全 文 :科研开发
化工科技,2015,23(1):50~53
SCIENCE &TECHNOLOGY IN CHEMICAL INDUSTRY
作者简介:马云超(1980-),男,吉林市人,吉林市农业科
学研究院助理研究员,主要从事植物源农药开发及农药
残留等方面工作研究。
收稿日期:2014-10-19
大孔吸附树脂对喜树叶中喜树碱
的纯化工艺研究
马云超1,马珊珊2,郭继业1,宋 冰1,丁孝营1,徐珊珊1
(1.吉林市农业科学院,吉林 吉林132101;2.吉林市社会福利院,吉林 吉林132012)
摘 要:研究通过静态吸附/解吸实验对大孔吸附树脂进行筛选,优选AB-8大孔吸附树脂作为层析
柱填料,并对其进行喜树碱纯化工艺研究;研究表明AB-8树脂对喜树碱的静态吸附率为95.31%;体积
分数95%的乙醇静态解吸率为92.4%;最佳吸附条件为:上样液质量浓度为0.175mg/mL,上样液不调
pH值,吸附流速为2BV/h,平衡吸附5h;最佳洗脱条件:体积分数95%乙醇,洗脱流速1BV/h,洗脱体
积为8BV。在该工艺条件下,洗脱物中喜树碱质量分数为7.43%,洗脱率为83.1%。
关键词:大孔吸附树脂;喜树碱;纯化工艺
中图分类号:R 284.2 文献标识码:A 文章编号:1008-0511(2015)01-0050-04
喜树碱(PT)为具有内酯环结构的喹啉类生
物碱,继1966年 Wal等首次从喜树植物中分离
出喜树碱之后,人们对喜树碱的生物和化学性质
进行了大量的研究,主要是针对抗肿瘤研究领域。
喜树碱的抗癌作用,起初认为是喜树碱通过抑制
核酸合成,导致癌细胞内DNA降解,近年来研究
结果否定了这一观点,研究发现喜树碱主要是通
过抑制癌细胞DNA复制酶,阻碍癌细胞的增殖。
1988年又进一步发现喜树碱主要是通过阻断
DNA拓扑异构酶I(Topoisonmerase I)合成,发
挥细胞毒性的独特抗癌机理[1]。
传统工艺上,多用氯仿或氯仿/甲醇提取乙醇
萃取液中的喜树碱,由于氯仿的高溶剂毒性及低
选择性,导致氯仿萃取物中喜树碱含量较低且化
合物复杂,给喜树碱精制和分离带来困难。
大孔树脂是20世纪70年代发展起来的一种
高吸附性的有机高聚物,它包括大孔吸附树脂和
大孔离子交换树脂[2]。大孔吸附树脂不含有离子
交换基团,是以苯乙烯和丙烯酸酯为单体,加入交
联剂和致孔剂,相互交联聚合而成多孔骨架结构,
其吸附原理是利用自身巨大的表面积,通过范德
华力与被吸附组分发生物理性作用,并依据化合
物相对分子质量大小及吸附力强弱的差别,达到
分离提纯的目的[3]。与其它柱层析吸附剂相比,
大孔树脂具有吸附容量大、物理稳定性好、机械强
度大、易被有机溶剂选择性洗脱、再生性良好的
优势。
实验选用5种非/弱极性大孔吸附树脂,通过
静态吸附与解吸实验,对树脂进行筛选。结合动
态实验对树脂纯化工艺以及树脂再生性进行研
究,从而确定利用大孔吸附树脂对天然产物中喜
树碱分离的工业技术可行性。
1 实验部分
1.1 试剂与仪器
所用溶剂除乙腈外均为分析纯;乙腈为高效
液相色谱纯;蒸馏水及超纯水为实验室自制;喜树
碱标准品质量分数为95.8%,喜树叶采自浙江桐
庐浙江林学院培植基地四年生喜树;D101、D201、
D402、AB-8、X-5大孔吸附树脂购于天津南开大
学化工厂。
LC-6A高效液相色谱系统、UV-2450紫外检
测器、AUY220型电子分析天平:日本岛津株式
会社;KQ-500B超声波清洗器:昆山市超声仪器
有限公司;DK-S14型恒温水浴锅:上海森信实验
仪器有限公司;DGG-9240B型电热恒温干燥箱:
上海森信实验仪器有限公司;RE-52AA型旋转蒸
DOI:10.16664/j.cnki.issn1008-0511.2015.01.012
发仪:上海亚荣生化仪器厂。
1.2 方法
1.2.1 喜树碱样品液的制备与含量测定
称取喜树叶干粉,置于70℃的恒温水浴中,
用体积分数65%的甲醇水溶液,料液比1∶10,回
流提取1h,37℃下减压浓缩,得到喜树碱的样品
液。HPLC测定ρ(样品液)。
1.2.2 大孔吸附树脂的预处理与再生
将D101、D201、D402、AB-8、X-5 5种大孔吸
附树脂用体积分数95%的乙醇浸泡2d,倾去上
浮物后抽滤,重复操作,直至乙醇洗涤液澄清且加
水不产生乳白色浑浊现象,然后用大量蒸馏水浸
没保存,备用。
1.2.3 大孔吸附树脂的静态吸附/解吸实验
取湿树脂各2.5g,置于150mL三角瓶中,加
入0.175mg/mL的喜树碱样品液100mL,25±2
℃震荡24h。吸附平衡后,取清液1mL,甲醇定
容至10mL,HPLC测定ρ(吸附残液)。
