全 文 ：新的较强的抗肿瘤、低毒的化合物打好基础。
致谢:中科院昆明植物研究所测定波谱数据。
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多花野牡丹精制提取物中有机酸定性分析及柠檬酸定量测定
王起运1， 曾佳烽2* ， 方 通2， 潘俊芳2， 张朝晖1*
(1. 江苏大学 药学院，江苏 镇江 212013;2. 上海华拓医药科技发展股份有限公司，上海 201201)
收稿日期:2012-09-03
作者简介:王起运 (1987—) ，女，硕士生，从事天然药物化学研究。Tel:18701915630，E-mail:wangqiyunwell@ 126. com
* 通信作者:曾佳烽 (1972—) ，男，博士，研究方向:中药、天然药物。Tel: (021)50802098，E-mail:zengjia-feng@ 163. com
张朝晖 (1965—) ，男，教授，研究方向:天然药物化学。Tel: (0511)5038201，E-mail:zzh6495@ eyou. com
摘要:目的 用离子色谱法定性分析多花野牡丹精制提取物中亲水性有机酸并定量测定柠檬酸。方法 样品稀释液经
PT-系列固相萃取柱和 0. 45 μm水膜滤过后，用 Ion Pac AS11-HC阴离子分离柱分离，以 EG 40 淋洗液自动发生器生成
的 1 ～ 40 mm/L KOH溶液梯度洗脱，抑制电导检测器检测。结果 除草酸和富马酸未完全分离外，其余组分均可以达
到完全分离。柠檬酸质量浓度在 5 ～ 60 μg /mL (r = 0. 999 9)范围内与峰面积呈良好线性关系，平均加样回收率为
100. 27%。结论 多花野牡丹精制提取物中含有乳酸、乙酸、甲酸、苹果酸、酒石酸、草酸、柠檬酸等亲水性有机
酸，其中柠檬酸量高于 3%。
关键词:多花野牡丹;离子色谱;有机酸;柠檬酸
中图分类号:R284. 1 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2013)06-1247-04
doi:10． 3969 / j． issn． 1001-1528． 2013． 06． 032
Qualitative analysis of organic acids and citric acid content in refined extract of
Melastoma affine
WANG Qi-yun1， ZENG Jia-feng2* ， FANG Tong2， PAN Jun-fang2， ZHANG Zhao-hui1*
(1． Pharmaceutical College，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China;2． Shanghai HOTMED Science Co．，Ltd．，Shanghai 201201，China)
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ABSTRACT:AIM To qualitatively study organic acids and determine the citric acid content in the refined ex-
tract of Melastoma affine by using ion chromatography method． METHODS The diluted sample solution was pu-
rified by PT-series solid-phase extraction column and 0. 45 μm inorganic membrane，finally separated on an anion
column of Ion Pac AS11-HC with the gradient elution of 1-40 mm /L KOH produced by EG 40 eluent automatic
generator and determined with a suppressed conductivity detector． RESULTS The remaining organic acids were
well separated except oxalic and fumaric acid． Good linear relationship of citric acid existed between the mass con-
centration and the peak area in the range of 5-60 μg /mL (r = 0. 999 9)． The average recovery was 100. 27% ．
CONCLUTION The refined extract of Melastoma affine contains lactic，acetic，formic，malic，tartaric，oxalic
and citric acid． The citric acid content in the sample is over 3% ．
KEY WORDS:Melastoma affine;ion chromatography;organic acids;citric acid
