全 文 ：中国农业科学 2012,45(2):246-254
Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.02.006

收稿日期：2011-04-15；接受日期：2011-06-21
基金项目：国家自然科学基金（30871664）、国家重点实验室专项经费（2060204）
联系方式：尹丹韩，Tel：021-64250690；E-mail：yindanhan@163.com。通信作者王 伟，Tel：021-64253707；E-mail：weiwang@ecust.edu.cn


生防菌哈茨木霉 T4 对黄瓜根围
土壤细菌群落的影响
尹丹韩，高观朋，夏 飞，王 伟
（华东理工大学生物工程学院/生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237）

摘要：【目的】评价生防菌哈茨木霉（Trichoderma harzianum）T4 对根围土壤细菌群落的影响，为生防菌
田间应用的生态安全提供依据。【方法】结合 DGGE 技术与 T-RFLP 方法，综合考察引入生防菌哈茨木霉 T4 后黄瓜
根围土壤细菌群落变化。【结果】在引入生防菌的 14—56 d 内（黄瓜整个生育期），木霉对根围土壤细菌群落可
产生显著影响，并持续一段的时间，随后逐渐减弱。表现为对蓝细菌、β-变形细菌、葡萄球菌、伯克霍尔德菌、
沙雷氏菌、酸杆菌和一些不可培养细菌的有效抑制作用，对芽孢杆菌、土壤杆菌、芽单胞菌的明显促进作用。但
到 70 d 时，即收获后 2周，检测不到木霉对细菌群落影响。【结论】DGGE 和 T-RFLP 序列分析技术相结合研究生
防菌对土壤细菌群落的影响，既能全面描述土壤细菌群落结构变化，还可以初步定性描述变化细菌的种类信息。
生防菌哈茨木霉 T4 的引入对土壤细菌群落产生短期影响，不会长期对土壤细菌群落稳定构成威胁。
关键词：哈茨木霉 T4；土壤细菌群落；T-RFLP；DGGE

Effects of the Introduction of Biocontrol Agent Trichoderma harzianum
T4 on the Bacterial Community in Cucumber Rhizosphere
YIN Dan-han, GAO Guan-peng, XIA Fei, WANG Wei
(Bioegineering Institute, East China University of Science and Technology/State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,
Shanghai 200237)

Abstract: 【Objective】The objective of this study is to analysis the impact of T. harzianum T4 introduction on the indigenous
bacterial community of rhizosphere soil, and to provide objective biosafety evaluations for the field application of biocontrol agents.
【Method】 Comprised molecular tools DGGE and T-RFLP were used in this study to assess the modifications of the bacterial
community in cucumber rhizosphere after inoculation with T. harzianum T4. 【Result】 Introduction of T. harzianum T4 in the soil
resulted in significant variations of the bacterial community structures from 14 to 56 days post-inoculation. During this period the
impact of T4 was sustainable and weakened gradually. T. harzianum T4 could restrain effectively Cyanobacterium,
Beta-proteobacterium, Staphylococcus, Burkholderia, Serratia, Acidobacterium and some kinds of soil uncultured bacterium, while
it improved the growth of Bacillus, Agrobacterium and Gemmatimonadetes observably. On 70th day after T. harzianum T4
introduced, as 2 weeks after harvest, there was no prominent alteration of bacterial community due to inoculation with T4.
【Conclusion】 Tracking of the modifications of the indigenous bacterial community by 16S rDNA DGGE and T-RFLP analysis not
only described comprehensively the variations of the structure of soil bacterial community, but also showed the preliminary and
qualitative information of bacterial community change. In general, the application of T. harzianum T4 exerted only transient impact
on the bacterial community of cucumber rhizosphere in systematic field investigation, but the perturbation was unable to imperil the
bacterial community stability in the long-term.