将吸附后的树脂洗涤抽滤,然后置于150mL
三角瓶中,加入体积分数95%的乙醇50mL,在
25±2℃下,震荡解吸24h,解吸平衡后,抽滤,并
用少量乙醇洗涤,合并滤液及洗涤液,用体积分数
95%的乙醇定容至100mL,HPLC测定ρ(解吸
液)。
计算公式如下:
吸附量=
(ρ0-ρr)×V
m
(1)
解吸量= ρ1V1(ρ0-ρr)×V
(2)
其中:ρ1 为 解吸液质量浓度;ρ0 为吸附液质量浓
度;ρr为吸附残液质量浓度;V 为吸附液体积;V1
为解吸溶剂体积;m为树脂的干重。
1.2.4 大孔吸附树脂纯化工艺研究
1.2.4.1 大孔吸附树脂的吸附动力学曲线
取AB-8树脂2.5g,加入ρ(喜树碱)为0.175
mg/mL的溶液100mL,静态吸附10h,分别于1、
2、3、4、5、6、7、8、9、10h,各移取上清液1mL,
HPLC测定吸附残液中ρ(喜树碱),绘制树脂的
吸附动力学曲线。
1.2.4.2 大孔吸附树脂吸附透过曲线
取3支玻璃层析柱(20mm×400mm),各加
AB-8树脂30mL(树脂干重5.51g),样品溶液上
样,吸附流速2BV/h,每1BV收集一次,逐次标
记,HPLC测定流出液中ρ(喜树碱)并绘制吸附
透过曲线。
1.2.4.3 pH值对大孔吸附树脂的吸附性能影响
取AB-8湿树脂2.5g,5份,分别加入pH=
4、6、8、10、12的样品溶液100mL,静态吸附24h,
HPLC测定ρ(吸附残液)。
1.2.4.4 ρ(洗脱液)对树脂洗脱性能的影响
取AB-8湿树脂2.5g,5份,静态吸附24h。
将树脂抽滤洗涤后,置于150mL三角瓶中,加入
φ(乙醇)分别为30、50、70、80、95的乙醇50mL,
在25±2℃下,震荡解析24h,HPLC测定ρ(解吸
液)。
1.2.4.5 洗脱流速对树脂解吸性能的影响
将样品溶液700mL,共3份,以2BV/h吸附
流速通过装有30mLAB-8树脂的层析柱,平衡5h,
用3BV蒸馏水洗涤柱床,最后用体积分数95%的
乙醇洗脱,洗脱流速为1、2、3BV/h,洗脱体积
9BV,HPLC测定流出液和洗脱液中ρ(喜树碱)。
1.2.4.6 树脂稳定性研究
将AB-8湿树脂2.5g,按1.2.3方法解吸。
解吸后,将树脂置于150mL三角瓶中,加入50
mL体积分数95%的乙醇,磁力搅拌30min对树
脂再生,然后过滤,蒸馏水洗涤树脂,将再生后的
树脂二次进行吸附与解吸,如此重复操作4次,
HPLC测定各次ρ(吸附残液)。
2 结果与讨论
2.1 ρ(样品液)的测定
按1.2.1的方法操作,实验结果见表1。由
于提取浓缩液是生产过程中可以直接获得浓度最
高的喜树碱水溶液,故此实验中涉及的样品溶液
ρ(喜树碱),均为0.175mg/mL。
表1 浓缩液中ρ(喜树碱)
实验
处理
ρ/(mg·
mL-1)
平均值/
(mg·mL-1)
标准偏差/
(mg·mL-1)
相对标准
偏差/%
1 0.178
2 0.171 0.175 0.003 6 2.06
3 0.176
2.2 大孔吸附树脂的静态吸附/解吸实验
按1.2.3方法,实验结果见表2。实验结果
表明,D402型与AB-8型大孔吸附树脂对喜树碱
有较大的吸附容量;D101型树脂次之;X-5与
D201型树脂吸附量差异不大。
·15·第1期 马云超,等.大孔吸附树脂对喜树叶中喜树碱的纯化工艺研究
表2 静态吸附实验结果
树脂
型号
ρ(样品液)/
(mg·mL-1)
ρ(吸附残液)/
(mg·mL-1)
吸附量/
(mg·g-1)
吸附率
/%
D101 0.175 0.100 1 16.02 91.54
D201 0.175 0.090 8 14.15 80.86
D402 0.175 0.080 1 16.80 96.00
AB-8 0.175 0.073 3 16.68 95.31
X-5 0.175 0.097 8 14.10 80.57
按1.2.3方法,结果见表3。
表3 静态解析实验结果
树脂型号 ρ(解吸液)/(mg·mL-1) 解析率/%
D101 0.125 83.5
D201 0.132 78.4
D402 0.170 89.5
AB-8 0.188 92.4
X-5 0.148 95.8
由表3可见,X-5的解吸率最高,但其吸附能
力较差;AB-8和D402具有较高的吸附与解吸能
力,均适用于喜树碱的分离纯化,从成本考虑,优
选AB-8型大孔吸附树脂进行工艺研究。
2.3 大孔吸附树脂纯化喜树碱工艺的研究
2.3.1 AB-8树脂吸附时间对吸附性能的影响
吸附时间对吸附性能的影响结果见表4。
表4 吸附动力学实验数据计算结果
吸附
时间
/h
ρ(吸附残液)
