全 文 ：第3 1卷第1期
2 0 1 0 年 1 月
西 安 交 通 大 学 学 报 (医 学 版 )
Journal of Xian Jiaotong University(Medical Sciences)
Vol.31 No.1
Jan.2010
葎草花粉主要变应原核酸疫苗 pcDNA3.1-LC2的
构建及其免疫原性鉴定
张永红 ,孙秀珍 ,刘 昀 ,徐 晶
(西安交通大学医学院第二附属医院呼吸科 , 陕西西安 710004)
摘要:目的 构建葎草花粉主要变应原核酸疫苗 pcDNA-LC2 并鉴定其免疫原性。 方法 将 pT ripIEx2-LC2 质粒用
EcoRⅠ和 H indⅢ双酶切得到 LC2 葎草花粉变应原基因片段 , 将其插入 pcDNA3.1(-)真核表达载体 , 在鉴定重组质
粒构建成功后 , 大量制备去内毒素核酸疫苗 pcDNA3.1-LC2 ,应用 pcDNA3.1-LC2 核酸疫苗免疫小鼠 , 取免疫血清行
双向免疫扩散实验 , 分析其免疫原性。结果 通过测序确认构建 pcDNA3.1-LC2 中的 672 bp的编码框碱基与原序列
一致 ,没有突变及缺失。应用 pcDNA3.1-LC2 免疫 BALB/ c小鼠 , 经双向免疫扩散试验验证 pcDNA3.1-LC2 在小鼠
体内可以表达并产生特异性抗体。结论 成功的构建了葎草花粉主要变应原核酸疫苗 pcDNA3.1-LC2 , pcDNA3.1-
LC2 可在小鼠体内表达 , 并能产生葎草花粉变应原特异性抗体 , 具有良好的免疫原性。
关键词:支气管哮喘;葎草花粉变应原;核酸疫苗
中图分类号:R562.25 文献标志码:A 文章编号:1671-8259(2010)01-0051-03
Construction of humulus scandens pollen major allergen
pcDNA3.1-LC2 DNA vaccine and study of
its immunogenicity in mice
ZHANG Yong-hong , SUN Xiu-zhen , Liu Yun , XU Jing
(Department o f Respirato ry M edicine , the Second Aff iliated Hospital ,
Medical School of Xian Jiao tong U niversi ty , Xian 710004 , China)
ABSTRACT:Objective To construct humulus sc andens pollen major allergen DNA vaccine pcDNA-LC2 and
evaluate its immunogenicity.Methods Humulus scandens pollen allergen gene was digested from recombinant
plasmid pTripIEx2-LC2 by Eco RⅠ and Hin dⅢ of r estr iction endonucle ase , and then inser ted into expression vec tor
pcDNA3.1(-).A large amount of endotoxin pcDNA3.1-LC2 purified plasmid was extr acted af ter successful
constr uction , and animal exper iment was car ried out to study its immunocompetence.Results Sequencing r esults
showed tha t 672 bp in the coding sequence of fr ames of r ecombinant pcDNA3.1-LC2 was in line with the or iginal
base line , without deletion or mutation.pcDNA3.1-LC2 of pollen allergen humulus scandens alle rgen vaccinated
BALB/ c mice.Double immunodif fusion test showed tha t pcDNA3.1-LC2 could be expressed and produce antibodies
in m ice.Conclusion H umulus scandens gr ass pollen major allergen DNA vaccine pcDNA3.1-LC2 has been
successfully constructed.I t can be expressed in mice , produces humulus sc andens grass pollen allergen specific
antibody and has a good immunogenicity.
KEY WORDS:asthma;humulus scandens gr ass pollen alle rgen;DNA vaccine
收稿日期:2009-05-10 修回日期:2009-09-15
基金项目:国家自然科学基金资助项目(No.30772010)
Suppo rted by the Nat ional Natural Science Foundat ion of
China (No.30772010)
通讯作者:孙秀珍 ,教授.E-mail:doc-ly @sohu.com
作者简介:张永红(1981-)男(汉族), 硕士.研究方向:哮喘的特异性
治疗与免疫机制的研究.