Key words: Trichoderma harzianum T4; soil bacterial community; T-RFLP; DGGE
2 期 尹丹韩等：生防菌哈茨木霉 T4 对黄瓜根围土壤细菌群落的影响 247
0 引言
【研究意义】随着人们对环境保护和自身健康的
日益关注，生防微生物已越来越多地应用于农业植物
病害防治[1]。为保证发挥理想的生防效果，生防微生
物的施用量往往足够大。尽管大多生防菌来自于环境
和土壤本身，与土壤及植物具有较好的相容性，但大
量的生防微生物集中释放到田间很有可能对土壤土著
微生物群落构成威胁[2]。同时不同生防菌与土著微生
物之间有可能出现特定的交互作用。因此在新生防微
生物商品化之前，必须进行生防菌田间应用的土壤微
生态风险评估[3]。【前人研究进展】土壤是一个非常
复杂的生态系统，土壤微生物群落异常丰富。目前在
外来微生物对土壤微生物群落影响研究中，最常用的
方法是 DGGE 和 T-RFLP 技术[4-8]。T-RFLP 是一类半
定量的分析方法[9-10]，具有高通量、快速、灵敏、重
复性高等优点[11-13]，非常适合用于分析物种的多样性
和均匀度。但由于序列数据库的不完整、TRF 长度的
误差等因素，单纯地通过在数据库中比对 TRF 长度来
对 T-RFLP 的“峰”进行系统发育分析显然存在着一
定的缺陷[14-16]，朱伟杰等[17]选用 Hha I、Msp I、Hae Ⅲ
限制性内切酶分别对土壤样本中细菌群落变化进行
T-RFLP 分析，综合 3 种酶切结果进行 TRF 发育分析，
发现即使采用多重酶切分析 TRF，单一 TRF 仍包含多
个细菌种属信息，最后得到的变化种群信息比较模糊。
DGGE 方法最大的优势是可以通过对条带的回收测序
获得样品中具体物种信息，但并不是所有的 PCR 扩增
产物都能在 DGGE 电泳中得以分离[18]，DGGE 分析的
灵敏度要比 T-RFLP 技术低[19-20]。因此无论单独采用
哪种方法获得的土壤微生物群落变化信息可能都不够
全面。【本研究切入点】木霉菌（Trichoderma spp.）
是一类非常优秀的生防有益菌，不仅对植物病原真菌
具有广谱拮抗活性，还具有促进植物生长的作用[21-22]。
目前发现木霉至少对 18 个属 29 种植物病原真菌具有
拮抗活性[23]，而且现已有商品化的木霉制剂问世。木
霉对靶标微生物的作用及作用机制已得到了广泛深入
研究，但关于其对土壤微生物群落影响的报道很少，
尤其是对细菌群落影响的研究。虽然木霉作用的靶标
微生物多为真菌，但由于木霉的竞争能力较强，且其
产生的某些次级代谢产物往往也具有抗细菌活性，例
如木霉Peptaibols及Trichopolyns抗菌肽能够强烈抑制
革兰氏阳性菌的生长[24]。因此将大量木霉活菌制剂释
放到田间，可能会对土壤细菌群落造成一定的影响，
进而使小范围的土壤环境发生变化。郁雪平等[25]运用
传统培养法和T-RFLP研究哈茨木霉T4对甜瓜根围土
壤微生物的影响，分析了 T4 对土壤可培养微生物数
量及末端标记限制性片段的影响，但未对 T-RFLP 数
据进行深入分析。因此由 T4 引起的土壤微生物群落
结构的变化以及变化群落的具体信息还是未知的。【拟
解决的关键问题】本研究拟将 T-RFLP 以及 DGGE 技
术相结合，分析哈茨木霉 T4 田间释放后黄瓜根围土
壤细菌群落结构的变化，并获得变化菌群的信息，为
木霉 T4 田间应用的生态安全提供理论依据，并建立
成熟可靠的微生物生态评价方法。
1 材料与方法
1.1 供试生防菌株及其培养
生防菌哈茨木霉 T4 由华东理工大学生物反应器
工程国家重点实验室筛选并保存，采用麦麸液体培养
基（麸皮 5 g，(NH4)2SO4 2 g，KH2PO4 1 g，CaCO3 1 g，
葡萄糖 20 g，水 1 000 mL， pH 5.5—6.0），在 28℃，
150 r/min 条件下培养。田间施用时稀释至 1×105
cfu·mL-1。
1.2 试验时间、地点及供试作物
试验时间：2010 年 5—7 月；试验地点位于上海
青浦区徐泾镇，国家南方农药创制中心（N31°，
E121°）；试验田土质为沙壤质，pH 4.4—4.8，土壤含