/(mg·
mL-1)
吸附量/
(mg·
g-1)
吸附
时间
/h
ρ(吸附残液)
/(mg·
mL-1)
吸附量
/(mg·
g-1)
1 0.134 4 6.65 6 0.078 9 15.76
2 0.114 7 9.89 7 0.078 3 15.85
3 0.097 7 12.68 8 0.077 3 16.02
4 0.093 1 13.42 9 0.076 5 16.15
5 0.078 6 15.80 10 0.076 0 16.23
实验结果表明,吸附时间超过5h,吸附量增
长趋于平缓,吸附几近饱和,所以确定吸附时间为
5h,吸附效果较好。
2.3.2 pH值对吸附性能的影响
pH值对吸附性能的影响结果见表5。
表5 pH值对树脂吸附性能的影响
吸附液
pH值
ρ(样品液)
/(mg·mL-1)
ρ(吸附残液)
/(mg·mL-1)
吸附量
/(mg·g-1)
4.0 0.175 0.097 9 12.64
6.0 0.175 0.078 8 15.77
8.0 0.175 0.069 2 17.34
10.0 0.175 0.075 6 16.30
12.0 0.175 0.081 5 15.33
结果表明,在pH=4~8,随着pH值增大,吸
附容量也相应增加;当pH值大于8,吸附量有所下
降,推测是喜树碱钠盐具有易氧化分解的不稳定性
引起的,实验确定pH值对吸附量的影响并不大,
考虑到简化工艺步骤,确定不调pH值上样。
2.3.3 吸附透过曲线的绘制
将0.175mg/mL喜树碱样品溶液,以2BV/
h的吸附流速过树脂柱,HPLC测定流出液中ρ
(喜树碱),以流出液体积为横坐标,ρ(流出液)为
纵坐标,绘制吸附透过曲线,结果见图1。
流出液体积/BV
图1 喜树碱的吸附透过曲线
由图1所示,在吸附流速为2BV/h的条件下,
吸附溶液流经前18BV未发生泄露,从19BV开始,
随着流出液体积的增加,泄露率不断增高,当流出
液体积超过23BV,泄露曲线趋向平缓,表明树脂吸
附已经接近饱和,此时吸附量为20.48mg/g。
2.3.4 φ(乙醇)对树脂洗脱性能的影响
按1.2.4.4方法,结果见表6。实验表明,随
着φ(乙醇)的升高,喜树碱的洗脱率也不断提高,
体积分数95%的乙醇洗脱率最高,而且高φ(乙
醇)进行洗脱,洗脱液便于浓缩,能够减少回收水
分带来的目标物损耗,因此选择φ(乙醇)=95%
的乙醇为洗脱溶剂。
表6 φ(乙醇)对树脂洗脱性能的影响
φ(乙醇)
/%
吸附量/
(mg·g-1)
ρ(洗脱液)/
(mg·mL-1)
洗脱量/
(mg·g-1)
洗脱率
/%
30 10.17 0.011 0.55 5.41
50 10.17 0.065 3.25 32.0
70 10.17 0.171 8.55 84.1
80 10.17 0.176 8.80 86.5
95 10.17 0.186 9.30 91.4
2.3.5 洗脱流速对树脂洗脱性能的影响
按1.2.4.5方法,结果见表7。实验结果表
明,随着洗脱流速的增大,洗脱率逐渐降低,而且
根据经验,洗脱流速通常控制在吸附流速的二分
之一比较理想,故选择洗脱流速为1BV/h。
·25· 化 工 科 技 第23卷
表7 洗脱流速对树脂洗脱性能的影响
洗脱流速
/(BV·h-1)
上样量
/mg
流出液中
CPT/mg
洗脱量/
(mg·mL-1)
洗脱率
/%
1 122.5 13.24 92.42 84.6
2 122.5 15.47 83.70 78.2
3 122.5 15.23 72.64 67.7
2.3.6 大孔吸附树脂的稳定性研究
按1.2.4.6方法,实验结果见表8。实验结
果表明,新树脂和再生后的树脂吸附率差别大,再
生后的树脂之间吸附率差别较小。
表8 树脂使用次数对吸附率的影响
树脂使用次数 吸附量/(mg·g-1) 吸附率/%
1 10.11 57.8
2 6.238 35.6
3 5.612 32.1
4 5.325 30.4
2.3.7 AB-8树脂的最佳纯化工艺
取700mL提取浓缩液通过装有30mL AB-8
湿树脂的层析柱(20mm×400mm),按上述选定
的上样、洗脱条件操作,每1BV收集一瓶,依次编
号,GF254 硅胶薄层点样跟踪,合并检出项,
HPLC测定流出液及ρ(洗脱液),计算树脂的吸
附量和洗脱率,洗脱液经浓缩去醇,干燥后称量,
计算洗脱物中喜树碱的纯度,结果见表9。
表9 树脂最佳工艺条件下动态性能参数
吸附量/
(mg·g-1)
洗脱体积
/BV
洗脱量/
(mg·g-1)
洗脱率
/%
洗脱物
/g
CPT纯度
/%
106.63 8 88.61 83.1 1.192 7.43