E-mail:zhangy ong hong@stu.xjtu.edu.cn
支气管哮喘是全球最常见的慢性疾病之一 ,而过
敏性哮喘则是临床上最常见的哮喘类型。过敏性哮
喘通常由吸入变应原或食入变应原后诱发 。诱发哮
喘的物质很多 ,如花粉 、尘螨 、霉菌 、动物皮毛等 ,其中
葎草花粉是夏秋季最重要的吸入性变应原之一。变
应原特异性免疫治疗是唯一针对病因治疗的方法。
应用传统粗制变应原提取液进行免疫治疗 ,需要长疗
程多次皮下注射 ,患者的依从性差 ,且粗制变应原的
成分繁杂 ,除变应原成分外还含有非变应原成分 ,可
能引起局部和全身过敏反应。变应原核酸疫苗具有
持久免疫应答 、易标准化 、生产应用方便等优点 ,在过
敏性疾病的预防 、诊断 、治疗上具有很大的潜力和优
西 安 交 通 大 学 学 报 (医 学 版 ) 第 31 卷
势 。变应原核酸疫苗的构建及应用研究是目前的研
究热点之一。本研究构建了葎草花粉主要变应原核
酸疫苗并初步评价其免疫学活性 ,为葎草花粉过敏性
哮喘的防治提供了新方法。
1 材料与方法
1.1 材料 DH5α工程细菌由西安交通大学医学院
中心实验室惠赠 , pcDNA3.1(-)由第四军医大生物
化学教研室惠赠 ,含目的基因的 pT ripIEx2-LC2质
粒由本课题组实验室保存。T4DNA 连接酶 , EL0014
内切酶(Hind Ⅲ , ER0507),(EcoR Ⅰ , ER0277)购自
Fe rmentas公司 , Fast filter Endo-Free Plasmid M axi
Kit(D6926-03)25 preps购自 E.Z .N.A 公司。6周
龄的雌性 BA LB/c小鼠由西安交通大学医学院动物
实验中心提供并饲养 。葎草花粉变应原浸液 1/20
(g/mL)由西安交通大学医学院第二附属医院变态反
应实验中心提供。
1.2 pTripIEx2-LC2 和 pcDNA3.1(-)Hind Ⅲ 、
EcoRⅠ双酶切 小量提取质粒分别测得 pT ripIEx2-
LC2质粒浓度为 225.7 mg/ L , pcDNA3.1(-)质粒
浓度为 483.6 mg/L。用 Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ内切酶双
酶切后琼脂糖凝胶电泳 ,用胶回收试剂回收 LC2目
的基因片段和 pcDNA3.1(-)质粒的大片段 。
1.3 将 LC2目的基因定向插入 pcDNA3.1(-)质
粒 测回收 LC2基因片段的浓度为 3.6 mg/ L , pcD-
NA3.1(-)质粒大片段的浓度为 18.3 mg/L。用
T4DNA 连接酶连接 ,将连接产物命名为 pcDNA3.1-
LC2 ,转化 DH5α大肠杆菌感受态细胞。
1.4 pcDNA3.1-LC2 转化 DH5α大肠杆菌感受态
细胞 应用预冷的无菌吸头从制好的感受态细胞悬
液中吸取 200 μL ,并转移到无菌的离心管中。每管
中加入 10 μL DNA ,轻轻旋转以混匀 ,在冰上放置
30 min。然后 ,将离心管放入预加温至 42 ℃的循环
水中静置 90 s ,快速将管转移到冰浴中 ,使细胞冷却
1 ～ 2 min。每管加 800μL LB培养基 ,用水浴加温至
37 ℃,将管转移至摇床上 ,温育 45 min ,使细胞复苏
至表达抗性基因。将已转化细胞转移到氨苄霉素 LB
固体平板培养基上 ,置于室温直至液体被吸收 ,倒置
