全 文 ：热带农业科学
中国农学通报 第24卷 第5期 2008年 5月
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黄秋葵，英文名为Okra，别名秋葵、黄葵、补肾草、
咖啡黄葵、羊角菜、羊角豆（广东）、越南芝麻（湖南）、洋
辣椒（福建）等，在植物分类上属锦葵科（Malvaceae）秋
葵属（Abelmoschus）一年生（热带地区为多年生）草本
植物，是世界上一种重要的蔬菜资源。现世界各地均有
栽培，以热带及亚热带地区种植最为普遍。黄秋葵为
菜、药、花兼用型植物，其用途颇为广泛。目前，中国在
黄秋葵的细胞学、引种和栽培技术等研究上取得了一
系列的成果，但在种质资源的遗传多样性研究方面几
乎是空白。因此，开展黄秋葵品种的遗传多样性及亲缘
关系的研究对黄秋葵品种的鉴定、选育及利用很有必
要，同时对秋葵属植物的分类提供借鉴。
ISSR标记技术是由Zietkiewic等于1994年提出
来的 [1]。其原理是用锚定的微卫星DNA为引物，在
SSR序列的3’端或5’端加上2～4个随机核苷酸，在
PCR反应中，锚定的引物可以引起特定位点退火，导
致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA
片段进行PCR扩增。所扩增的inter-SSR区域的多个
条带通过琼脂糖凝胶电泳或 PAGE电泳得以分辨。
ISSR标记为显性标记，可以揭示整个基因组的一些特
基金来源：海南省自然科学基金（30508）。
第一作者简介：黄捷，1982年出生，男，广西大化县人，硕士，主要从事植物资源开发与利用研究。通信地址：571737海南省儋州市宝岛新村热带作物
品种资源研究所研究生自修室。E-mail：huangjie710@163.com。
通讯作者：刘国道，1963年出生，男，云南腾冲县人，研究员，博士生导师，主要从事热带牧草及饲料作物种质资源与创新利用。主要著作有《中国热带
饲用植物资源》、《海南饲用植物志》等。通信地址：571737海南省儋州市宝岛新村热带作物品种资源研究所。E-mail：liuguodao@scuta.edu.cn。
收稿日期：2008-02-29，修回日期：2008-03-10。
16份黄秋葵种质的ISSR分析
黄 捷 1,2,陈晓斌 2,叶花兰 2,刘国道 1,2
（1中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南儋州571737；2海南大学农学院，海南儋州571737）
摘 要:对 Owayadei(AbelmoschusesculentusL.)、Ladiesfinger(AbelmoschusesculentusL.)、golderkost
(AbelmoschusesculentusL)、Esoyarido(AbelmoschusesculentusL.)等16份国外黄秋葵栽培种质进行
ISSR分析,结果表明,选用14条引物扩增出162个DNA片段,平均每个引物可扩增出11.6条片段,其
中多态性片段102个,占扩增总片段的62.96%。利用扩增结果进行遗传距离分析,构建了分子树状图,
可以把16份材料划分为4个类群。
关键词:黄秋葵;ISSR;聚类分析
中图分类号:Q314 文献标识码:A
TheISSRAnalysisof16OkraResources
HuangJie1,2,ChenXiaobin2,YeHualan2,LiuGuodao1,2
（1TropicalCropGeneticResourcesInstitute,CATAS,Danzhou,Hainan571737;
2ColegeofAgriculture,HainanUniversity,Danzhou,Hainan571737）
Abstract:SixteenCitrusresources,includingOwayadei（AbelmoschusesculentusL.）,Ladiesfinger（Abel-
moschusesculentusL.）,golderkost（AbelmoschusesculentusL.）,Esoyarido（AbelmoschusesculentusL.）
havebeenanalysedbyusinginter-simplesequencerepeat(ISSR),andtheresultsshowthat162patern
bandsresultsfrom16materialsISSR-PCRbyamplifying14primers.Amongwhich102(62.96%)were
polymorphic.TheaveragenumberofDNAbandsamplifiedbyeachprimerwas11.6.Basedontheresultsof
amplifying,thegeneticdistancewasanalyzed,atreediagramwasconstructedbyusingUPGMAalgorithm.
The16Okragermeswereclassifiedinto4group.
