全 文 ：微生物学通报 Jul. 20, 2013, 40(7): 11861192
Microbiology China © 2013 by Institute of Microbiology, CAS
tongbao@im.ac.cn
基金项目：北京市自然科学基金项目(No. 5112010); 北京市教委资助项目(No. KM200910020001)
*通讯作者：Tel: 86-10-80799136; : liuzhimin600@sina.com
收稿日期：2012-12-24; 接受日期：2013-02-04
研究报告
桃根癌病菌拮抗放线菌抑菌物质的
分离纯化与结构鉴定
侯柄竹 王树芳 马焕普 刘志民*
(北京农学院 植物科学技术学院 北京 102206)
摘 要: 【目的】为明确根癌拮抗放线菌 G-19 的抑菌活性物质。【方法】采用 Sephadex
LH-20 柱层析、高效液相色谱及中压制备色谱等技术, 对桃根癌拮抗放线菌 G-19 发酵液
中的抑菌活性成分进行分离纯化, 并通过 LC-MS、NMR 对其结构进行鉴定。【结果】分
离得到化合物 G-19-I的结构为邻苯二甲酸二丁酯(DBP), 化合物 G-19-II的结构为 2-(4-羟
基苯基)-3,4-二氢-2H-苯并吡喃-3,4,5,7-四醇, 俗称无色天竺葵素。【结论】阐明了放线菌
G-19抑菌活性成分的物质基础。
关键词: 桃树根癌病, 放线菌, 邻苯二甲酸二丁酯, 无色天竺葵素
Identification of antimicrobial composition isolated and
purified from antagonistic actinomycetes against
Agrobacterium tumefaciens of peach
HOU Bing-Zhu WANG Shu-Fang MA Huan-Pu LIU Zhi-Min*
(College of Plant Science and Technology, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China)
Abstract: [Objective] To isolate and identify the antimicrobial active component extracted
from fermentation broth of antagonistic actinomycetes strain G-19 against peach crown gall
(Agrobacterium tumefaciens). [Methods] Sephadex LH-20 chromatography, HPLC and mid-
DOI:10.13344/j.microbiol.china.2013.07.005
侯柄竹等: 桃根癌病菌拮抗放线菌抑菌物质的分离纯化与结构鉴定 1187
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dle-pressure chromatography were used for isolation and purification. LC-MS, NMR were ap-
plied to identify structure of the active component. [Results] Compound G-19-I was isolated
and structurally identified as 1,2-benzenedicarboxylic acid, 1,2-dibutyl ester (DBP); compound
G-19-II was isolated and structurally identified as 2-(4-hydroxyphenyl)-3,4-dihydro-
2H-chromene-3,4,5,7-tetrol, commonly known as leucopelargonidin. [Conclusion] The mate-
rial basis of the antibacterial constituents in antagonistic actinomycetes strain G-19 was further
clarified.
