全 文 ：槲皮苷 (Quercitrin)　　　　金丝桃苷 (Hypericin)
木犀草苷　　　　　　　　5, 4′-二羟基 -8, 3′-
　　　　(Luteolin-7-O-　　　　　　二甲氧基黄酮 -3, 7-二
　　β -D-lucopyranoside)　　　　　　-O-β -D-葡萄糖苷
　　　　　　　　　　　　　　　　　　(5, 4′-dihydroxy-8, 3′
　　　　　　　　　　　　　　-dimethoxyflavone3, 7-di-O-glyside)
异鼠李素　　　　　　　　　　　　　异鼠李素　　
　　　(Isorhamnetin)　　　　　　　-3, 7-二 -O-β -D-葡萄糖苷
　　　　　　　　　　　　　　　(Isorhamnetin-3, 7-diglucos)
3　讨论
通过药理实验可以证明 ,垂盆草总黄酮是垂盆草中重要的保
肝降酶活性部位之一 ,它能显著降低小鼠血清 ALT和 AST,并有
明显的保护肝脏的作用。化学研究表明 ,垂盆草总黄酮中至少含
有槲皮素 、山柰素 、木犀草素 、苜蓿苷 、槲皮苷 、金丝桃苷 、木犀草
苷 、5, 4′-二羟基 -8, 3′-二甲氧基黄酮 -3, 7-二 -O-β -D-
葡萄糖苷 8种黄酮类化合物。这为确认垂盆草药材的质量控制
指标以及制定科学的质量标准奠定了基础。
　　本项研究的综合意义有:①基本确定了能体现垂盆草内在质
量 、专属性较强的质量控制指标性成分。 ②为垂盆草药材抗病毒
性肝炎的深度开发研究提供了线索 ,创造了条件。 ③为最终建立
起科学而又切实可行的垂盆草药材质量标准奠定了良好的基础。
参考文献:
[ 1 ] 　贺松其 ,吕志平 ,文　彬 ,等.茵陈紫金汤对小鼠四氯化碳急性肝损
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保护作用 [ J] .中医药学报 , 2005, 33(6):22.
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护作用 [ J] .毒理学杂志 , 2006, 20(3):177.
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收稿日期:2009-09-04;　修订日期:2010-03-18
基金项目:重庆市产学研合作技术创新项目(No.104);
重庆医科大学校级科研课题(No.XBYB2008088)
作者简介:张　丹(1979-),女(汉族),陕西渭南人 ,现任重庆医科大学中
医药学院讲师 ,硕士学位 ,主要从事药用植物资源的开发与利用工作.
＊通讯作者简介:曹纬国(1978-), 男(汉族),山东临沂人 , 现任重庆医科
大学中医药学院讲师 ,硕士学位 ,主要从事中药与天然药物质量标准的研
究工作.
西南地区不同居群葎草中
总黄酮与木犀草素的含量分析
张　丹 ,曹纬国＊ ,王　刚
(重庆医科大学中医药学院 ,重庆　401331)
摘要:目的 考察西南地区不同居群葎草中总黄酮和木犀草素的含量。 方法 以芦丁为对照品 , 采用分光光度法测
定葎草中总黄酮的含量;采用反相高效液相色谱法测定葎草中木犀草素的含量 。结果 葎草中总黄酮与木犀草素
的含量在不同居群间差异显著 , 以四川和重庆产含量较高。 结论 该方法适用于葎草的质量分析 , 可以为葎草资源
开发提供参考。
关键词:葎草;　居群;　总黄酮;　木犀草素
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.08.038
中图分类号:R284　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)08-1934-02
　　葎草 Humulusscandens(Lour.)Merr.又名拉拉秧 、拉拉藤
等 , 为桑科葎草属植物 [ 1] ,始载于《唐本草》 ,名为葛葎蔓 , 全草具