水量 15%—24%；试验植物为黄瓜。试验田周边作物
种类为玉米、番茄等，且无饲养动物。
1.3 试验设计
将试验田分成 8 个小区，每个小区有 10 株黄瓜。
试验设 2 个处理，（1）对照，不引入生防菌；（2）
T4，引入哈茨木霉 T4。4 次重复，8 个小区随机排列。
生防菌引入方法：在黄瓜苗期灌根，大约每棵苗灌 100
mL 菌液，对照组每棵苗灌 100 mL 清水。
1.4 土壤取样
取土方式：每个处理随机选取 5 株植株，将植株
的根从土壤中取出，用力抖落根部附着土，抖下土壤
为根围部分，然后将取得的土样混合并装入无菌密封
袋带回实验室，每次获得的土样样品大约 30 g，对土
样立即进行相关分析或置于 4℃冰箱保存。分别于引
入生防菌后 7、14、21、28、42、56、70 d 取样。56 d
后黄瓜生育期结束，土壤中所有黄瓜植株被拔除。
1.5 土壤总 DNA 提取
土壤 DNA 提取以 Reddy 法[26]为基础，优化洗涤
液、裂解液，并增加石英砂研磨、振荡的步骤。
248 中 国 农 业 科 学 45 卷
1.6 T-RFLP 分析土壤细菌群落结构变化
1.6.1 16S rDNA 片段 PCR 扩增 扩增引物选用细菌
的通用引物[27-28] 27F-FAM（5′-AGA GTT TGA TCC
TGG CTC AG-3′）和 1492R（5′-GGT TAC CTT GTT
ACG ACT T-3′），27F-FAM 的 5′端标记荧光物质
6-FAM（引物由上海生工生物工程技术服务有限公司
合成）。扩增片段长度约为 1 500 bp。采用 25 μL PCR
反应体系，其中包括 10×PCR buffer 2.5 μL，2 µL
MgCl2（25 mmol·L-1)，引物（20 pmol·μL-1）各 0.25 μL，
dNTP（各 2.5 mmol·L-1）2 μL，模板 5 ng，0.25 μL Taq
聚合酶，用双蒸水补足体积。PCR 反应条件[17]为 94℃
预变性 3 min，94℃变性 1 min，55℃退火 1 min，72℃
延伸 2 min，30 次循环，最后 72℃下延伸 7 min。
PCR 产物用 PCR 产物纯化试剂盒（TaKaRa）纯
化。
1.6.2 T-RFLP试验 纯化后的 PCR 产物分别用 Hha
I、Msp I、Hae Ⅲ 3 种限制性内切酶消化。将酶切产
物送上海基康生物技术公司，进行 STR 分析。
1.6.3 T-RFLP 数据分析 荧光强度超过 50 RFU 的
“峰”被作为 1 个有效峰纳入后续的数据分析[29]，进
行片段并类[30]，计算片段百分含量。利用 Microbial
Community Analysis Ⅲ（http://mica.ibest.uidaho.edu/）
网站上的 Phylogenetic Assignment Tool 分析软件，将
TRF 片段与 RDP 数据库进行比对，获得相关菌群信
息，本试验允许误差为±1.0 bp。此外运用 XLSTAT 统
计学软件对 T-RFLP 数据进行主成分分析（principal
component analysis，PCA）。
1.7 DGGE 分析土壤细菌群落变化
1.7.1 目的片段 PCR 扩增 本文 DGGE 技术分析的
是 16SrDNA V3 区域，PCR 采用上游引物 F341-GC
（CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG
GGG GCA CGG GGGGCC TAC GGG AGG CAG
CAG）和下游引物 R534（ATT ACC GCG GCT GCT
GG）[31-32]，扩增长度为 220—230 bp（包括 GC 夹板）。
PCR 反应体系 25 μL，包括 10×PCR buffer 2.5 μL，2 µL
MgCl2（25 mmol·L-1），引物（20 pmol·μL-1）各 0.25 μL，
dNTP（各 2.5 mmol·L-1）2 μL，模板 5 ng，0.25 μL Taq
聚合酶，补足 ddH2O 至 25 µL。PCR 程序模式为