Keywords: Peach crown gall, Actinomycetes, Dibutyl phthalate, Leucopelargonidin
桃树根癌病(亦称冠瘿病)是一种世界范围的植
物细菌肿瘤病害, 是根癌土壤杆菌(Agrobacterium
tumefaciens)通过自然转基因方式引发的基因病
害[1−4]。桃树根癌病在我国江苏、浙江、福建及上
海郊区普遍发生, 北京南口农场桃树根癌病发病
率为58.2%−100%[5]。桃树染病后在根及根茎部形
成大小不等的肿瘤, 影响根部的水分和养料吸
收, 病株常表现为叶黄、势弱, 使果实产量和品
质下降, 严重的甚至毁园、绝收。
目前桃树根癌病在生产上主要以化学农药和
抗生素防治为主, 虽有一定效果, 但经长期实践
证明, 应用生物菌株对根癌病进行生物防治效果
更佳 , 且价钱便宜 , 有利于保护环境和生态平
衡。所以生物防治是解决根癌病的有效切入点。
应用较早且非常有效的生物制剂是 1972 年 Kerr
从土壤杆菌中分离得到的放射土壤杆菌 K84 菌
株, 对核果类果树及其近源花卉的根癌病具有良
好防效[6]。近年来我国报道分离出的放射土壤杆
菌 HLB-2、E26和 M115对葡萄根癌病菌有明显
抑制作用, 经大田试验防效为 85%−100%[7]。2004
年王关林等筛选出高产细菌素的菌株WJK84-1,
其产生的细菌素可抑制根瘤发生, 抑瘤率达到
83.4%左右[8]。
G-19 系本实验室从桃高发根癌病的再植土
壤中以 KCN 为选择压力分离得到的一株生防放
线菌, 该菌株的发酵产物对桃根癌土壤杆菌具有
较明显的抑制作用[9], 采用蛋白沉淀法及液相色
谱法对 G-19 菌株主要活性抑菌物质进行分离纯
化, 得到分子量范围为 900−1 300 Da含有糖基的
抑菌肽[10]。本文拟对 G-19 发酵产物的小分子活
性组分进行分离纯化和鉴定, 为开发高防效桃树
根癌病的生物制剂提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
供试病原菌: 桃根癌土壤杆菌(Agrobacterium
tumefaciens), 购于中国农业大学。
供试生防菌株: 从桃高发根癌病的土壤中分
离出的具有耐氰效应的放线菌 G-19。
1.2 生防放线菌发酵液的制备
将菌株 G-19 接种到高氏 1 号液体培养基中,
28 °C、120 r/min摇床培养 7 d后, 滤除菌体和发
酵残渣, 取上清液加固体硫酸铵至 60%饱和度,
静置 12 h后, 4 °C、12 000 r/min离心 10 min, 收
集上清液部分。
1.3 萃取有机溶剂的筛选
将预处理过的 G-19 发酵上清液分别用等体
积的乙酸乙酯、正丁醇、氯仿萃取 2 次, 合并萃
取液, 40 °C 减压浓缩至干, 得抑菌物质粗提物,
经抑菌效果测定确定最佳有机溶剂种类。
1.4 生防放线菌抑菌物质的分离
采用Sephadex LH-20柱层析对抑菌粗提物进
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行分离。用分段洗脱法, 洗脱梯度水:甲醇(V/V)
依次为 7:3、5:5、3:7、1:9。每个梯度用 1倍体积
洗脱液, 流速控制在 0.8−1.0 mL/min。用核酸蛋
白检测仪在 254 nm 下监测, 并根据出峰情况分
部收集。减压浓缩后, 以根癌土壤杆菌为指示菌,
采用 K-B滤纸片法测定各组分抑菌效果, 活性较
强部分作为下一步骤的起始样品进一步纯化。
1.5 生防放线菌抑菌物质的纯化
抑菌活性组分分别经过高效液相色谱仪和中
压制备色谱仪进行纯化和富集。样品经 0.22 μm
微孔滤膜过滤, 流动相: 甲醇和水, 梯度洗脱:
30%甲醇, 0−10 min; 30%−60%甲醇, 10−20 min;
60%−80%甲醇, 20−30 min; 80%−90%甲醇, 30−40
min; 90%−50%甲醇, 40−50 min; 254 nm 紫外检
测; 柱温 25 °C。高效液相色谱(Agilent 1100型)
的色谱柱为 ZORBAX Eclipse XDB-C18 (4.6 mm×
150 mm, 5 µm), 流速为 1.0 mL/min, 进样量为