平板 ,于 37 ℃培养 。
1.5 双酶切鉴定 pcDNA3.1-LC2 将生长良好的
单克隆菌落接种入含 5 mL 氨苄霉素的 LB 培养基的
50 mL 试管中培养 ,提取质粒测浓度为 382.6 mg/L ,
行 HindⅢ和 EcoRⅠ双酶切鉴定。
1.6 核酸测序鉴定 pcDNA3.1-LC2 将 1 mL 转化
菌液送奥科生物技术有限公司测核苷酸序列 。
BLAS T 比对 pcDN A3.1-LC2 质粒与 pTripIEx2-
LC2中目的基因有无突变 、缺失及目的基因是否存
在串连插入等 。
1.7 pcDNA3.1-LC2免疫原性鉴定 6周龄的雌性
BA LB/c小鼠 ,体重为(20±2)g ,共 12只 ,编号1 ～ 12
号 ,用秒表行系统分组的方法随机分为对照组和保护
组。每组 6只分别标为 A 、B 、C 、D 、E 、F 。第 1天每
只小鼠两后腿股四头肌各肌注 7.5 g/L 布比卡因 50
μL ,第 2 天对照组同部位多点注射 pcDNA3.1(-)
质粒 100μg(A260 , 1 164 mg/L),保护组同部位多点
注射 pcDNA3.1-LC2 100μg(A260 , 909 mg/ L)。第 8
天重复第 2天各组的操作。第 29天将各组小鼠摘眼
球处死取血清 。
2 结 果
2.1 pcDNA3.1-LC2 的双酶切 pcDNA3.1-LC2
进行 HindⅢ和 EcoRⅠ双酶切 ,将酶切产物琼脂糖凝
胶电泳 ,可见 5个克隆的条带基本一致 ,目的片段大
小大致在 900 bp左右(图 1)。
图 1 pcDNA3.1-LC2 质粒 H indⅢ和 EcoRⅠ 双酶切的电
泳图
F ig.1 Figure of pcDNA3.1-LC2 plasmid H ind Ⅲ and
EcoRⅠ double enzymoly sis electr opho resis
M :Marker;1～ 5:pcDNA3.1-LC2质粒 H ind Ⅲ 和 E coRⅠ 双酶
切产物。
2.2 pcDNA3.1-LC2 质粒的测序 构建好的含有
葎草花粉主要变应原目的基因的 pcDNA3.1-LC2质
粒 ,以 T7通用测序引物 ,由奥科测序公司提供测序
结果 。BLAST 比对结果显示 pcDNA3.1-LC2 质粒
与 pTripIEx2-LC2质粒中目的片段无突变 、缺失和
倒置 。
2.3 pcDNA3.1-LC2 免疫原性的鉴定 本实验双
向免疫扩散采用梅花斑方式 ,任何两周围孔与中心孔
都组成呈中心对称的正三角形 ,两底角孔血清抗体浓
度差别较大时 ,高浓度抗体会干扰低浓度抗体。本实
52
1 期 张永红 ,孙秀珍,刘 昀 ,等.葎草花粉主要变应原核酸疫苗 pcDNA3.1-LC2 的构建及其免疫原性鉴定
验 6只小鼠血清浓度的血清抗体没有明显差别 ,相互
之间没有明显干扰。通过预试验检测葎草花粉变应
原与小鼠血清反应时域的比例 ,得知葎草花粉变应原
浸液 1/20(g/mL)稀释 4 倍与小鼠血清反应可产生
明显的沉淀线 。30μL 1/80(g/mL)葎草花粉变应原
浸液与 30μL pcDNA3.1-LC2免疫血清双向免疫扩
散试验结果见图 2。
图 2 葎草花粉变应原浸液与 pcDNA3.1-LC2 免疫小鼠血
清的双向免疫扩散实验结果
Fig.2 Double immunodiffusion test of scandens g ra ss po llen
