全 文 ：第 4 4卷第6期 上海师范大学学报(自然科学版) Vol． 44，No． 6
2 0 1 5年 1 2月 Journal of Shanghai Normal University(Natural Sciences) Dec ． ，2 0 1 5
DOI:10． 3969 /J． ISSN． 1000 － 5137． 2015． 06． 012
我国东部 6 个鸭儿芹群体遗传多样性的 ISSR分析
刘小慧，孙 兵，娄玉霞，郭水良
(上海师范大学 生命与环境科学学院 植物种质资源开发协同创新中心，上海 200234)
摘 要:基于 ISSR分子标记，对采自浙江磐安大盘山、临安清凉峰、临安昌化、金华北山双龙
洞附近、金华北山朝真洞附近和上海奉贤(栽培)的 6 个鸭儿芹(Cryptotaenia japonica Hassk．)
群体的 70 个样本进行了遗传多样性分析．从 9 条筛选出的 ISSR引物共扩增出 149 条带，其中
136 条具有多态性，多态性条带百分率为 91． 28% ．基于 ISSR标记计算了 6 个鸭儿芹群体的遗
传多样性指数，发现它们的 Nei的基因多样性指数(H)为 0． 1971，Shannon信息多态性指数(I)
为 0． 3086，Nm指数为 0． 3343． 6 个群体遗传分化系数 Nm为 0． 5993，表明 59． 93%的遗传分化
存在于群体间，40． 07%的遗传分化存在于群体内，群体群体间的基因流为 0． 3237，表明供鸭
儿芹群体之间基因流较小，遗传漂变已造成鸭儿芹群体之间较强的遗传分化．基于 136 个位
点，构建了反映各样本间遗传亲缘关系的系统聚类图，结果表明，从 70 个样本中可以区分出 5
个类群，其中金华北山采的两个群体为一个类群，与地理位置有很强的对应性．因此，在今后的
鸭儿芹引种栽培时，应注意从不同产地的鸭儿芹种源中进行引种，以丰富栽培种的遗传多
样性．
关键词:鸭儿芹;ISSR分子标记;聚类分析;遗传多样性
中图分类号:S 567 文献标志码:A 文章编号:1000-5137(2015)06-0650-07
收稿日期:2015-09-25
基金项目:上海市高校知识服务平台 －上海市植物种质资源中心经费(ZF1205)
通信作者:娄玉霞，中国上海市徐汇区桂林路 100 号，上海师范大学生命与环境科学学院，邮编:200234，E-mail:yux-
ialou@ shnu． edu． cn
0 引 言
鸭儿芹(Cryptotaenia japonica Hassk．) ，又称作鸭脚板、三叶芹，伞形科多年生草本植物，因质地柔嫩
可以食用叶茎，同时也具有较高的药用价值和保健功能［1 － 2］．典型的形态特征:多年生草本植物，全株无
毛，株高 30 ～ 60 cm，有香气，叶三出，有长柄，叶基部呈鞘状，中央小叶呈菱状广卵形，两侧小叶呈现歪
卵形，小叶无柄，先端尖，边缘具不整齐的锐尖重锯齿． 7 ～ 8 月抽生出 50 ～ 60 cm长的花梗，伞形花序圆
锥状，小伞梗少数，不等长，花白色，花瓣披针形．果实为长椭圆形双悬果，9 ～ 10 月陆续成熟，果皮由绿
色变成黄褐色．种子黄褐色，长纺锤形，有纵沟，千粒质量 2． 25 ～ 2． 50 g［3］．
目前国内对鸭儿芹分子方面的研究相对很少，特别是在遗传多样性方面，前人主要研究了鸭儿芹氨
基酸、挥发油成分等．鸭儿芹在我国分布广泛，主要在浙江、湖南、江西等地，不同地区鸭儿芹种群的遗传
分化如何值得研究． ISSR (Inter-simple sequence repeat)分子标记是基于微卫星技术发展起来的一种新
型分子标记技术，具有产物特异性强、稳定性好、多态性高等特点，被广泛应用于植物的品种鉴定、分类
与进化、遗传作图、基因定位等诸多领域［4］．本试验利用 ISSR分子标记技术，对 6 个鸭儿芹群体进行遗
传多样性分析．这方面工作将为鸭儿芹的良种选育提供基础数据．
第 6 期 刘小慧，孙 兵，娄玉霞，等:我国东部 6 个鸭儿芹群体遗传多样性的 ISSR分析
1 材料与方法
1． 1 试验材料
供试材料为来自浙江金华北山双龙洞周围和朝真洞附近、清凉峰、大盘山、昌化、上海奉贤(栽培群
体)6 个群体．采样时每两株样本间的距离在 10 m以上．取材后统一自然风干保存．
1． 2 试验方法
1． 2． 1 DNA提取与检测
取每个地点的干燥供试材料鸭儿芹叶片，每份材料重约 0． 2 g，利用植物基因组 DNA 提取试剂盒