有清热解毒 、利尿消肿等功效 , 民间常用来治疗肺结核潮热 、胃肠
炎 、痢疾 、感冒发热 、膀胱炎 、肾盂肾炎 、泌尿系结石 、痔疮等症 , 外
用治疗痈疥肿毒 、湿疹 、虫蛇咬伤等症 [ 2] 。现代研究表明葎草化
学成分复杂 , 具有广泛的生物活性 , 且已从中分离得到木犀草素
和牡荆素多种黄酮类化合物。葎草资源丰富 ,常作为农业杂草被
除去 , 具有较大的开发前景。我们分析比较了西南地区不同居群
葎草中总黄酮与木犀草素的含量 ,研究葎草的质量控制方法以及
不同居群间葎草有效成分的含量变异 ,为促进葎草资源的开发利
用奠定基础。
1　仪器与试药
1.1　仪器 岛津 LC-2010A高效液相色谱仪 , CLASS-VP色谱
·1934·
时珍国医国药 2010年第 21卷第 8期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2010VOL.21NO.8
工作站 , 龙尼柯 UV-2102PC紫外可见分光光度计 , Milipore溶
剂过滤系统 , METIERTOLEDOAG204万分之一电子分析天平。
1.2　试药 芦丁 、木犀草素对照品由中国药品生物制品检定所
提供 , 甲醇为色谱纯 ,水为重蒸水 ,其余所用试剂均为分析纯。实
验样品经本校中药教研室王刚副教授鉴定为葎草。
2　方法和结果
2.1　 木犀草素的含量测定 [ 3 , 4]
2.1.1　高效液相色谱条件 色谱柱为 C18柱(5 μm, 250 mm×
4.6 mm);流动相为甲醇 -2%醋酸(50∶50);检测波长 350 nm;
流速 1.0 ml· min-1;柱温为室温;进样量 20 μl, 理论塔板数按木
犀草素计不低于 4 000, 高效液相色谱图见图 1。
A-对照品　B-葎草　a-木犀草素
图 1　样品高效液相色谱图
2.1.2　对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的木犀草素
6.5 mg,置 50ml容量瓶中 , 加 80%乙醇溶解并定容 , 摇匀 , 即得
对照品储备溶液。
2.1.3　样品溶液的制备 将不同居群葎草样品粉碎 , 过筛(40
目),精密称取葎草细粉 4 g, 置 100 ml圆底烧瓶中 ,加 80%乙醇
50 ml,加热回流 2h,过滤 , 滤液蒸干后 ,加 2%H2SO4 50ml,酸水解
1 h, 放冷后 ,分别用 40 , 40, 20 ml的醋酸乙酯萃取 3次 , 合并萃
取液 , 回收醋酸乙酯至浸膏。浸膏用 80%乙醇 50 ml溶解 , 过滤 ,
取续滤液 10ml作为供试品溶液。
2.1.4　线性关系考察 精密量取木犀草素对照品溶液适量 ,加
80%乙醇制成系列标准溶液 , 进样测定。以色谱峰面积 A对进样
量 M(μg)进行线性回归 , 结果表明木犀草素在进样量范围内线
性关系良好 , 线性范围为 0.26 ～ 2.6 μg, 回归方程为 A=3 888
216M-538 639,回归系数 0.999 3。
2.1.5　精密度实验 在上述色谱条件下 , 精密吸取木犀草素照
品溶液 , 进样 20μl,重复进样 6次 ,测得峰面积的 RSD为 1.22%,
表明精密度良好。
2.1.6　稳定性实验 在上述色谱条件下 , 精密吸取同一供试品
溶液 20 μl, 分别间隔 2 h进样 , 重复 5次 , 并测定峰面积 , 计算
RSD为 1.83%。
2.1.7　重复性实验 对同一批样品按样品溶液的制备方法平行
制备 6份 , 分别进样 20 μl,依照样品测定方法测定 , 并计算 RSD
为 2.17%。
2.1.8　加样回收率实验 取已知木犀草素含量的葎草样品细粉
9份 ,每份约 0.2 g, 精密称定 , 分别精密加入高 、中 、低 3个质量
浓度的木犀草素对照品溶液适量 ,按照 “ 2.1.3”项下方法制备供
试品溶液 , 同一质量浓度制备 3份 ,并在上述色谱条件下测定 ,结
果平均加样回收率为 98.9%, RSD为 1.45%。