10 μL; 中压制备色谱(PROSTAR210 型)的色谱
柱为Waters COSMOSIL 5C18-MS-II (20 mm×
250 mm), 流速为 10 mL/min, 进样量为 200 μL。
经制备色谱后, 收集冷冻干燥后的样品备用。
1.6 生防放线菌抑菌活性成分的结构鉴定
采用液质联用(LC-MS)和核磁共振(NMR)对
所得纯品进行结构推断[11]。
2 结果与分析
2.1 生防放线菌抑菌物质的最佳萃取溶剂
通过用正丁醇、乙酸乙酯和氯仿进行萃取,
经生物活性测试, 结果表明乙酸乙酯萃取的效
果最好(表 1), 故上清液的活性成分使用乙酸乙
酯萃取。
2.2 生防放线菌抑菌物质分离后的抑菌活性
采用 Sephadex LH-20 层析柱对生防放线菌
G-19的粗提物进一步分离, 经过 254 nm紫外检
测, 共分离得到 9 个组分, 其抑菌活性测定结果
见表 2。
从表 2 可以看出, 对桃根癌土壤杆菌抑制作
用较强的是组分 7, 通过高效液相色谱分析发现,
组分 7的峰谱是由两个较大的色谱主峰和一些较
小峰组成的杂峰组(图 1), 经生物测定显示, 保留
时间在 4.802 min和 21.946 min时出现的较高峰
有抑菌活性。
按照之前用 HPLC 确立的分析条件, 调节流
速至 10 mL/min的情况下, 用中压制备色谱对组
分 7进行纯化富集, 得到较纯的化合物 G-19-I共
100.9 mg, G-19-II共 30.5 mg。将得到的纯品用分
析型高效液相色谱仪分析, 其纯度的分析图谱见
图 2。
表 1 发酵液有机溶剂萃取后有机相与水相的抑菌作用
Table 1 Inhibition effect of the organic phase and water phase extracted by different solvents
抑菌作用
Bacteriostasis
乙酸乙酯
Acetic ether
正丁醇
N-butyl alcohol
氯仿
Chloroform
有机相抑菌圈直径
Organic bacteriostatic diameter (mm)
17.57 10.03 0
水相抑菌圈直径
Aqueous bacteriostatic diameter (mm)
0 8.35 20.24
注: 抑菌圈直径为 3次重复平均值.
Note: The diameter of inhibition zone was the average value of 3 replicates.
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表 2 G-19抑菌粗提物经 Sephadex LH-20后所得组分对桃根癌土壤杆菌的抑制作用
Table 2 Inhibitory effect of fractions via Sephadex LH-20 against A. tumefaciens
组分
Fractions
外观性状
Appearance characters
得率
Yield (%)
抑菌圈直径
Bacteriostatic diameter (mm)
1 白色粉末 3.81 6.00 G
2 白色粉末 2.35 6.00 G
3 白色粉末 4.40 6.00 G
4 淡黄色絮状 5.57 6.86 E
5 淡黄色固体 18.18 6.63 F
6 黄棕色油状 22.58 11.28 B
7 浅黄色油状 11.85 21.81 A
8 浅黄色油状 9.68 7.45 D
9 浅黄色油状 21.58 9.32 C
注: 对照抑菌圈直径为 6.00 mm; 表中所列数据为 3次重复的平均值; 数据后标有 AG不同大写字母表示在 1%水平上有显
著性差异.
Note: The antibacterial diameter of control is 6.00 mm; Data in the table are the average of 3 replicates; Data with AG of different
capital letters indicate the significant difference at 1% level.