(Tiangen公司产品)提取 DNA．取 5 μL DNA溶液用 1． 5%的琼脂糖凝胶电泳进行纯度检测，电泳缓冲
液为 1 × TAE Buffer，电泳 30 min 后，用凝胶成像系统仪照相． 最后将各材料的 DNA 浓度稀释至
20 ng /μL备用．
1． 2． 2 ISSR-PCR扩增反应体系
反应体系:2 × Es Taq MasterMix:12． 5 μL(康为世纪公司产品)，Primer(10 ×) :1 μL，Template DNA:
2 μL，RNase-Free Water:9． 5 μL;扩增反应程序:94 ℃预变性 2 min;94 ℃变性 30 s;退火(退火温度根据
引物而定)30 s;72 ℃延伸 30 min;30 个循环;72 ℃终延伸 5 min后终止反应．取 3 μL的预扩增产物，在
1． 5%琼脂糖胶中进行电泳，电压为 80 V，电泳时间 40 min，并照相记录．
1． 2． 3 引物筛选
以金华北山 1 号和清凉峰基因组 DNA为模板，进行 ISSR适宜引物筛选，试验所用哥伦比亚大学设
计并公布的 90 条 ISSR常用引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成．共筛选出 9 个合适的引
物，并对其中的 3 个引物进行了温度梯度筛选 PCR．
1． 2． 4 ISSR 标记的数据处理
通过凝胶成像系统片拍摄照片，然后用 TanonGIS 软件进行条带的标记，记录下胶板上相对较为清
晰的条带，按照试验中点样的顺序逐条比对多态性带，如果存在有差异谱带的位置及时进行记录，有带
的则记作 1，无带的则对应记作 0，生成 0，1 组成的数矩阵，根据 9 条引物的扩增结果，运用了 R 语言中
的聚类分析函数，以 Jaccard系数作为遗传距离，采用离差平方和法作为聚类策略，构建出了 70 个样本
亲缘关系树状聚类图．
2 结果与分析
2． 1 鸭儿芹叶片基因组提取
由图 1 可知(清凉峰群体提取的 DNA)，鸭儿芹的 6 个地点的基因组 DNA 的电泳条带均匀、清
晰，无拖尾现象，说明通过植物基因组试剂盒法所提取的鸭儿芹 DNA 纯度很高，可以用来进行 ISSR
分析．
M:DL2000 分子量标准参照;1 ～ 23:个体样本
图 1 清凉峰鸭儿芹群体提取的基因组 DNA
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2． 2 ISSR 扩增结果
以金华北山两个群体的基因组 DNA为模板，从哥伦比亚大学设计并公布的 90 个引物中筛选出稳
定性好、均匀、条带清晰且多态性丰富的适宜引物有 9 个，用于品种间的 ISSR 比较分析(表 1、图 2)． 9
个引物共计扩增出了 149 条清晰可辨的条带，DNA 片段长度多在 250 ～ 2000 bp，平均每个引物扩增出
16． 56 条，其中 136 条带具有多态性，多态性条带百分率为 91． 28% ．
Nei的基因多样性指数(H)为 0． 1971，Shannon信息多态性指数(I)为 0． 3086． 5 个群体 Nei的遗传
分化系数 Gst = 0． 5993，表明 59． 93%的遗传分化存在于群体间，40． 07%的遗传分化存在于群体内，观
察等位基因数 1． 9128，有效等位基因数 1． 3258，群体群体间的基因流 Nm为 0． 3343，表明供鸭儿芹群体
之间存在很小的基因流，说明基因的遗传漂变已造成鸭儿芹群体之间产生了较强的遗传分化，在 DNA
分子水平上鸭儿芹种质材料存在着丰富的遗传多样性．
表 1 供试鸭儿芹的采集地信息
群体号 地点 个体数及序号 经纬度
1 浙江磐安大盘山
11
(1 ～ 11)
N120°3151． 25″
E28°5950． 67″
2 浙江临安清凉峰
12
(12 ～ 23)
N118°5200． 42″
E30°0619． 88″
3 奉贤(栽培群体)
12
(24 ～ 36)
N121°3103． 52″
E30°5013． 82″
4 浙江临安昌化
12
(37 ～ 48)
N119°1304． 43″
E30°0947． 45″
5 浙江金华双龙洞
11
(49 ～ 59)
N119°3720． 61″
E29°1206． 16″
6 浙江金华朝真洞
12
