全 文 ：[收稿日期 ] 2009-02-22　　[修改日期 ] 2009-03-21
[基金项目 ] 海南医学院科研基金资助项目(002009007)
[作者简介 ] 李晓峰(1973-),男 ,河南平顶山人 ,主治医师 ,在读博士 , Tel:13617811502, Email:lixiaofeng1973@yahoo.com.cn。
臭苜蓿根提取物对巨噬细胞血红素氧合酶 -1表达的影响
李晓峰 1 ,董艳玲 1 ,郭远瑾2 ,容琼文 2, 3 ,李燕华1 ,李吕力 1
(1.广西壮族自治区人民医院神经内科 ,广西 南宁　530021;2.华中科技大学附属协和医院神经内科 ,湖北 武汉　430022;3.
海南医学院附属医院神经内科 ,海南 海口　570102)
　　[摘要 ] 目的:探讨血红素氧合酶 -1在 LPS诱导急性炎症中的表达及臭苜蓿根提取物的干预作用 。方
法:通过脂多糖(LPS)干预 RAW264.7细胞系建立炎症细胞模型。实时荧光定量 RT-PCR法检测血红
素氧合酶-1(HO-1)的基因表达差异 , Westernblot法测定 HO-1的蛋白表达量 。结果:臭苜蓿根提取物
明显升高巨噬细胞 HO-1的 mRNA表达水平 , Westernblot结果显示 ,臭苜蓿根提取物干预后 HO-1的蛋
白表达水平也明显升高。结论:臭苜蓿根提取物能提高巨噬细胞 HO-1基因的表达 ,促进 HO-1的释放
而发挥一定的抗炎作用。
[关键词 ] 臭苜蓿根提取物;炎症;巨噬细胞;血红素氧合酶-1
[中图分类号 ] R392;R503　[文献标识码 ] A　[文章编号 ] 1007-1237(2009)06-0569-03
EfectofmelilotussuaveolensextractontheexpressionofHO-1 inmacrophagecel.
LI　Xiao-feng1 , DONG　Yan-ling1 , GUO　Yuan-jin2 , RONG　Qiong-wen2, 3 , LI　Yan-hua1 , LI　Lǜ-li1
(1.DepartmentofNeurology, PeoplesHospitalofGuangxiZhuang-AutonomousRegionNanning530021;
2.DepartmentofNeurology, AfiliatedUionHospitaltoTongjiMedicalColege, HuazhongUniversityofScience
adTechnologyWuhan430022;3.DepartmentofNeurology, AfiliatedHospitaltoHainanMedicalColegeHaik-
ou570102 , China)
[ FoundationProject] :ScientificResearchFundsSupportedProjectofHainanMedicalColege(002009007)
[ Author] :LIXiao-feng(1973-), Male, PingdingshanHenan, AtendingPhysician, M.D.Tel:13617811502
Email:lixiaofeng1973@yahoo.com.cn
Received:2009-02-22　　Accepted:2009-03-21 JHMC, 2009;15(6):569-571
Viewfromspecialist:Itiscreative, andofcertainscientificandeducationalvalue.
[ ABSTRACT] Objective:TostudytheexpressofHO-1onacuteinflammationinducedbyLPSandtheanti-
inflammatoryefectofthemelilotussuaveolensextract.Methods:InflammatorycelmodelwasconstructedbyLPS
actingRAW264.7 celline.TheexpressionofmRNAandproteinofHemeoxygenase1(HO-1)weredetectedby
real-timePCRandWesternblotmethod.Results:TheexpresionofHO-1 mRNAinmacrophagecelwassignifi-
cantlyenhancedbythemelilotussuaveolensextract.TheresultofWesternblotshowedthattheexpressionofHO-
1 proteinwassignificantlyincreasedaftertheinterventionofmelilotussuaveolensextract.Conclusion:Themelilo-
tussuaveolensextractcanresistinflammationbyenhancingtheexpresionofHO-1.