图 1 组分 7的高效液相分析图
Fig. 1 HPLC chromatogram of constituent 7
图 2 组分 7纯化得到的 G-19-I和 G-19-II纯品的高效液相分析图
Fig. 2 HPLC chromatogram of compound G-19-I and G-19-II from constituent 7
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表 3 化合物 G-19-I的 δ及其 HMQC和 HMBC相关信息
Table 3 The δ of compound G-19-I andits information of HMQC and HMBC
δ (ppm) C的类型
Type of C
HMQC相关的 δ
δ of relate to HMQC (ppm)
HMBC相关的 δ
δ of relate to HMBC (ppm)
167.87 C=O 7.71, 4.29
132.28 C 7.60, 7.71
131.00 −CH= 7.60 7.71
128.57 −CH= 7.71 7.60
65.03 CH2 4.29 1.72, 1.44
30.41 CH2 1.72 4.29, 1.44, 0.97
18.94 CH2 1.44 4.29, 1.72, 0.97
12.80 CH3 0.97 1.72, 1.44
2.3 化合物 G-19-I的结构鉴定
化合物 G-19-I为淡黄色油状液体, 易溶于甲
醇、乙醚、丙酮等有机溶剂。ESI-MS 结果显示,
[M+Na]=301.27, [2M+Na]+=579.07, 推测该物质
分子量M=278。
化 合 物 G-19-I 的 1H-NMR (CD3OD,
600 MHz) δ: 7.71 (2H, dd, J=3.5, 5.5 Hz, H-3,
H-6), 7.60 (2H, dd, J=3.5, 5.5 Hz, H-4, H-5), 4.29
(4H, t, J=6.6 Hz, H-8, H-8), 1.72 (4H, m, H-9,
H-9), 1.44 (4H, m, H-10, H-10), 0.97 (6H, t,
J=7.3 Hz, H-11, H-11)。其中在低场处显示出 2组
芳香质子信号 (δ 7.71, 7.60)。13C-NMR (CD3OD,
150MHz) δ: 167.9 (C-7, C-7), 132.3 (C-1, C-2),
131.0 (C-4, C-5), 128.6 (C-3, C-6), 65.0 (C-8,
C-8), 30.4 (C-9, C-9), 19.0 (C-10, C-10), 12.8
(C-11, C-11)。其中在高场处显示出 1个甲基信号
(δ 12.8) 和 2个亚甲基信号 (δ 19.0, 30.4), 此外
还有 1个连氧的亚甲基信号(δ 65.0), 低场处显示
2 个次甲基信号 (δ 128.6, 131.0), 1 个季碳信号
(δ 132.3)和 1个羰基信号 (δ 167.9)。结合电喷雾
质谱图得出的分子量, 推测该化合物可能为对称
结构分子, 其分子式可能为 C16H22O4。
化合物 G-19-I 的 HMQC、HMBC 和 COSY
谱图见表 3和表 4。
依据 HMBC和 COSY显示的 CH远程相关
信息和 HH 相关信息, 将该化合物的各个基团
相连, 结合以上 NMR 数据分析, 确定化合物
G-19-I 为邻苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate),
分子量 278, 分子式 C16H22O4, 结构式见图 3。
2.4 化合物 G-19-Ⅱ的结构鉴定
化合物 G-19-II为橘黄色粉末, 易溶于甲醇。
分子量 290, 分子式 C15H14O6。
化 合 物 G-19-II 的 1H-NMR (CD3OD,
400 MHz) δ: 7.22 (2H, d, J=8.4 Hz, H-2, H-6),
6.79 (2H, d, J=8.4 Hz, H-3, H-5), 5.91 (1H, s,
H-6), 5.83 (1H, s, H-8), 4.59 (1H, d, J=7.6 Hz,
H-2), 4.41 (1H, dd, J=10.8, 8.4 Hz, H-4), 3.99
(1H, dd, J=8.0, 8.4 Hz, H-3)。13C-NMR (CD3OD,
100 MHz) δ: 157.8 (C-8α), 157.2 (C-7), 157.0 (C-5),
表 4 化合物 G-19-I的 1H-1H COSY信息
Table 4 The 1H-1H COSY information of