(60 ～ 72)
N119°4013． 90″
E29°1107． 61″
M:DL2000 分子量标准参照;48-58:金华双龙洞个体样本;59-70:金华朝真洞个体样本
图 2 ISSR引物 UBC827(哥伦比亚大学设计 90 条引物之一)对金华的样本 PCR的结果
多样性指数通常用来表示群体内和群体间遗传变异程度，鸭儿芹群体的遗传多样性各指数见
表 2． Shannon 多样性指数(I)的结果显示不同群体鸭儿芹群体内的遗传多样性存在着一定的差异，
其变化范围为 0． 0593 ～ 0． 2273，其中最高的是清凉峰 0． 2273，其次是大盘山 0． 1395，接着是昌化
0． 1134，金华朝真洞 0． 0866，金华双龙洞 0． 0752，最低的是栽培 0． 0593，6 个群体平均多样性指数为
0． 1168．
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第 6 期 刘小慧，孙 兵，娄玉霞，等:我国东部 6 个鸭儿芹群体遗传多样性的 ISSR分析
鸭儿芹群体的 Nei 基因多样性(H)在 0． 0385 ～ 0． 1473 之间变化，其中清凉峰的最高，为 0． 1473，其
次是大盘山的群体 0． 0926，接着是昌化的 0． 0777，金华朝真洞的 0． 0607，金华双龙洞的 0． 0517，最低的
是栽培 0． 0385，6 个群体的平均基因多样性指数为 0． 0781．表 3 表明，各群体的 Nei 基因多样性(H)与
Shannon 多样性指数(I)比较一致，均表明遗传多样性最高的是清凉峰，其次是磐安大盘山和临安昌化，
接着是金华山朝真洞附近和双龙洞附近的群体，最后则是上海奉贤栽培群体．
表 2 基于 ISSR标记鸭儿芹六个群体的遗传多样性
群体 样本数 多态性位点数 多态性位点百分率 Nei基因多样性(H) Shannon指数(I)
大盘山 11 43 29． 05% 0． 0926 0． 1395
清凉峰 12 81 54． 73% 0． 1473 0． 2273
奉贤栽培 12 20 13． 51% 0． 0385 0． 0593
昌化 12 30 20． 27% 0． 0777 0． 1134
金华双龙洞 11 21 14． 19% 0． 0517 0． 0752
金华朝真洞 12 21 14． 19% 0． 0607 0． 0866
群体内平均值 － 36 24． 32% 0． 0781 0． 1168
2． 3 样本间亲缘关系分析
基于 ISSR 标记的 6 个鸭儿芹群体的遗传距离见表 3． 鸭儿芹 6 个群体间遗传一致度在 0． 7807 ～
0． 9743之间变化，其平均值为 0． 8775，其中金华朝真洞和金华双龙洞群体在遗传上的相似性最大，为
0． 9743;金华双龙洞和清凉峰群体的遗传相似性相对较小，为 0． 7807，说明鸭儿芹各群体间的相似程度
较高．
表 3 基于 ISSR标记的 6 个鸭儿芹群体的遗传相似系数和遗传距离
群体 磐安大盘山 临安清凉峰 上海奉贤栽培 临安昌化
金华山
双龙洞附近
金华山
朝真洞附近
磐安大盘山 ＊＊＊＊ 0． 8585 0． 8796 0． 8432 0． 7922 0． 7949
临安清凉峰 0． 1526 ＊＊＊＊ 0． 8269 0． 8693 0． 7807 0． 7847
上海奉贤栽培 0． 1283 0． 1901 ＊＊＊＊ 0． 8849 0． 8385 0． 8395
临安昌化 0． 1705 0． 1400 0． 1223 ＊＊＊＊ 0． 8373 0． 8407
金华山双龙洞附近 0． 2329 0． 2476 0． 1761 0． 1775 ＊＊＊＊ 0． 9743
金华山朝真洞附近 0． 2296 0． 2425 0． 1750 0． 1736 0． 0261 ＊＊＊＊
注:＊＊＊＊上方为遗传相似系数，下方为遗传距离．
对 70 份鸭儿芹样本进行了 ISSR标记分析，根据 Jaccard 遗传相似系数，应用组平均法得到的聚类
分组图(图 3) ，从图 3 上可将 70 份鸭儿芹植物样本分为 5 个组．组 1、2、3、4 分别对应于大盘山群体、清
凉峰群体、上海奉贤栽培群体和临安昌化群体，组 5 由浙江金华北山的两个群体组成．基于ISSR数据的
70 份样本聚类结果重排距离矩阵热图如图 4 所示．从图 4 可以发现，不同产地的鸭儿芹群体遗传分化