Keywords:Okra,ISSR,clustergroups
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征，符合孟德尔遗传规律，具有稳定性好，多态性高，试
验操作简单、快速、用时少等优点，因此该技术一问世
就被广泛应用于植物的的遗传多样性研究。2001年，
武耀廷等[2]利用ISSR分子标记检测了陆地棉栽培品
种间的遗传多样性，确定的遗传关系基本上与品种系
谱的种质系统一致。2003年，S.Ghariani等[3]利用IS-
SR分子标记对 18份突尼斯多年生黑麦草进行了研
究，发现其存在高度的遗传多样性，并揭示了栽培种
与野生型之间的高度分化及复杂的驯化过程。同年，
Huang等[4]用 ISSR技术分析了番薯属植物的遗传多
样性，发现其中存在丰富的多态性。2005年，陶爱芬等[5]利
用ISSR技术分析了红麻优异种质的遗传多样性及亲
缘关系。2006年，何桥等[6]用ISSR技术对12份莲雾
资源和2个莲雾野生近缘种进行分析，发现其聚类分
析结果与传统分类学上的划分结果一致。本试验采用
ISSR分子标记技术，初步分析了16个黄秋葵品种的
遗传多样性，为进一步的黄秋葵种质鉴定研究作些前
期探索。
1材料与方法
1.1材料
中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所提
供16份黄秋葵种质（表1），2007年8月在品资所牧草
基地进行育苗，待长出2～3片真叶时采摘其嫩叶，带
回实验室置于-70℃冰箱保存。
1.2主要仪器和试剂
Eppendorf核酸蛋白分析仪；sigama2-16K高速冷
冻离心机；BiometraPCR仪；Uvidoc凝胶成像系统；
Biometra电泳仪；CTAB、Tris碱、EDTA、PVP、Agrose、
100bpDNALadderMarker均购于大连宝生物；2×Taq
PCRMasterMix（北京天根）；ISSR引物是根据British
Columbia大学公布的引物序列，由上海生工公司合成
22条引物，从中筛选出14条扩增条带较多、信号强、
背景清晰的引物用于ISSR-PCR反应（见表2）。
1.3DNA提取
参照DolyeJJ，DoyleJL.等[12]的方法，利用改良的
CTAB法提取黄秋葵的总DNA，用1.0%琼脂糖凝胶
电泳检测质量，用核酸蛋白分析仪检测DNA的浓度
和纯度，并用无菌水稀释到相同浓度置于4℃冰箱备
用。
1.4PCR扩增及电泳
PCR反应体系为15.0μl，其中包括：模板DNA
1.0μl（50ng）；ISSR引物 1.0μl（100nmol/μl）；2×Taq
PCRMasterMix10.0μl；ddH2O3.0μl。反应程序为：
94℃2min变性一个循环；94℃解链 45s，51℃或 53℃
退火 1min，72℃延伸 90s，共 38个循环；接着 72℃延
伸5min；最后于4℃短期保存，扩增重复2次。PCR产
物经1.5%琼脂凝胶（0.5×TBE缓冲系统）电泳分离。电
泳条件为：取样5μl，0.5×TBE缓冲液，1.5%的琼脂糖
表1供试材料来源
序号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
种质编号（名称）
B012（Clemsonsplneless）
024-1
013-1
K7
028×
04
K1
001×
010-2
B020
007-1（Owayadei）
005-2
014（Ladiesfinger）
004-2（golderkost）
SLK-2
008（Esoyarido）
拉丁文名
AbelmoschusesculentusL.
AbelmoschusesculentusL.
AbelmoschusesculentusL.
AbelmoschusesculentusL.
AbelmoschusesculentusL.
AbelmoschusesculentusL.
AbelmoschusesculentusL.
AbelmoschusesculentusL.
AbelmoschusesculentusL.
AbelmoschusesculentusL.
AbelmoschusesculentusL.
AbelmoschusesculentusL.
AbelmoschusesculentusL.
AbelmoschusesculentusL.
AbelmoschusesculentusL.
AbelmoschusesculentusL.