allerg en ex tr act and pcDNA3.1-LC2 immune se rum
0:稀释后 1/ 80(g/mL)葎草花粉变应原提取液;左 1～ 6:p cDNA3.1-
LC2免疫 A 、B 、C 、D、E 、F 小鼠血清;右 1～ 6:pcDNA3.1免疫 A 、B 、
C 、D、E 、F 小鼠血清。
3 讨 论
一般认为支气管哮喘是由于外界因素诱发遗传
性 Th1 与 Th2细胞免疫失衡导致的 Ⅰ型变态反应性
疾病[ 1-2] 。Th1 与 T h2 细胞不同的免疫学功能导致不
同的免疫反应 , Th1 细胞主要分泌 IL-2 、IL-12 、IFN-
γ,主要活化巨噬细胞 ,参与细胞免疫 。Th2 细胞主要
分泌 IL-4 、IL-5 、IL-9 、IL-10 、IL-13 和 GM-CSF ,主要
刺激 B细胞增殖并产生抗体 ,诱导肥大细胞和巨噬
细胞生长分化和 IgE免疫球蛋白的生成 ,参与体液免
疫 。具有 Th2 特异免疫的个体初次接触变应原后
Th细胞在 IL-4的作用下分化为 Th2 细胞 ,诱导B细
胞增殖分化为浆细胞产生特异 IgE , IgE 的 Fc段与
肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面 FcεRⅠ受体结合 ,导
致机体处于致敏期 ,当再次接触过敏原时 ,致敏的肥
大细胞和嗜碱性粒细胞表面的 IgE 与变应原结合引
发 IgE交联 ,导致脱颗粒释放组胺 、白三烯等炎症介
质 ,引起相应器官组织的病理生理学改变。
葎草(humulus scandens)俗称“拉拉秧” ,主要分
布于我国除新疆和青海外的各地区。另外 ,也见于日
本和北美洲各国[ 3] 。近年来葎草属花粉已成为我国
及东亚地区夏秋季节花粉症的一个重要致敏原[ 4-5] 。
本研究成功构建了葎草花粉主要变应原 pcDNA3.1-
LC2核酸疫苗 ,它以松弛型高拷贝质粒 PUC 为骨
架 ,含有新霉素抗性 、氨苄青霉素抗性筛选基因 ,
PUC骨架含有 CpG 序列非甲基化的 CpG 六聚体 ,
为 5′-嘌呤嘌呤 CG 嘧啶嘧啶 3′,有利于诱导 Th1 为
主的免疫反应[ 6-7] 。带有细菌复制子 ori ,可以在大肠
杆菌中高拷贝的扩增 ,适于大量制备核酸疫苗 ,并且
含有 SV40肉瘤病毒 40复制子 , GABLER等[ 8] 研究
梯牧草主要变应原 Phi p 5 的核酸疫苗 ,提示含有病
毒复制子的核酸疫苗可以诱发更强的保护性免疫反
应。在人体应用这种优化后的核酸疫苗时 ,仅需毫克
级的核酸疫苗即可诱导适当的保护性免疫反应。目
的基因位于 CMV 巨细胞病毒启动子的下游 HindⅢ
和 EcoRⅠ酶切位点之间 。CMV 真核启动子与其他
启动子 PSV 、LIR等相比 , CMV 在各种组织中都能
引发下游基因的高水平表达。经 BLAS T 序列分析
LC2与拟南芥花粉外壳蛋白 GSLTFB91ZE04 号基
因同 源性 达 80%, 用 InterPro scan 软件 分 析
GSLTFB91ZE04号基因编码蛋白为过敏毒素 ,提示
LC2基因编码的蛋白也可能为致敏蛋白 。经 ORF
分析 ,目的基因片段有一个 672 bp大小的完整的开
放阅读框 ,编码 224个氨基酸 。经小鼠动物实验证明
葎草花粉主要变应原 pcDNA-LC2 核酸疫苗能够在