十分明显，与地理位置有极强的对应性．
3 讨 论
ISSR分子标记利用了 15 ～ 24 个碱基的重复锚定引物扩增 ISSR 之间的片段，具有操作简单、稳定
性高、重复性好、多态性丰富等优点［5 － 13］．通过试验可得到 ISSR扩增反应会受到诸多因素的影响:Mg2 +
浓度、引物的浓度、TaqDNA聚合酶、模板 DNA 浓度与纯度等，这些因素的改变也会影响到扩增产物的
稳定性．试验的过程中通过严格控制试验条件进行了多次试验反复筛选，最终得到了重复性好、稳定、清
晰的 ISSR扩增条带．试验结果中利用筛选出的 9 个适宜引物对 6 个供试材料进行扩增，共扩增出 149
条带，其中 136 条具多态性，多态性位点百分率为 91． 28%，表明供试材料间存在丰富的多态性．多态性
比率高则说明这个群体或是物种的遗传分化程度较高，对环境的适应能力强．分子标记中，当扩增的位
点 数超过70个时就基本上可以反映样本DNA的多样性信息［14］，本试验中9条引物共扩增出136条多
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图 3 基于应用 Jaccard系数和组平均法策略的 70 份样本圆形聚类树状图
图 4 基于 ISSR数据的 70 份样本聚类结果重排距离矩阵热图
态性条带，可以说基本上可以反映出鸭儿芹的遗传多样性状态．
植物居群的遗传结构反映了种的长期进化史，例如分布区变化、生境片断化和居群特化、突变、遗传
漂变、交配系统、基因流和选择等不同过程的相互作用［15］．在影响物种遗传结构的各个生活史特征中，
物种的繁育系统对其遗传多样性高低和结构影响较大．基因流的强弱对居群分化具有重要影响．一般认
为，当 Nm ＞ 1 时，基因流就可以防止由遗传漂变引起的居群之间的遗传分化．因此，在影响鸭儿芹遗传
变异方面，基因流比遗传漂变起着重要的作用．一般广布种植物的基因流(Nm = 1． 881)，而鸭儿芹的 Nm
值仅为 0． 3343，有限的基因流是导致鸭儿芹遗传分化的原因之一．
不同物种由于繁育系统上的差异，群体间的遗传分程度不同． 例如来自宁波、杭州、南京、滁州、合
肥、安庆和彭泽地区的 7 个明党参(Changium smyrnioides Wolff．)群体之间的 Gst 为 57． 7%［16］，这与本
研究中鸭儿芹的群体之间的该值相近;而长梗合被韭(Allium neriniflorum L．)的群体之间的 Gst 仅为
42． 18%，明显地比鸭儿芹的低［17］．
群体间亲缘关系研究和遗传多样性分析对于植物育种具有重要的意义，全面地掌握现有种质资源
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的遗传多样性，可以减少育种工作中亲本选配的盲目性［9］． 因此，人们在经济植物，例如一些中药材的
种质保育方面较多地应用这些方法．例如，隋春等建立了适于柴胡(Bupleurum chinense DC)的 ISSR分析
体系，并采用 ISSR技术分析了 3 份柴胡栽培种质个体间及种间的差异［18］． 刘义梅［19］等认为白花前胡
(Peucedanum praeruptorum Dunn)种质资源遗传变异丰富，遗传关系与产地具有一定的相关性，但不是严
格按地理来源进行聚类．
在实际的应用过程中可以可将 ISSR分析结果直接应用到鸭儿芹的选育工作中，选择亲缘关系较远
的材料，增加后代的遗传变异，选育出杂交优势强、综合性状好的优良品种［9］． 而且根据鸭儿芹的生物
学以及生态学特性，它适应于阴湿环境，种植于林下等遮蔽环境，可顺利度过长江中下游地区 6、7 月间
高温高湿的“梅雨”季节［20］．
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Genetic diversity of six populations of Cryptotaenia japonica
in Eastern China based on ISSR markers
LIU Xiaohui，SUN Bing，LOU Yuxia，GUO Shuiliang
(Development Center of Plant Germplasm Resources，College of Life and