来源
美国
亚蔬中心
巴西
孟加拉
日本
日本
日本
美国
日本
埃及
日本
斯里兰卡
孟加拉
埃及
斯里兰卡
日本
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凝胶（其中含有GoldView染色剂），120V的电泳电压
电泳1h。电泳完毕后在Uvidoc凝胶成像系统上观测
照相。
1.5数据统计
ISSR扩增产物以0、1统计建立ISSR数据库。同
一引物、同一位点，按其扩增产物的有（1）无（0）得到二
元资料，形成0，1距阵，利用NTSYS2.1统计软件的
UPGMA法构建品种之间的分子系统树，并计算品种
间的遗传相似系数(遗传距离)。
2结果与分析
2.1黄秋葵DNA扩增结果
用筛选的14个ISSR引物对16份种质进行PCR
扩增，得到了16份种质的PCR产物图（见图1）。14条
引物共扩增出162条DNA片段，平均每条引物扩增
出11.6条片段，其中多态性片段102个，占扩增总片
段数的 62.96%（见表 2）。扩增的片段大小主要在
100～2000bp之间。不同引物扩增出来的片段数不同，
其中840号引物扩增出的DNA片段最多，共18条；
图1用ISSR825引物扩增的ISSR-PCR产物图
表2用于ISSR分析的14条引物及其扩增产物
Y=(C,T)；B=(C,G,T)(i.e.notA)；D=(A,G,T)(i.e.notC)；H=(A,C,T)(i.e.notG)；V=(A,C,G)(i.e.notT)
引物编号
809
811
823
825
829
830
840
841
842
846
884
887
889
891
合计
序列
(AG)8G
(GA)8C
(TC)8C
(AC)8T
(TG)8C
(TG)8G
(GA)8YT
(GA)8YC
(GA)8YG
(CA)8RT
HBH(AG)7
DVD(TC)8
DBD(AC)8
HVH(TG)7
退火温度
53℃
53℃
53℃
53℃
53℃
53℃
50℃
53℃
53℃
53℃
53℃
50℃
50℃
50℃
扩增条带数
6
16
12
16
7
15
18
14
12
11
7
8
10
10
162
多态性带数
3
12
10
15
2
10
11
12
10
9
-
3
2
3
102
多态性比率
50.00%
75.00%
83.33%
93.75%
28.57%
66.67%
61.11%
85.71%
83.33%
81.82%
-
37.50%
20.00%
30.00%
62.96%
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M
2000bp
1000bp
750bp
500bp
250bp
100bp
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809号引物扩增的DNA片段最少，只有6条。825号
引物扩增出来的 DNA片段多态性比率最高，达到
93.75%，而884号引物扩增出的DNA片段没有多态
性。在这14条引物中（GA）n有4条，（TG）n有3条，
说明黄秋葵基因组中存在大量的（GA）、（TG）二核苷
酸重复序列。从图1可以看出，仅用一条引物就可以将
16份黄秋葵种质基本区分开来，说明黄秋葵种质间的
遗传多样性十分丰富，利用ISSR分子标记可以检测黄
秋葵种质间的亲缘关系。
2.2聚类分析
16份黄秋葵种质间的分子树状图如图2所示。从
树状图可以看出，在阀值为0.81时所有材料可以明显
的划分为4个类群。第I类群有3份种质，包括B012
（美国）、024-1（亚蔬中心）和013-1（巴西）。第I类群含
有 6份种质，包括 K7（孟加拉）、K1（日本）、028×（日
本）、010-2（日本）、001×（美国）和04（日本）。第II类
群含有4份种质，包括B020（埃及）、005-2（斯里兰
卡）、007-1（日本）和014（孟加拉）。第IV类群含有3
份种质，包括 004-2（埃及）、SLK-2（斯里兰卡）和 008
（日本）。各类群之间的遗传差异并不明显，第I类群与
第IV类群遗传相似度有84%；第I类群与第II类群
有81%的遗传相似度，而群内各亚群之间的遗传差异
较大。
2.3亲缘关系分析
基于ISSR扩增所产生的162条DNA片段，获得
了16份黄秋葵种质的遗传相似系数矩阵（表3）。从表
3可以看出，K1和K7两份种质之间的遗传相似系数
最大，为0.920，表明亲缘关系最近；而014与B012两
份种质之间的遗传相似系数最小，为0.679，表明亲缘
关系最远，这与进行聚类分析所得的分子树状图的结
果一致。计算得出平均遗传相似系数为0.788。
3讨论与结论
3.1基因组DNA的PCR扩增
用筛选出的 14条引物对 16份黄秋葵进行 PCR