多花野牡丹 Melastoma affine D． Don 为野牡丹
科野牡丹属植物，主要分布在我国的西南或南部地
区［1-2］。临床研究表明多花野牡丹水煮浓缩得到的
浸膏对轻度、中度和重度宫颈糜烂都有很好的疗
效，300 例患者中治愈率为 99. 33%，有效率为
100%［3-4］。多花野牡丹水提取物，经精制、纯化得
到的有效部位，是妇科赛菲凝胶的主要成分。该精
制提取物水溶液的 pH为 2 ～ 3，预实验显示，其中
含有多种有机酸。赛菲凝胶在阴道中形成的弱酸性
环境可以抑制有害病菌的生长，有利于消除感染，
有机酸是其主要的有效成分之一。对多花野牡丹精
制提取物用 RP-C18柱进行了 HPLC分析，没食子酸
可以得到较好的分离，经测定含有量为 2. 7%，但
其他有机酸亲水性强，用 RP-C18柱难以进行有效
的定性和定量分析。
离子色谱法是 20 世纪 70 年代中期诞生的一项
分析测试技术，能同时分离测定多种有机酸和无机
阴离子，操作简单，灵敏度高，在环境、食品、生
物医学、制药、日化等领域已广泛应用［5-11］。目
前，还没有人用离子色谱方法对多花野牡丹中有机
酸进行系统的分析。本实验用 Ion Pac AS11-HC色
谱柱对多花野牡丹精制提取物中亲水性有机酸进行
了分离，并对其中含有量较高的柠檬酸进行了定量
测定。
1 仪器及试药
Dionex ICS-2100 型离子色谱仪 (戴安，美
国) ，配 EGCⅡ KOH 淋洗液自动发生器，Thermo
IonPac AS11-HC (4 mm × 250 mm)分离柱，Ther-
mo Dionex IonPac TM AG11-HC (4 mm × 50 mm)
保护柱;Chromeleon 6. 80 色谱工作站，电化学发
生抑制器，恒温电导检测器。
乙酸钠、乳酸、甲酸、丙酮酸、L(+)酒石
酸、DL-苹果酸、草酸、富马酸、柠檬酸、NaF、
无水 Na2 SO4、NaNO2、KNO3、Na3 PO4·12H2 O、KCl
购自国药集团化学试剂有限公司，柠檬酸对照
品 (批号:111679-200401)购自中国药品生物
制品检定所。
2 溶液制备
2. 1 混合对照品贮备液 分别取适量分析纯试剂
乙酸钠、乳酸、甲酸、丙酮酸、L(+)酒石酸、DL-
苹果酸、草酸、富马酸、柠檬酸、NaF、NaNO2、
无水 Na2 SO4、KCl、KNO3、Na3 PO4·12H2 O 用水
溶解，制成 1 mg /mL 的贮备液，一周内使用。临
用时分别精密移取上述贮备液至量瓶中，用水定
容，得到柠檬酸 20 μg /mL、F －为 3 μg /mL、Cl －为
4 μg /mL、其他对照品为 10 μg /mL 的混合对照品
溶液。
2. 2 供试品溶液 多花野牡丹叶片经水提、80%
乙醇醇沉，醇沉上清液减压浓缩后上 D101 大孔树
脂柱，水洗液减压浓缩即得精制提取液 (该提取
液由海南华拓天涯制药有限公司提供，批号
20111201，每克含 3. 57 g 生药) ，减压浓缩至干。
精密称取上述干燥物 76. 30 mg 于 10 mL 量瓶中，
去离子水溶解定容;用移液管精密量取 1 mL 至 5
mL量瓶中，去离子水定容，得 1. 53 mg /mL 样品
溶液。经 PT-系列固相萃取柱和 0. 45 μm 滤膜过
滤，滤液作为供试品溶液 1。多花野牡丹精制提取
液 (批号 20120301，20120302)为自行按照工艺
制备，同上法处理，得供试品溶液 2 和供试品溶
液 3。
3 多花野牡丹中有机酸定性
3. 1 离子色谱条件 ICS2100 型离子色谱仪:
35 ℃;进样量 25 μL;由 EGCⅡ KOH淋洗液自动
发生器生成 1 ～ 40 mm /L KOH梯度淋洗液;体积流
量 1. 0 mL /min;抑制电流为 75 mA;电导检测器
检测。
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3. 2 淋洗液浓度的选择 有机酸和无机阴离子的
色谱保留性质存在较大差异，弱保留的一元酸如乳
酸、乙酸、甲酸、丙酮酸等，中等保留的二元酸如
苹果酸、酒石酸、草酸、富马酸等，强保留酸如柠
檬酸等，对于强弱保留不同的离子，只能采用梯度
淋洗，等度淋洗会出现多种组分共同淋洗下来的现
象，在分析有机酸的时候，还要避免无机离子的
干扰。
IonPac AS11-HC 型阴离子分离树脂柱的填料
是亲水的微孔薄壳型阴离子交换树脂，基核是乙基
乙烯基苯的聚合物，离子交换功能基是季铵基-
N +(ROH)3，亲水性较强
［6，12］。本实验采用 EGCⅡ
KOH淋洗液自动发生器在线生成高纯度的 KOH 淋
洗液，可以避免杂质污染，保证淋洗液浓度的准
确，最大限度降低淋洗时的基线漂移和淋洗液浓度
在线变化，平衡时间短，可方便实现梯度淋洗。梯
度淋洗程序见表 1。
表 1 有机酸及无机阴离子的 KOH溶液梯度淋洗程序
Tab. 1 KOH gradient elution program of organic acids
and inorganic anions
t /min KOH /(mm·L －1)
0
15
30
40
45
52
55
60
1. 0
1. 0
18. 0
30. 0
40. 0
40. 0
1. 0
1. 0
