全 文 ：118 2013, Vol.34, No.23 食品科学 ※基础研究
蚕蛹源ACE抑制肽的分离纯化与结构研究
吴琼英1，杜金娟1，徐金玲1，贾俊强2，颜 辉1，桂仲争2
(1.江苏科技大学生物与化学工程学院，江苏 镇江 212018；2.中国农业科学院蚕业研究所，江苏科技大学，江苏 镇江 212018)
摘 要：目的：研究蚕蛹蛋白血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽的结构特征。方法：采用超滤、DEAE-52离子交换色
谱和Sephadex G-50凝胶色谱对蚕蛹蛋白酶解产物进行分离纯化，并利用液质联用对蚕蛹蛋白ACE抑制肽的结构特
征进行初步分析。结果：分离得到的组分2(IC50 0.072mg/mL)对ACE抑制活性较高，是分离纯化前的2.95倍，为蚕蛹
蛋白ACE抑制肽的主要组分。结论：组分2中ACE抑制肽的分子质量为226.34～983.61u，主要由2～8肽组成。
关键词：蚕蛹蛋白；ACE抑制肽；分离纯化；液质联用
Separation, Purification and Structural Analysis of Angiotensin-converting Enzyme (ACE) Inhibitory
Peptides from Hydrolysate of Silkworm Pupae Protein
WU Qiong-ying1，DU Jin-juan1，XU Jin-ling1，JIA Jun-qiang2，YAN Hui1，GUI Zhong-zheng2
(1. School of Biotechnology and Chemical Engineering, Jiangsu University of Science and Technology, Zhenjiang 212018, China；
2. Sericultural Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Jiangsu University of Science and Technology,
Zhenjiang 212018, China)
Abstract：Objective: In order to investigate the structural characteristics of angiotensin-converting enzyme (ACE)
inhibitory peptides from silkworm pupae protein. Methods: The ACE-inhibitory peptides from hydrolysate of silkworm
pupae protein were separated and purified by ultrafiltration, DEAE-52 ion exchange chromatography and Sephadex G-50 gel
filtration chromatography. Then, the structural characteristics of purified ACE-inhibitory peptides were analyzed by liquid
chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Results: Fraction 2 (IC50 0.072 mg/mL) with higher ACE-inhibitory activity
was obtained from silkworm pupae protein hydrolysate. This fraction was the major component of ACE-inhibitory peptides,
and its ACE-inhibitory activity was increased by 2.95 times over that of silkworm pupae protein hydrolysate. Conclusion: In
fraction 2, ACE-inhibitory peptides were mainly composed of the peptide fragments from dipeptide to octapeptide, and their
relative molecular weights were 226.34 to 983.61 u.
Key words：silkworm pupae protein；angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitory peptide；separation and
purification；liquid chromatography-mass spectrometry
中图分类号：TS201. 1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)23-0118-05
doi:10.7506/spkx1002-6630-201323025
收稿日期：2012-11-23
基金项目：江苏省自然科学基金面上项目(BK2012693)；江苏省科技支撑计划项目(BE2011389)；
江苏科技大学青年骨干教师支持计划项目(37210901)
作者简介：吴琼英(1975－)，女，副教授，博士，研究方向为生物资源开发与利用。E-mail：wuqy1@163.com