2.1.9　样品测定 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各
20 μl, 按上述色谱条件进行测定 , 以外标法计算样品中木犀草素
的含量。结果见表 1。
2.2 　总黄酮的含量测定 [ 5]
2.2.1　芦丁对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的无水芦
丁 8.1mg,置于 50ml容量瓶中 ,加 80%乙醇溶解并稀释至刻度 ,
摇匀即得。
2.2.2　供试品溶液的制备 将不同居群葎草样品粉碎 , 过筛
(40目),精密称取葎草细粉 0.8 g,置索氏提取器中 , 加石油醚
100 ml, 加热回流至提取液无色 , 弃去石油醚提取液。待药渣挥
干后 , 置烘箱中 60℃干燥 1 h, 然后转移至具塞锥形瓶中 , 精密加
入 80%乙醇 100 ml,密塞 , 称定重量 , 超声 60 min, 放冷再称定重
量 , 用 80%乙醇补足减失的重量 , 摇匀 , 滤过 , 取续滤液作为供试
品溶液 。
2.2.3　测定波长的选择 取芦丁对照品溶液和供试品溶液各 2
ml, 分别置于 25 ml容量瓶中 , 各加入 80%乙醇 6 ml,加入 2%三
氯化铝溶液 0.5 ml, 摇匀 , 再加 80%乙醇至刻度 , 即得芦丁对照
品三氯化铝溶液和供试品三氯化铝溶液 , 放置 60 min显色 , 在
200 ～ 600 nm波长范围内扫描。结果表明 , 芦丁对照品和葎草样
品溶液均在 410 nm处有较大吸收 , 因此选 410 nm为测定波长。
2.2.4　线性关系考察 精密量取芦丁对照品溶液 0, 0.5, 1.0,
1.5, 2.0, 2.5, 3.0 ml, 分别置于 25ml容量瓶中 , 各加 80%乙醇至
8ml, 加入 2%三氯化铝溶液 0.5 ml,摇匀 , 再加 80%乙醇至刻度 ,
放置 60 min显色 , 以第 1瓶溶液作为空白 , 在 410nm处测定各溶
液的吸收度 ,以吸收度 A为纵坐标 , 浓度 C为横坐标 , 得回归方
程:A=0.025 4C+0.007 5, r=0.999 1,线性范围为 3.24 ～ 19.44
μg· ml-1。
2.2.5　精密度实验 精密吸取同一对照品溶液 6份置于 25 ml
容量瓶中 , 分别按照 “ 2.2.4”项下方法处理显色 , 在 410 nm处测
定吸收度 ,结果测得吸收度的 RSD为 1.67%。
2.2.6　稳定性实验 精密吸取供试品溶液 2 ml置于 25ml容量
瓶中 , 按照 “ 2.2.4”项下方法处理显色 , 分别于 0, 30, 60, 90,
120min测定吸收度 , 结果吸收度的 RSD为 2.26%, 表明样品溶液
在 2 h内基本稳定。
2.2.7　 重复性实验 取同一批葎草样品细粉 6份 ,每份分别按
照 “ 2.2.2”项下方法制备供试品溶液 , 分别精密吸取 2ml置于 25
ml容量瓶中 ,按照 “ 2.2.4”项下方法处理显色 , 于 410 nm处测定
吸收度 ,结果测得吸收度的 RSD=2.39%。
2.2.8　加样回收率实验 取已知总黄酮含量的葎草细粉 6份 ,
每份约 1 g, 分别精密加入芦丁对照品溶液适量 , 按照 “ 2.2.2”项
下方法制备供试品溶液 , 分别精密吸取 2 ml置于 25 ml容量瓶
中 , 按照 “ 2.2.4”项下方法处理显色 ,于 410nm处测定吸收度 , 计
算加样回收率 ,结果平均加样回收率为 98.7%, RSD=2.08%。
2.2.9　样品的测定 精密吸取供试品溶液 2 ml置于 25ml容量
瓶中 , 加 80%乙醇至 8 ml, 加入 2%三氯化铝溶液 0.5 ml, 摇匀 ,
再加 80%乙醇至刻度 ,放置 60 min显色 ,于 410 nm处测定吸收
度 , 并计算葎草中总黄酮的含量。结果见表 1。
表 1　样品测定结果 mg· g-1
样品 总黄酮 木犀草素
重庆沙坪坝 24.24 1.07