[ KEYWORDS] Melilotussuaveolensextracts;Inflammation;Macrophagecel;HO-1
　　HO-1(hemeoxygenase-1)是胆红素形成过程中
的限速酶之一 ,亦称热应激蛋白 32(HSP32),为可
诱导型 HO,分子量为 32 kD,主要分布于单核-巨噬
细胞系统的微粒体中 ,在脑 、脊髓 、心 、肝 、脾 、肺 、胰 、
肠 、皮肤 、血管平滑肌以及内皮细胞中均有表达 ,在
脾脏中活性最高[ 1] 。 HO-1可在缺氧 、缺血等多种应
569
海南医学院学报　2009, 15(6)JournalofHainanMedicalColege　
DOI :10.13210/j.cnki.jhmu.2009.06.011
激状态下表达 [ 2] 。臭苜蓿根 ,豆科(Leguminosae)草
木犀属(Melilotussuaveolens)1年生或 2年生草本植
物 ,是临床用于抗炎的一种中草药。臭苜蓿根产生
抗炎作用的分子生物学机制还不明确 。本实验拟通
过 LPS刺激 RAW 264.7小鼠巨噬细胞系建立炎症
细胞模型[ 3] ,采用实时荧光定量 RT-PCR法﹑ West-
ernblot法观察 HO-1在巨噬细胞中的表达以及臭苜
蓿根提取物在炎症中的作用。
1　材料和方法
1.1　实验材料与仪器
RPMI1640、Trizol购自 Gibico公司;LPS(Esche-
richiacoliO111:B4)和 MTT购自 Sigma公司;HO-1
羊抗鼠多克隆抗体购自 R＆DSystems公司;M-MLV
逆转录酶 、dNTP购自 Promega公司;SYBRGreen购
自 Biotium公司;Oligo(dT18)及引物由 Invitrogen公
司合成 。小鼠巨噬细胞系 RAW 264.7为同济医学
院冻存 。
1.2　实验方法
1.2.1　臭苜蓿根提取物的制备　取 50 g风干的臭
苜蓿根磨成粉末 ,用 700 mL/L乙醇于 85 ℃提取 3
次(1次 500 mL,每次 1.5 h),真空过滤浓缩提取
液 ,用去离子水稀释至 1 g/mL(药材:水)浓度 。取
5 mL浓缩液至 100 mL的分液漏斗中 ,连续石油醚
提取直至其干重达 0.425 g。用 RPMI1640培养基将
其稀释成 3种浓度 10mg/L、5mg/L和 1mg/L备用。
1.2.2　细胞培养　小鼠巨噬细胞系 RAW264.7使
用 RPMI1640培养液(加入 100 U/mL青霉素 , 100
mg/L链霉素和 100 ml/L胎牛血清), 50 mL/LCO2
培养箱中 37 ℃培养。
1.2.3　细胞模型的建立和干涉　 LPS处理前 24h
将细胞接种于 6、24或 96孔板上 , 24 h后细胞贴壁
后弃上清 ,加入含 LPS10 g/L的培养液和不同浓度
的提取物 ,作用不同时间后收集细胞 ,分别使用实时
荧光定量 RT-PCR法 、Westernblot法检测。
1.2.4　实验分组　实验共分 4组 。(1)阳性对照
组:地塞米松(DM)0.5 g/L作阳性对照;(2)阴性
对照组:黄芪多糖(APS)100 mg/L作为阴性对照;
(3)空白对照组:只用 10g/L的 LPS处理而不加药物
干预;(4)正常对照组:不用 LPS处理也不加药物干
预。
1.2.5　药物细胞毒性的检测　MTT法 ,在终止细
胞培养前 4 h加入 20 LMTT溶液 (浓度 5 g/L,
pH7.4),终止细胞培养后每孔加入 150 μLDMSO,
Spectramax250全自动定量绘图酶标仪测定 A490
值 。细胞病变效应(cytopathicefect, CPE)检测 ,细
胞在提取液中培养 24 h后在显微镜下观察细胞形
态以检测细胞病变 。
1.2.6　血红素加氧酶 -1(HO-1)mRNA水平的检测
　实时荧光定量 RT-PCR法检测 HO-1的基因表达 。
细胞干预 18 h后提取 RNA检测 HO-1的基因表达
量。细胞总 RNA提取采用 TRIzol试剂提取法 ,具体
方法参照说明书 。将总 RNA保存在 -80 ℃备用 。
RT-PCR在 ABIPrime7700 SequenceDetectionSys-
tem进行。引物序列:Mus-HO-1:Forward:5-CACA-
GATGGCGTCACTTCGTC-3 , Reverse: 5 -GTGAG-
GACCCACTGGAGGAG-3, Mus-β-actin:Forward:5-
GCTACAGCTTCACCACCACAG -3 , Reverse: 5 -
GGTCTTTACGGATGTCAACGTC-3。 RNA经逆转录
反应合成 cDNA, RT及 PCR反应体系按试剂盒说
明书进行(常规 PCR以逆转录产物为模板 ,实时荧
光定量 RT-PCR以常规 PCR扩增产物稀释后为模
板)。实验结果采用 ABIPrime7700 SequenceDe-