血管紧张素转换酶(angiotensin-Ⅰconverting
enzyme，ACE)抑制肽是一种生物活性肽，具有安全性高
和降血压平稳等优点[1]。ACE抑制肽通常在母体蛋白中没
有活性，只有通过酶解从母体蛋白中释放出来才能表现
出活性[2]。利用酶解法现已从不同食源蛋白中获得了具有
高活性的ACE抑制肽，如：草鱼蛋白[3]、鱿鱼明胶[4]、乳
清蛋白[5]、甘薯蛋白[6]、海蜇蛋白[7]和豇豆蛋白[8]等。因
此，酶解法已被广泛用于制备ACE抑制肽。
蚕蛹蛋白是蚕茧缫丝后的主要副产物之一，蛋白含
量约为65%左右[9]，主要被用于动物饲料[10-11]，经济价值
较低。本课题组采用Alcalase已成功从蚕蛹蛋白中水
解得到具有高活性的ACE抑制肽 [12]，这为蚕蛹蛋白的
进一步深加工和再利用提供了可能。本实验在前期实
验的基础上，采用超滤、DEAE-52离子交换色谱以及
Sephadex G-50凝胶色谱对蚕蛹蛋白ACE抑制肽进行分
离纯化，并通过液质联用对纯化的ACE抑制肽的结构
特征进行初步研究，为蚕蛹蛋白的高效利用和深度开
发提供资料支持。
※基础研究 食品科学 2013, Vol.34, No.23 119
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
马尿酰组氨酰亮氨酸 (HHL)、血管紧张素转换酶
(ACE) 德国Sigma公司；Alcalase 诺维信(中国)生
物技术有限公司；DEAE-52纤维素树脂、Sephadex G-50
上海奥宇生物科技有限公司；其余试剂为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
Pellicon小型超滤系统 美国Millipore公司；UV-
2100型分光光度计 美国尤尼柯(上海)仪器有限公司；
HL-2S恒流泵 上海沪西分析仪器厂；Thermo Scientific LXQ
线性离子阱质谱仪 美国Thermo Fisher Scientific公司。
1.3 方法
1.3.1 蚕蛹蛋白的制备
将鲜蚕蛹于120℃烘干，用80目粉碎机粉碎，经乙醚
脱脂后于60℃真空干燥，研碎得蚕蛹粉。取蚕蛹粉，用
蒸馏水配制成100g/L的悬浮液，调节pH值至8.0后持续搅
拌1h，在5000r/min离心10min，取上清液，然后将其pH
值调节至4.0，静置30min，5000r/min离心10min，收集沉
淀，透析后冷冻干燥备用。
1.3.2 具有ACE抑制活性的蚕蛹蛋白酶解产物的制备
采用Alcalase酶解蚕蛹蛋白制备具有ACE抑制活性
的酶解产物，酶解条件：底物质量浓度10g/L、酶解时间
120min、酶解温度50.8℃、酶解pH9.0、加酶量3500U/g。
1.3.3 蚕蛹源ACE抑制肽的分离纯化
1.3.3.1 超滤分离
分别依次采用截留分子质量10ku和5ku超滤膜对蚕蛹
蛋白酶解产物进行初步分离，分别收集分子质量＞10ku，
5～10ku和＜5ku组分，对所得组分进行冷冻干燥，然后取
样测定各组分的体外ACE抑制活性。超滤条件：进膜压力
1.30MPa，出膜压力0.30MPa，工作温度25℃。
1.3.3.2 DEAE-52离子交换分离
将超滤后的蚕蛹蛋白酶解产物用DEAE-52树脂进行分
离，分别收集各峰组分，冷冻干燥，取样测定各组分的体
外ACE抑制活性。分离条件：上样量2mL(5.50mg/mL)，洗
脱液为0.3mol/L NaCl溶液，洗脱液流速1mL/min，检测波
长280nm。
1.3.3.3 Sephadex G-50凝胶分离
将经DEAE-52柱层析分离的组分用Sephadex G-50凝
胶进行分离，分别收集各洗脱峰组分，进行冷冻干燥，
取样测定各组分的体外ACE抑制活性。分离条件：上样
量200μL，洗脱液为蒸馏水，洗脱液流速0.50mL/min，检
测波长为280nm，
1.3.4 液质联用分析
1.3.4.1 液相色谱条件
分析柱Zorbax反相柱(4.6mm×150mm，3μm)；流
动相为乙腈-水(20:80，V/V)(各含0.5mL/L TFA)；柱温
30℃；流速1.0mL/min；进样量20μL。
1.3.4.2 质谱条件
离子方式为EIS－和ESI+，鞘气流速35arb，辅助气流
速5arb，吹扫气流速0arb，毛细管温度300℃，毛细管电
压30V，透镜电压120V，喷雾电压4.5kV。
1.3.5 体外ACE抑制活性的测定
根据Muguerza等[13]报道的方法测定体外ACE抑制活
性，按下式计算抑制率。
AˉA1
A－A2Ι/% = h100
式中：I为ACE抑制率/%；A为空白组的吸光度；A1
为反应体系中没有加入ACE时的吸光度；A2为反应体系
中有ACE和酶解产物时的吸光度。
2 结果与分析
2.1 超滤分离蚕蛹源ACE抑制肽
蚕蛹蛋白酶解产物经超滤分离后得到3个组分(分子
质量＞10ku、5～10ku和＜5ku)，它们的ACE抑制活性如
图1所示。
0
20
40
60
80
ᵚ䎵└ >10ku 5̚10ku <5ku
䎵└࠶⿫㓴࠶
A
C
Eᣁ
ࡦ
⦷
/%
图 1 超滤对0.085g/L蚕蛹蛋白酶解产物ACE抑制活性的影响
Fig.1 Effect of ultrafiltration on the ACE-inhibitory activity of
hydrolysate from silkworm pupae protein
由图1可知，分子质量＜5ku和5～10ku组分的ACE
抑制活性均明显高于对照(未超滤)，其中，＜5ku组分的
ACE抑制活性最高。这主要是因为ACE抑制肽多由2～12