扩增共得到162个DNA片段，多态性片段102个，占
62.96%，表明黄秋葵的遗传多样性是比较丰富的。其
中引物840扩增的DNA片段最多，而引物809扩增
的DNA片段最少，仅从中筛选出的引物825就可以
把16份黄秋葵品种基本区分开。
3.2亲缘关系分析
从构建的分子树状图及遗传相似系数矩阵可以看
出，K1和K7两份种质之间的亲缘关系最近；而014
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024-1
1.000
0.846
0.864
0.821
0.778
0.833
0.802
0.759
0.772
0.704
0.753
0.704
0.772
0.716
0.735
013-1
1.000
0.858
0.778
0.809
0.827
0.759
0.765
0.741
0.710
0.747
0.697
0.741
0.722
0.728
K7
1.000
0.858
0.852
0.920
0.827
0.821
0.796
0.765
0.815
0.716
0.796
0.790
0.784
028×
1.000
0.796
0.876
0.772
0.839
0.827
0.772
0.809
0.796
0.765
0.809
0.778
004
1.000
0.833
0.765
0.809
0.747
0.741
0.790
0.716
0.759
0.790
0.745
K1
1.000
0.870
0.864
0.839
0.809
0.858
0.747
0.839
0.846
0.815
001×
1.000
0.833
0.796
0.741
0.778
0.704
0.846
0.790
0.772
012-1
1.000
0.839
0.796
0.821
0.759
0.790
0.821
0.790
B020
1.000
0.821
0.883
0.821
0.765
0.821
0.778
007-1
1.000
0.876
0.790
0.747
0.852
0.784
005-2
1.000
0.815
0.809
0.864
0.796
014
1.000
0.710
0.790
0.772
004-2
1.000
0.858
0.815
SLK-2
1.000
0.858
008
1.000
表316份黄秋葵种质的遗传相似系数矩阵
品种
B012
024-1
013-1
K7
028×
004
K1
001×
010-2
B020
007-1
005-2
014
004-2
SLK-2
008
B012
1.000
0.901
0.846
0.864
0.784
0.827
0.846
0.790
0.772
0.747
0.741
0.753
0.679
0.772
0.728
0.735
与B012两份种质之间的亲缘关系最远。不同的地理
分布其亲缘关系所表现出的差异有时并不明显，而来
源相同的种质之间的亲缘关系有时相差很大，表明黄
秋葵种质间的的遗传关系复杂，很大程度上是由于引
种的原因造成的。
3.3ISSR的扩增反应
ISSR对PCR反应的敏感性比RAPD低，但其比
RAPD更能反映出物种的多态性，重复性好。ISSR扩
增反应的稳定性受到Taq酶、引物浓度及其退火温度、
Mg2+浓度、模板浓度等的影响。因此，其反应体系仍需
不断优化，以得出更清晰的条带。在扩增效果较差或扩
增产物差异不明显的情况下，可以采用含有Taq酶、
Mg2+、dNTPs及稳定剂和增强剂的混合PCR试剂来进
行PCR扩增，这样可以大大缩短优化反应体系的时间
和减少不稳定引起的差异，或者组合使用上述引物，扩
增出更多的带型指纹，从而提高供试材料间的差异检
测能力。
黄秋葵作为一种重要的热带蔬菜，其遗传多样性
研究目前在国内未见报道，国外研究开展较多。2003
年，Bendale,V.W.等[20]通过形态学标记对30份黄秋葵
种质进行分析，结果将30份种质划分为 6个组群。
2003年，GilmarE.等[21]采用 RAPD标记技术对 43份
黄秋葵种质进行了遗传多样性分析。2006年，Osman
Gulsen等[22]利用SRAP标记技术对土耳其23份黄秋
葵种质进行遗传多样性及亲缘关系研究。而ISSR标
记技术在黄秋葵的遗传多样性研究中的应用目前在国
内外还未见报道。本试验的结果表明，ISSR技术是一
种研究黄秋葵遗传多样性的有效和实用的工具，能够
检测到较高的多态性，而且操作简单，耗时少，所得到
的多态性信息对于黄秋葵品种的识别，杂交育种组合
亲本的选择及种质的开发利用都有很大的应用价值。
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