tectionSystem自带软件对数据自动分析后 , 用所给
Ct值应用公式 Folds=2-ΔΔCt进行基因表达差异
分析 [ 4] 。
1.2.7　HO-1蛋白水平的检测　Westernblot法检
测细胞中药物干预前 、后 HO-1的蛋白表达量的变
化。细胞干预 24 h后 ,冷 PBS洗涤 ,加入细胞裂解
液 ,冰上孵育 15 min,使用细胞刮刮下并收集裂解
液 , 10 000 rpm 4 ℃离心 10 min, 取上清保存于
-20 ℃冰箱。用 BCA法测定蛋白质浓度 , 取相同
量蛋白质用于 100 g/LSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳;
转移至硝基纤维素膜 , 50g/L脱脂奶粉溶液 37℃封
闭 1h;加入羊抗鼠 HO-1多克隆抗体(1∶200), 4 ℃
孵育过夜 ,洗膜;应用辣根过氧化物酶标记的二抗
(1∶200)室温孵育 1 h,再加入化学发光显色剂显色 ,
X光片曝光显影 , 凝胶成像分析系统扫描 , pro3.0
软件半定量分析。
1.3　统计学处理
应用 SPSS12.0统计分析软件包 ,采取单因素方
差分析对实验数据进行处理 ,以 P<0.05表示差异
有统计学意义 。
2　结果
2.1　药物对细胞的毒性
MTT实验结果显示 , 3种浓度(10mg/L、5 mg/L
和 1mg/L)药物干预细胞 24 h后对细胞活性没有
明显影响 。CPE结果亦如此(图 1、2)。
2.2　药物干预前 、后 HO-1的 mRNA水平
药物提取物干预后 HO-1水平明显升高 ,并且
药物浓度越高 , HO-1水平越高 ,呈现一个剂量依赖
型关系(图 3)。
2.3　药物干预前 、后 HO-1的蛋白水平
570 　海南医学院学报 Vol.15No.6Jun.2009
Westernblot结果显示 ,药物干预后 HO-1的蛋
白水平明显升高(图 4),之间的差异有统计学意义
(P<0.01)。
注:A:正常巨噬细胞;B:10mg/L药物干预后巨噬细胞。
图 1　CPE结果
图 2　MTT结果
注:与空白对照组比较 , ＊P<0.01。
图 3不同组 HO-1的 mRNA水平
3　讨论
巨噬细胞在炎症的启动过程中起着非常关键的
作用 ,它通过激活机体的免疫系统 ,释放细胞因子 、
有生物活性的脂类介质及活性氧等一系列炎症介质
参与炎症反应 [ 5] 。根据其对炎症反应的促进或抑
制效应的不同 ,这些炎症介质大致上可分为两类:促
图 4　不同组 HO-1的蛋白水平
炎介质和抗炎介质 ,两者的比例关系及动态变化是
决定炎症转归的关键因素 [ 6] 。当细胞面临有毒性
的化学物质或病原体侵袭的时候 ,机体的免疫系统
会释放出 HO-1。炎症反应过程中 ,在炎症介质产生
的同时抗炎因子 HO-1也被分泌和活化 , HO-1的过
表达可直接或间接地抑制炎症连锁反应 。HO-1是
催化血红素降解的限速酶 ,从而生成胆绿素 、游离铁
和 CO。研究表明 ,它们不仅能清除机体的活性氧 ,
还能抑制多种促炎介质的产生 ,促进多种抗炎介质
的表达 ,并且拮抗一些炎症介质的细胞毒效应[ 7, 8] 。
臭苜蓿根提取物能通过抑制促炎介质和细胞因
子 TNF-α、IL-1、IL-6、NO的产生发挥抗炎作用 。同
时 ,臭苜蓿根提取物也对抗炎介质产生一定的影响。
本实验结果显示 ,臭苜蓿根提取物能促进 HO-1的
表达和释放 ,且该作用呈剂量依赖性。以上结果表
明 ,臭苜蓿根提取物能通过促进 HO-1的基因表达
和释放从而发挥抗炎作用。本实验选用地塞米松和
黄芪多糖分别作为阳性和阴性对照 。地塞米松是传
统的抗炎药物;黄芪多糖是临床上用于增强免疫的
免疫调节剂 ,能够增强促炎因子的释放 [ 9] 。
本研究从分子水平探讨了臭苜蓿根提取物的体
外抗炎活性及其可能的分子机制 。通过本实验发
现 ,臭苜蓿根提取物能抑制促炎症介质的表达 ,并促
进抗炎介质的表达 ,从而产生广泛的抗炎作用。
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(下转第 575页)
571李晓峰等.臭苜蓿根提取物对巨噬细胞血红素氧合酶-1表达的影响　
的血管和结构已经破坏的血管扩张 , BBB的结构也
进一步破坏 ,从而使通透性明显增加。血管通透性
的增加 、血管内液体的外渗引起组织水肿 ,组织水肿
又可导致脑血流减少 ,减低的脑血流可能降低了尼
莫地平在解除血管痉挛中的作用 。因此 ,尼莫地平
可能加重再灌注后的高灌流 ,使微血管内压力升高 ,
进一步增加 BBB通透性 ,加重脑损伤。
总之 ,脑损伤后应用钙离子拮抗剂可能对脑组
织不能起到保护作用 。在脑损伤急性期应禁用或慎
用钙离子拮抗剂 , 以免加重脑损伤。通过抑制
AQP4表达变化 ,这可能是临床治疗脑水肿的一种
有效途径。还需要进一步研究可以抑制 AQP4表达
变化的药物 。
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