个氨基酸残基组成，分子质量多小于1.5ku[14-15]。因此，
选择＜5ku组分进行下一步分离纯化。
2.2 DEAE-52离子交换分离蚕蛹源ACE抑制肽
DEAE-52是一种阴离子交换树脂，常被用于分离生
物活性肽[16-17]，采用DEAE-52柱层析分离＜5ku组分，其
分离色谱图见图2，分子质量＜5ku组分被分离成3个组
分，其中，组分a为穿透部分，组分b和c为洗脱部分，且
组分b含量最高。各分离组分对ACE的抑制活性见图3，
与其他组分相比，组分b的ACE抑制活性最高。因此，选
择组分b进行下一步分离。
120 2013, Vol.34, No.23 食品科学 ※基础研究
0
200
400
600
0 20 40 60 80 100
ᰦ䰤/min
m
A
U
㓴࠶a
㓴࠶b
㓴࠶c
图 2 蚕蛹蛋白酶解产物分子质量＜5ku组分的DEAE-52色谱
Fig.2 DEAE-52 Chromatogram of fractions of less than 5 ku from the
hydrolysate of silkworm pupae protein
0
20
40
60
80
a b c
DEAE-52࠶⿫㓴࠶
A
C
Eᣁ
ࡦ
⦷
/%
图 3 0.085g/L组分a、b和c的ACE抑制活性
Fig.3 ACE-inhibitory activities of 0.085 g/L fractions a, b and c
2.3 Sephadex G-50凝胶分离蚕蛹源ACE抑制肽
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0 30 60 90 120 150 180
⍇㝡ᰦ䰤/min
A 2
80
nm 组分1
组分2
组分3
图 4 组分b的Sephadex G-50凝胶色谱
Fig.4 Sephadex G-50 gel chromatogram of fraction b
0
20
40
60
80
100
1 2 3
Sephadex G-50࠶⿫㓴࠶
A
C
Eᣁ
ࡦ
⦷
/%
图 5 0.085g/L组分1、2 和3的ACE抑制活性
Fig.5 ACE-inhibitory activities of 0.085g/L fractions 1, 2 and 3
Sephadex G-50凝胶进一步分离组分b的色谱见图4，
组分b被主要分成组分1、2和3。根据组分1、2和3的出峰
时间可以看出，各组分的分子质量分布大小依次为组分
1＞组分2＞组分3。各组分的ACE抑制活性(图5)可以看
出，组分2的ACE抑制活性明显高于组分1，这可能是由
于组分2的分子质量要小于组分1，因而包含了更多高活
性的ACE抑制肽。然而，尽管组分3的分子质量要小于组
分2，但其ACE抑制活性却明显比组分2的低，这可能是
因为ACE抑制肽的活性不仅与分子质量有关，而且与肽
链的空间结构和氨基酸组成有关[18-19]。经超滤、DEAE-52
离子交换和Sephadex G-50凝胶依次分离后得到的组分
2(质量浓度0.085g/L)的ACE抑制活性为85.2%，比未分
离(未超滤)的ACE抑制活性提高了194.8%，得到组分2的
IC50值为0.072mg/mL，因而选择组分2进行下一步纯化。
2.4 蚕蛹源ACE抑制肽的液质联用分析及结构预测
3.09
2.18
2.31
1.65
0.65
8.326.565.233.76
ጠĉ
ጠĊ
ጠċ22000
20000
18000
16000
14000
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0
m
A
U
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
ᰦ䰤/min
图 6 组分2的反相高效液相色谱
Fig.6 Reverse-phase high performance liquid chromatogram of fraction 2
组分2经反相高效液相色谱分离后共得到3个峰(图6)，
其中，峰Ⅲ为组分2的主要组分。利用一级质谱分析酶
解产物肽的分子质量分布已被报道，孙爱梅等[20]利用高
效液相色谱/质谱联用技术分析了胶原蛋白经变性和酶
解处理得到的多肽混合物，利用液相色谱质谱联用技术
识别出了特征肽段，得到的肽片段分子质量也主要集中
于1000u以下。本实验中峰Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的一级质谱见图
7，峰Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分别由多种ACE抑制肽组成，均为混
合物，峰Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ中含量最多的肽段分子质量分别为
474.58、284.94、474.63u，其中分子质量为474.63u的肽
链在组分2中含量最高。由于除了亮氨酸和异亮氨酸具
有相同分子质量外，其他氨基酸的分子质量互不相同。
因此，根据一级质谱提供的活性肽的分子质量能够推测
出它的氨基酸组成。组分2中ACE抑制肽的氨基酸组成
分析见表1，组分2主要由2～8肽组成，分子质量范围为
226.34～983.61u，这与目前公开发表的ACE抑制肽的分
子质量在300～1600u基本一致[21-24]。表1中，ACE抑制肽
主要含有Ala、Cys、His、Lys、Pro、Leu、Ile、Val、
Phe、Glu和Gln。其中，Ala、Cys、His、Lys、Pro、