重庆秀山 22.33 0.99
贵州道真 22.67 0.71
贵州遵义 20.83 0.63
四川成都 23.41 1.02
四川南充 24.45 0.98
云南大理 17.56 0.51
云南昆明 19.39 0.46
3　讨论
近年来研究发现葎草具有多种引人注目的药理活性 ,特别具
有较强的抑菌抗炎作用等。 葎草生态适应性广 ,在我国除新疆 、
青海之外 , 南北各省均有分布 , 资源量巨大 , 有巨大的资源优势。
通过对西南地区不同居群葎草中黄酮类成分分析发现 ,葎草中总
黄酮和木犀草素含量普遍较高 ,具有一定的开发价值。
本实验结果表明 ,不同居群葎草中黄酮类化合物的含量存在
差异 , 包括同一产地的不同居群也存在差异 , 表明除环境因素外 ,
居群遗传多样性也可能是造成药用植物中有效成分含量差异的
原因。
·1935·
LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2010VOL.21NO.8 时珍国医国药 2010年第 21卷第 8期
本实验所建立方法可以快速检测葎草中总黄酮与木犀草素
的含量 , 并对不同居群葎草中黄酮类化合物含量进行了比较 ,为
葎草资源的深度开发提供了参考。
参考文献:
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收稿日期:2009-10-17;　修订日期:2010-03-10
基金项目:浙江省中医药管理局资助项目(No.2008CA001)
作者简介:朱振洪(1971-),男(汉族),湖北武穴人 ,现任浙江中医药大学
生物工程学院助理研究员, 在职博士研究生 ,硕士学位 , 主要从事中药分
子遗传学研究工作.
道地药材浙玄参的随机扩增多态性 DNA研究
朱振洪 ,万海同 ,余　勤 ,刘文洪 ,韩　进
(浙江中医药大学生物工程学院 , 浙江 杭州　310053)
摘要:目的 探讨道地药材浙玄参与非道地药材之间遗传变异大小 ,并建立道地药材浙玄参的品质鉴定方法。方法 运用
随机扩增多态性 DNA(RAPD)法对产于浙江 、山东 、湖北的玄参科植物玄参进行了分子标记研究。结果 共筛选出 9条有
效引物 , 获得 142条 DNA带 ,通过聚类分析 , 构建 DNA分子系统树图 ,确定不同居群间的亲缘关系。结论 同种异地药材
所形成的不同居群 , 具有不同的遗传多样性特征。其中浙玄参与山东 、湖北玄参存在较大遗传差异 ,说明浙玄参作为道
地药材 , 具有自身独特的遗传特征。
关键词:道地药材;　玄参;　随机扩增多态性 DNA;　聚类分析
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.08.039
中图分类号:R282.5;R75　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)08-1936-02
　　玄参别名元参 、黑参 、浙玄参 ,为玄参科植物玄参 Scrophular-
iuningpoensisHemsl.的干燥根 , 具有滋阴降火 、解毒之功效。主
产于浙江 , 另外在山东 、湖北 、四川 、陕西等也有栽培。其中以浙
江产玄参为道地药材 , 为著名的 “浙八味”之一。由于该药材品
种多 、产区广 ,单纯地依赖形态分类 、组织学或化学指纹如高效液
相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)等难以区别 [ 1] 。现代分子生物
学研究表明 , 中药材生物资源的多样性是由于其基因多态性导致
的 [ 2] 。为从基因角度揭示 “道地”药材的生物学本质 , 本文采用
RAPD技术分别对来源于浙江 、山东 、湖北产地的玄参进行遗传
多样性研究 , 旨在为道地药材浙玄参的药材鉴定 、栽培繁育 、质量
评价提供依据。
1　材料与仪器
1.1　供试植物材料 分别采于浙江临安 、湖北恩施 、山东青州等