Environmental Sciences，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China)
Abstract:Genetic diversity of six populations (including 70 individuals)of Cryptotaenia japonica Hassk，collected from Dapans-
han of Panan，Qinliangfeng of Linan，Chanhua of Linan，Beishan of Jinhua，Zhejiang，and Fengxian of Shanghai (cultivated pop-
ulation)were analyzed based on their ISSR markers． A total of 149 bands were amplified from nine selected primers，of which 136
were polymorphic，their percentage of polymorphic bands being 91． 28% ． Based on the ISSR markers of six C． japonica popula-
tions，their Neis genetic diversity index，Shannon information index，Nm index was 0． 1971，0． 3086，and 0． 3237，respectively．
Their genetic differentiation coefficient (GST)was 0． 5993，indicating that 59． 93% genetic differentiation exists among popula-
tions，and 40． 07% genetic differentiation exists within populations． Their gene flow was 0． 3343，indicating a low gene flow existed
among different populations of C． japonica in the studied areas，namely，a genetic drift has caused a strong genetic differentiation
of C． japonica among populations． Based on 136 locus information，a clustering dendrogram was constructed for the 70 individuals
to reveal their genetic relationships． Based on the clustering analysis，the individuals could be divided into five groups，among them
two populations collected from Jinhuashan were clustered into one group． The genetic differentiation among the five groups has a
strong relationship with their geographical localities． Therefore in the future，it should be pay attention that introduce and cultivate
Cryptotaonia japonica from different places of origin to enrich the genetic diversity of cultivated species．
Key words:Cryptotaenia japonica;ISSR molecular marker;cluster analysis;molecular marker
(责任编辑:顾浩然)
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