3. 3 色谱分离情况 图 1 为有机酸、无机阴离子
混合对照溶液色谱图，图 2 为多花野牡丹精制提取
物的色谱图。从图 1 可知，在考察的有机酸种类
中，草酸和富马酸部分重叠，其余组分均达到完全
分 离，且 常 见 的 Cl －、 NO2
－、 NO3
－、 SO4
2 －、
PO4
3 －等无机阴离子与所测定的有机酸的保留时间
不同。与对照溶液的图谱对比，多花野牡丹精制提
取物色谱图中，在乳酸和乙酸出峰的位置可能因糖
类的多羟基成分的干扰，致使 F －、乳酸和乙酸未
能达到基线分离。
4 多花野牡丹提取物中柠檬酸定量测定
4. 1 离子色谱条件 ICS2100 型离子色谱仪;
35 ℃;进样量 25 μL;由 EGCⅡ KOH淋洗液自动
发生器生成 35 mm /L KOH 梯度淋洗液;体积流量
1. 2 mL /min;抑制电流为 104 mA;电导检测器
1. F － 2. 乳酸 3. 乙酸 4. 甲酸 5. 丙酮酸 6. Cl －
7. NO －2 8. NO －3 9. 苹果酸 10. 酒石酸 11. SO2 －4
12. 草酸 13. 富马酸 14. PO3 －4 15. 柠檬酸
1. F － 2. lactic acid 3. acetic acid 4. formic acid 5. pyru-
vic acid 6. Cl － 7. NO －2 8. NO －3 9. malic acid 10. tartaric
acid 11. SO2 －4 12. oxalic acid 13. fumaric acid 14. PO3 －4
15. citric acid
图 1 混合对照溶液色谱图
Fig. 1 Chromatogram of mixed control ions
1. F － 2. 乳酸 3. 乙酸 4. 甲酸 5. Cl － 6. NO －3 7. 苹
果酸 8. 酒石酸 9. SO2 －4 10. 草酸 11. 柠檬酸
1. F － 2. lactic acid 3. acetic acid 4. formic acid 5. Cl －
6. NO －3 7. malic acid 8. tartaric acid 9. SO2 －4 10. oxalic
acid 11. citric acid
图 2 样品色谱图
Fig. 2 Chromatogram of samples
检测。
4. 2 方法与结果
4. 2. 1 标准曲线的测定 取柠檬酸对照品 (批
号:111679-200401)适量，精密称定，加去离子
水制成每 1 mL含 100 μg的对照品溶液，精密移取
上述溶液稀释成含 5、10、20、30、40、50、60
μg /mL的柠檬酸对照品溶液，在上述实验条件下
测定其线性范围，并绘制峰面积 Y (μs)对质量浓
度 X (μg /mL)的标准曲线。计算得回归方程为
Y = 0. 061 4X + 0. 110 1 (r = 0. 999 9) ，线性范围为
5 ～ 60 μg /mL。
4. 2. 2 加样回收率试验 精密称取样品 9 份 (批
号:20111201) ，分成低、中、高 3 组，每组 3 份，
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分别精密添加柠檬酸对照品 20 μg、25 μg、30 μg，
按 2. 2 项下方法制备供试品溶液，进样分析，计算
回收率和 RSD。结果总平均加样回收率 (n = 9)
为 100. 27%，RSD 为 1. 28%。表明本法具有良好
的回收率。
4. 2. 3 精密度试验 配制 20 μg /mL 的柠檬酸对
照品溶液，连续进样 6 次，测得柠檬酸峰面积的
RSD (n = 6)为 0. 49%。表明仪器精密度良好。
4. 2. 4 重复性试验 取同一批次 (批号:
20111201)样品 6 份，按 2. 2 项下方法平行制备成
6 份供试品溶液，进样分析，测得柠檬酸的 RSD
(n = 6)为 0. 87%。表明本法重复性良好。
4. 2. 5 样品中柠檬酸测定 取不同批次提取的多
花野牡丹样品进行柠檬酸定量测定，每一批样品按
2. 2 项下方法制备 3 份供试品溶液，进样分析，结
果见表 2。
表 2 样品中柠檬酸测定结果 (n =3)
Tab. 2 Contents of citric acid in the samples
批号 平均百分含有量 /% RSD /%
20111201
20120301
20120302
3. 19
3. 13
3. 28
0. 64
0. 18
0. 52
5 结论
用离子色谱法对多花野牡丹精制提取物中有机
酸的分析结果表明，多花野牡丹精制提取物中含有
乳酸、乙酸、甲酸、苹果酸、草酸、柠檬酸等亲水
性有机酸以及 F －、Cl －、NO3
－、SO4
2 －等无机阴离
子。其中柠檬酸的量大于 3%，其余有机酸的量均
低于 1%。离子色谱法操作简便、快速、分离度
好、灵敏度高，可用于多花野牡丹精制提取物中亲
水性有机酸的定性定量分析。
通常，由于样品中较大极性成分的干扰，RP-
C18柱 HPLC法对极性强的有机酸进行分析时存在
一定的困难，而离子色谱法，能够不受这些物质的
干扰，对有机酸的分析有着独特的优势。
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