地。取新鲜健壮嫩叶置液氮罐中 , 带回实验室 -70℃冰箱中保
存。
1.2　DNA提取试剂 提取缓冲液:100 mmol/LTris-HCl
(pH8.0), 50 mmol/LEDTA(pH8.0), 500 mmol/LNaCl, 10
mmol/Lβ -巯基乙醇。 20% SDS, 5 mol/LKAc, 10 mg/ml
RNaseA, 异丙醇 ,灭菌水等。
1.3　PCR试剂 10核苷酸随机引物由上海生工生物工程公司合
成 , 共 70条(序列编号分别为:S1 ～ S40, S71 ～ S90, S111 ～ S120);
DNA聚合酶 、Buffer等为 MBI公司产品。
1.4　仪器 SIGMA3K-15高速冷冻离心机 , PCR仪(Biometra
personal, Germany),琼脂糖电泳仪和凝胶成像系统为上海天能科
技有限公司产品。
2　方法
2.1　基因组 DNA提取方法 采用改良 SDS法提取基因组 [ 3] , 具
体操作如下:取 1 g叶片 ,剪碎后加入适量 PVP, 一起于液氮中研
磨成粉。转移粉末到加有 500 μl提取缓冲液的离心管中 , 轻轻
混匀 , 使粉末充分散开。 加入 50 μl20 %SDS溶液 , 混匀后于
65℃水浴中保温 10 ～ 15 min(间断晃动 2 ～ 3次)。加入 150 μl
5mol/LKAc, 混匀 , 置冰上 20 ～ 30 min。 4℃ 12 000 r/min离心
15 min。上清液转入新离心管中 , 加入等体积的氯仿 -异戊醇 ,
轻轻颠倒混匀。 4℃ 12 000 r/min离心 15 min, 上清液转入另一
离心管中 , 加入 2/3体积预冷的异丙醇 , -20℃放置 30 min。 4℃
12 000r/min离心 15 min, 弃上清液 , 沉淀自然晾干后加入 50μl
TE缓冲液溶解 , 并加入 10 mg/mlRNA酶 1μl, 于 37℃保温 1 h。
电泳检测基因组的完整性。
2.2　引物筛选及 PCR方法 [ 4] 首先进行随机引物的筛选 , 10核
苷酸随机引物购自上海生工(编号分别为:S1 ～ S40, S71 ～ S90,
S111 ～ S120), PCR反应体为:10 ×PCRbuffer2.5 μl, 25mmol/L
MgCl2 3μl, 2.5mmol/L4dNTP1.5μl, 引物(0.5μmol/L)1μl,
模板 DNA(100 ng)1 μl, Taq聚合酶(5U/ μl)0.5 μl, 补加双蒸
水至 25μl。 PCR仪的反应条件为:94℃预变性 3min, 94℃变性
45 s, 36℃退火 45 s, 72℃延伸 1 min, 共 44个循环 , 72℃保温 7
min。PCR结束后用 1.2%的 Agrose进行电泳分析结果。
2.3　RAPD数据分析 [ 5] 按琼脂糖凝胶同一位置上 DNA带的有
无进行统计 , 有带(包括弱带)记为 “ 1” , 无带记为 “ 0” 。利用
NTSYS(2.10e)软件对 RAPD电泳结果进行聚类分析。计算出各
物种之间的遗传距离 ,并构建 DNA分子系统树。
3　结果
3.1　改良 SDS法提取植物基因组 DNA 植物基因组抽提方法常
用的有 CTAB法和 SDS法 ,植物中的主要矛盾是粉碎破壁困难和
糖类的影响 ,所以一般采用阳性表面活性剂的方法。最常用的就
是 CTAB和 SDS。但 CTAB的表面活性比 SDS差 , 所以本实验采
用改良 SDS法 ,其基本原理是研磨的组织细胞用热的 SDS裂解
后 , 加入高浓度的 KAc, 0℃放置以除去蛋白和多糖类杂质 , 最后
用异丙醇沉淀。 用琼脂糖凝胶电泳(0.8%)检测 , 发现基因组
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时珍国医国药 2010年第 21卷第 8期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2010VOL.21NO.8