经GF254硅胶薄层点样跟踪,1~8号瓶在
紫外光下,喜树碱斑点可见,第9号瓶开始无喜树
碱检出,合并1~8号瓶,HPLC测定洗脱液中
ρ(喜树碱),在选定的上样、洗脱条件下,φ(乙醇)
=95%洗脱8BV,洗脱率可达83.1%,洗脱物中
喜树碱质量分数大于7%,说明AB-8大孔吸附树
脂对喜树叶粗提液的净化效果良好,效率高,工艺
可行。
3 结 论
结合大孔吸附树脂静态吸附与解吸实验结果
进行筛选,优选出AB-8大孔吸附树脂,并对树脂
的上样、洗脱条件的相关参数进行考察,确定AB-
8大孔吸附树脂纯化喜树碱粗提液的最佳工艺
为:将浓缩液不调pH值上样,上样流速2BV/h,
平衡吸附5h;用体积分数95%的乙醇以1BV/h
流速进行洗脱,洗脱量为8BV。该条件下洗脱物
中喜树碱质量分数大于7%,通过对树脂再生性
能的考察,发现新树脂吸附一次后,吸附率下降约
30%,每次使用后需对树脂进行系统地再生。
[参 考 文 献 ]
[1] Hiang YH,Herizberg R,Hecht S,et al.Camptothecin in-
duces protein-linked DNA breaks via mammalian DNA to-
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[2] 李善吉,伍胜君.大孔树脂的应用概况[J].广东轻工技术学
院学报,2005,4(2):11-13.
[3] 刘彬果,郭文勇,钟蕾,等.大孔树脂吸附技术在中药中的应
用[J].解放军药学学报,2003,19(6):452-455.
Research on purification process of camptothecin from camptotheca
common leaf by macroporous absorption resins
Ma Yunchao1,Ma Shanshan2,Guo Jiye1,Song Bing1,Ding Xiaoying1,Xu Shanshan1
(1.Jilin City Academy of Agricultural Sciences Supervision,Jilin 132101,China 2.Jilin City
Social Welfare Institute,Jilin132012,China)
Abstract:Through static absorption and desorption experiment,resin of AB-8was selected as the ab-
sorption carrier from five different styles of macroporous resins.The static absorption rate of AB-8
resin could reach 95.31%and its static desorption rate was 92.4%by eluting with 95%ethanol.We
sublimated the rough extraction fluid by macroporous resin of AB-8and confirmed the conditions of
absorption and desorption of the resin.The optimal absorption conditions were as folows:the initial
concentration was 0.175mg/mL,rough extraction fluid without pH adjustment,absorption velocity of
flow was 2BV/h and balance time of absorption was five hours.Camptothecin could be desorbed by u-
sing 95%ethanol at velocity of flow of 1BV/h,and the elution rate could reach 83.1%at the elution
quantity of 8BV.The purity of Camptothecin was reached 7.43%.
Key words:Macroporous absorption resin;Camptothecin;Purification process
·35·第1期 马云超,等.大孔吸附树脂对喜树叶中喜树碱的纯化工艺研究