小鼠体内表达 ,能够产生葎草花粉变应原特异性中和
抗体 ,具有良好的免疫原性 ,为进一步研究葎草变应
性哮喘病的防治奠定了基础 。
目前 ,国内外在尘螨 、花粉 、乳胶等变应原核酸疫
苗的大量研究中 ,表明核酸疫苗可诱导 Th2 为主的
免疫反应向 Th1 为主的免疫反应偏移 ,在动物哮喘
模型中 ,花粉 、蜂毒 、卵清蛋白 、豆类 、花生 、蟑螂 、真
菌 、乳胶等核酸疫苗能够抑制哮喘动物模型呼吸道炎
症反应的产生 , 而且对气道炎症有一定的治疗作
用[ 9] 。核酸疫苗的未来研究方向是要朝着理想疫苗
的方向发展 ,即安全高效的疫苗方向发展。在抗原研
究中 ,新近的研究主要集中在优势表位的筛选和组
合 ,抑制性表位的剔除;在核酸疫苗载体的研究方面 ,
除了现在常用的质粒载体 ,又出现了病毒载体 ,因其
具有质粒载体所不具有的独特优势 ,被尝试使用 ,又
因其具有潜在的危险性 ,处于慎重发展阶段。目前 ,
受到关注比较多的病毒载体系统有痘病毒载体 、腺病
毒载体等[ 10-11] 。在免疫佐剂的研究中 , CpG 基序和
细胞因子作为核酸疫苗的佐剂的作用得到不断的证
实;在免疫方案方面 ,联合疫苗 、多途径联合免疫等显
示了良好的应用前景。但是 ,对核酸疫苗的免疫机制
和如何提高免疫水平仍然需要进一步的研究 ,核酸疫
苗在构建以及生产方面还存在需要改进的地方。
(下转第 78 页)
53
西 安 交 通 大 学 学 报 (医 学 版 ) 第 31 卷
药已广泛应用于临床。咪唑安定除了具有麻醉镇静
作用外 ,由于其结构上与内源性抗氧化物维生素 E
相近 ,在生物体中作为供氢体与自由基反应生成苯氧
基而清除自由基 ,具有一定的抗氧化作用。其抑制自
由基介导的脂质过氧化作用可能是主要的抗氧化机
制[ 7] 。吴新文等[ 8] 研究发现临床剂量的丙泊酚和咪
唑安定具有清除自由基的作用 ,增加机体抗氧化能
力 。咪唑安定能降低组织细胞代谢率[ 9] ,经肝微粒体
羟化作用而代谢 ,可消除体内的 ·OH ,可使由·OH
引发的脂质过氧化反应减轻 。
本实验发现噪声暴露后豚鼠血清氧自由基反应
代谢产物 MDA 含量明显升高 ,提示噪声环境下豚鼠
血中自由基生成增加 ,势必影响到耳蜗组织中 MDA
含量 ,豚鼠听力受损程度与自由基对内耳的氧化损伤
密切相关 。同时 ,咪唑安定组血清 SOD活性高于生
理盐水组和噪声性聋组 ,说明咪唑安定可减少氧自由
基生成 ,提高 SOD活力 ,对自由基氧化引起的听力损
害有预防和治疗作用。
ABR是反映听功能的一项客观指标 。本实验的
噪声条件可以使听阈提高 40 dB左右 。由本研究结
果可看出 ,长时间的强烈噪声暴露可引起听阈提高;
而注射咪唑安定可起到防止听阈提高的作用 ,注射生
理盐水对噪声性聋无预防作用。通过对耳蜗中 ROS
含量测定 ,证明咪唑安定有一定的抗氧化活性 ,可以
抵抗体内过多的 ROS ,对噪声性聋起到预防作用;生
理盐水无抗氧化活性 ,故没有预防噪声性聋的作用。
本实验证实长时间的强烈噪声暴露能引起听阈
提高和耳蜗中 ROS 含量增高 ,咪唑安定对噪声性聋
有一定的预防作用 ,噪声性听力损失可能与 ROS 密
切相关。这为耳科手术中使用电钻造成噪声性聋的
预防提供了科学依据 。目前研究还限于动物实验阶
段 ,咪唑安定在临床应用上的剂量还有待于进一步
探讨 。
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