compound G-19-I
δ (ppm) H的类型
Type of H
1H−1H COSY
7.71 Phenyl-H 7.60
7.60 Phenyl-H 7.71
4.29 −OCH2− 1.72
1.72 CH2 4.29, 1.44
1.44 CH2 1.72, 0.97
0.97 CH3 1.44
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图 3 化合物 G-19-I的结构及其 C和 H的化学位移
Fig. 3 The structure of compound G-19-I and its δ of C and H
156.4 (C-4), 130.9 (C-1), 129.0 (C-2, C-6), 115.4
(C-3, C-5), 100.2 (C-4α), 95.6 (C-6), 94.8 (C-8),
82.2 (C-2), 68.2 (C-3), 28.3 (C-4)。
从 1H-NMR 可见, 苯环区有 6 个 H, 其中 4
个双峰 H (δ 7.22, 7.22, 6.79, 6.79), 2个单峰 H
(δ 5.91, 5.83), 可见有 2个苯环存在; 高场区有 3
个 H (δ 4.59, 4.41, 3.99), 表明为非苯环 H, 从峰
形来判断应为黄烷醇类化合物。从 13C-NMR可见,
苯环上有 3个连氧取代基(δ 157.2, 157.0, 156.4)。
结合以上 NMR 数据分析, 推测化合物 G-19-Ⅱ
的结构为 2-(4-羟基苯基)-3,4-二氢-2H-1-苯并吡
喃-3,4,5,7-四 醇 , 俗 称 为 无 色 天 竺 葵 素
(Leucopelargonidin), 结构式见图 4。
3 讨论
邻苯二甲酸二丁酯, 又称DBP, 曾在微生物
的次级代谢产物中多次分离得到, 并显示出一定
的生物活性。Savard E. 等[12]从青霉菌 Penicillium
图 4 化合物 G-19-Ⅱ的结构
Fig. 4 The structure of compound G-19-Ⅱ
bilaii PB-50 的次级代谢产物中分离得到该化合
物。EL-Naggar[13]的研究表明链霉菌 Streptomyces
nasri submutant H35产生的邻苯二甲酸二丁酯具
有抑菌活性。ROY 等[14]报道了链霉菌 S. albi-
doflavus 产生的 DBP 对 G+细菌、G−细菌及单细
胞和丝状真菌都有较强的抑制作用。刘伟等[15]从
一株海洋小链霉菌 DY2741中分离出了主要抗菌
物质 DBP, 对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有较好
的抑菌效果。万伍卿等[16]的研究表明 DBP 能抑
制慢性白血病细胞系 K562 细胞增殖并诱导其凋
亡。曲新颜等[17]报道了海洋放线菌 3295 产生的
邻苯二甲酸二丁酯对小鼠乳腺癌温敏型 tsFT210
细胞具有 G0/G1期细胞周期抑制作用。
无色天竺葵素是一种无色花色素, 是花色素
苷和其他类黄酮生物合成途径中的中间代谢产
物[18]。目前, 在花色素苷的抑菌性研究方面已经
获得了许多研究成果。卢成瑛等[19] 檵研究表明 木
花红色素具有抗菌活性。王关林等[20]报道了甘薯
块根花青素对 3种常见致病菌均有抑菌作用。杨
晓玲等[21]的研究表明, 彩叶草叶片色素对枯草
芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有较好的
抑制作用。孙希云等[22]研究表明, 红树莓花色苷
粗提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢
杆菌均有较好的抑制作用。本研究表明无色天竺
葵素对桃根癌农杆菌有较强的抑菌作用, 但关
于无色天竺葵素其他方面抑菌活性的报道尚未
见到。
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4 结论
本研究采用乙酸乙酯液液萃取、Sephadex
LH-20 柱层析及制备高效液相色谱等技术对桃根
癌拮抗放线菌 G-19 发酵液中的抑菌活性成分进
行分离纯化, 得到了 2 个抑菌活性化合物 G-19-I
和 G-19-II, 经 LC-MS、NMR 分析, 确定化合物
G-19-I的结构为邻苯二甲酸二丁酯(DBP), 化合
物 G-19-II的结构为 2-(4-羟基苯基)-3,4-二氢-2H-
苯并吡喃-3,4,5,7-四醇, 俗称无色天竺葵素。
参 考 文 献
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