0. 131 3 0. 083 8 0. 091 3
云南 120914 0. 091 3 0. 208 9 0. 126 7 0. 081 1 0. 099 4
3 讨论
3. 1 指标性成分选择依据 断节参药材中主要含
有 C21甾苷类
［5-6］和苯乙酮类化合物，实验过程中
发现 C21甾苷化合物结构相似，紫外吸收弱，用其
作为对照品进行 HPLC 测定时分离度差、干扰多;
而苯乙酮类化合物也常作为其他药物质量控制指
标［7-9］。故选择苯乙酮类化合物进行 HPLC 定量
测定。
3. 2 供试品制备条件的选择 5 种苯乙酮类化合
物从断节参乙酸乙酯部位分离得到，故本实验主要
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比较了乙酸乙酯和甲醇两种提取溶剂，超声和回流
两种提取方法，30 和 60 min两个提取时间，1 ∶ 10
和 1 ∶ 20 两种料液比。结果显示:甲醇作提取溶剂
苯乙酮类化合物峰面积较大，提取效率更高;超声
和回流提取无明显差异，但超声法操作较方便、简
单;超声 30 min 和 60 min，峰面积无明显差异，
料液比 1 ∶ 10 比 1 ∶ 20 所得峰面积较适中，结果较
稳定。故最终选择甲醇 10 mL、超声 30 min作为供
试品溶液的制备方法。
3. 3 流动相及检测波长的选择 实验比较了甲醇-
水［10］、甲醇-酸水［11］两种流动相，结果发现甲醇-
水系统下，2，5-二羟基苯甲酸甲酯不能达到完全分
离，而在甲醇-酸水系统下，5 种化合物均能达到
基线分离。经 HPLC 全波长扫描发现，5 种苯乙酮
最大吸收波长分别为 260、275、280、256 和 275
nm，综合后取 265 nm下液相图发现 5 种苯乙酮能
达到完全分离，基线稳定，故最终选择 265 nm 作
为检测波长。
4 小结
目前，对于断节参药材的药用，主要作为著名
成药“虎力散”片的组成药之一，用于治疗风湿
麻木，筋骨疼痛，跌打损伤，骨关节炎［12］。初步
证明了断节参药材具有较高的潜在药用价值和经济
市场。但是，断节参药材与近缘种的青阳参、隔山
消药材极其相似［13］，使用容易混乱，影响正常用
药的疗效和安全。因此，非常有必要建立断节参药
材的质量标准，为断节参药材品种鉴定，质量控制
提供可靠依据。本实验所建立的断节参中 5 种苯乙
酮同时测定的 HPLC 方法，目标成分在 22 min 内
就能达到完全分离，方法简单、快速、准确，可初
步作为断节参药材的质量控制方法。
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