Leu、Ile、Val均为疏水性氨基酸，而Phe为芳香族氨基
酸。Cushman等[25]认为当Trp、Tyr、Phe和Pro在肽链羧基
端时该肽的降血压活性较好；贾俊强等[12]研究发现，在高
活性的ACE抑制肽中，C端氨基酸残基主要为Pro、Tyr、
Ile、Phe、Leu和Trp，而且C端氨基酸特征对ACE抑制活性
影响比N端氨基酸特征更为重要。因此，根据ACE抑制肽
构效关系，推测出组分2中ACE抑制肽的C端可能为Ala、
Cys、His、Lys、Pro、Leu、Ile、Val和Phe等氨基酸。
总之，蚕蛹蛋白ACE抑制肽的结构特征基本符合公
※基础研究 食品科学 2013, Vol.34, No.23 121
认的ACE抑制肽构效关系，因而呈现出较强的体外ACE
抑制活性。
表 1 组分2中ACE抑制肽的相对分子质量分布及氨基酸组成预测
Table 1 Molecular weight distribution and predicted amino acid
composition of ACE-inhibitory peptides in fraction 2
实测分子质量/u 理论分子质量/u 肽链的预测氨基酸组成 备注
226.34～226.40 226.07 A,H 二肽
233.96～233.99 233.21 G,S,A 三肽
274.86
274.26 N,A,A
二肽或三肽274.30 Q,K
274.33 K,K
284.94～284.99 285.33 V,A,P 三肽
339.43～339.53 339.40 A,C,F 三肽
361.51～361.54 361.34 N,A,A,S；Q,K,S 三肽或四肽
361.41 K,K,S
452.62～452.67 452.54 A,H,I,I；A,H,L,L；A,H,I,L 四肽
474.58～474.64 474.58
K,K,S,I；N,A,A,S,I；
K,K,S,L；N,A,A,S,L；
Q,K,S,I；Q,K,S,L
三肽、四肽或五肽
550.75
550.60 K,H,V,A,P 五肽
550.64 H,Q,V,A,P
604.57～604.58 604.67 A,C,F,Q,H 五肽
604.71 A,C,F,K,H
781.93
781.92 K,H,V,A,P,Q,C；H,Q,V,A,P,Q,C 七肽
781.96 K,H,V,A,P,K,C；H,Q,V,A,P,K,C
854.48～854.49
854.97 A,C,F,Q,H,H,I；A,C,F,Q,H,H,L 七肽
855.01 A,C,F,K,H,H,I；A,C,F,K,H,H,L
967.59～967.60
968.13
A,C,F,Q,H,H,I,I；
A,C,F,Q,H,H,L,L；
A,C,F,Q,H,H,I,L
八肽
968.17
A,C,F,K,H,H,I,I；
A,C,F,K,H,H,L,L；
A,C,F,K,H,H,I,L
983.53～983.61
984.09 A,C,F,Q,H,H,I,E；A,C,F,Q,H,H,L,E 八肽
984.13 A,C,F,K,H,H,I,E；A,C,F,K,H,H,L,E
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
m/z
⴨
ሩ
Ѡ
ᓖ
/%
135.05
174.25
227.31
310.53
239.03
475.58
605.55
923.50
931.53
855.43
713.74
653.93
588.30
783.52
A
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
m/z
⴨
ሩ
Ѡ
ᓖ
/%
135.00
174.31
234.05
285.04
302.53
475.54
421.72
981.01
855.40
952.83
705.24
551.75
605.57
782.03
B
135.06
174.16
234.99
227.40
218.91
249.35
285.99
315.37 385.35
362.51
340.43 453.67
475.63
298.45
556.31
605.60
654.04
702.87
718.81
759.73
782.89
839.71
854.73
871.47
953.79
942.55
968.60
984.58
100
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
C
m/z
⴨
ሩ
Ѡ
ᓖ
/%
A. 组分Ⅰ；B.组分Ⅱ；C.组分Ⅲ。
图 7 组分Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的质谱图
Fig.7 Mass spectra of fractions Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ
3 结 论
蚕蛹蛋白酶解产物经超滤得到3个不同分子质量组
分，其中，分子质量＜5ku的组分经DEAE-52离子交换再
次分离为3个不同组分，对其中ACE抑制肽活性高的b组分
采用Sephadex G-50凝胶进一步分离纯化后，得到的组分2
的IC50值为0.072mg/mL，其ACE抑制活性比分离纯化前提
高了194.8%；液质联用分析表明，蚕蛹源ACE抑制肽的分
子质量范围为226.34～983.61u，主要由2～8肽组成。
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