touchdown-PCR：94℃预变性 5 min，94℃变性 1 min，
初始退火温度为 65℃退火 1 min（以后每个循环降
0.5℃，至 55℃），72℃延伸 1 min。之后 94℃变性 1
min，55℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，循环 10 次，
最后 72℃延伸 5 min。
1.7.2 DGGE 电泳 取 16S rDNA V3 区域 PCR 产物
30 μL，用 DGGEK-2401 型变性梯度凝胶电泳系统
（美国 CBS 公司）进行 DGGE 电泳分离。聚丙烯酰
胺凝胶浓度为 8%，变性梯度 45%—60%（100%变性
剂中含有 7 mol·L-1 的尿素和 40%的去离子甲酰胺），
电泳缓冲液为 1 ×TAE，60℃，110 V 条件下电泳 9 h。
用 Gelred 核酸染料（1×TAE 稀释 10 000 倍）染色
30 min。DGGE 凝胶图像采集在 UVP 凝胶成像仪上
进行，并通过 UVP 分析软件对 DGGE 图谱进行聚类
分析。
1.7.3 DGGE 条带回收 对选定的DGGE条带只选择
其中间部分进行切割回收。用 ddH2O 反复清洗 2—3
次。用无菌枪头将胶条捣碎，加入 30 µL 的 TE 缓冲
液，4℃浸泡 16 h，离心后弃胶。取适量 1—2 µL 上清
液作为模板按照 1.7.1 中体系和条件再次进行 PCR 扩
增，引物不带 GC 夹子。PCR 扩增产物经凝胶回收试
剂盒（天根）纯化后，与载体（pMD19-T Vector）连
接，并转入感受态大肠杆菌 DH5α。以 T 载体通用引
物 M13-47 和 RV-M 挑选阳性克隆。再以阳性克隆为
模板，用引物 F341-GC/R534 扩增 DNA，将产物与原
条带所在的样品在 DGGE 图谱上比对位置。选取位置
正确的克隆送至上海美吉生物医药科技有限公司测
序。
获得序列在 GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.
gov/BLAST/）以及 RDP（http://rdp.cme.msu.edu）数
据库中比对分析，找到亲缘关系最近的细菌。
2 结果
2.1 基于 T-RFLP 方法分析土壤细菌群落结构变化
2.1.1 黄瓜根围土壤细菌主要代表性种属分析 采
用 T-RFLP 法分析对照组土样，检测到 50—600 bp 的
峰 130 余个，其中 TRF89、TRF207、TRF213、TRF240、
TRF337 的平均相对含量最高，为 6.65%—13.08%，且
在对照组各个土壤样本中，这些 TRF 片段的相对含量
基本稳定在 5%以上，因此认为这些片段所代表的细
菌群落是本试验田土壤的优势菌群。综合 Hha I 、Msp
I、Hae Ⅲ 3 种限制性内切酶结果，以 Hha I 酶切末端
标记限制性片段（TRF）为基础分析黄瓜根围代表性
土壤细菌种属，选择相对含量在 3%以上的 TRF 作为
分析对象。土壤中细菌群落较为丰富，不仅包含了一
些常见的单胞菌属（Pseudoalteromonas）、芽孢杆菌
属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、土壤
杆菌属（Agrobacterium）等土壤细菌种属，还具有较
2 期 尹丹韩等：生防菌哈茨木霉 T4 对黄瓜根围土壤细菌群落的影响 249
多的功能菌，如根瘤菌属（Rhizobium）、亚硝化球菌
属（Nitrosococcus）、固氮弓菌属（Azoarcus）、 铁
细菌属（Crenothrix）、脱硫弧菌属（Desulfovibrio）、
中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium）、甲基杆菌属
（Methylobacter）、脱铁杆菌属（Deferribacter）等。
从分析结果中笔者发现该土壤中包含了大量的耐盐、
耐酸的细菌群落，盐单胞菌属（Halomonas）、耐盐
芽 孢 杆 菌 属 （ Halobacillus ） 、 中 度 嗜 盐 菌 属
（Pontibacillus）、酸杆菌属（Acidobacterium）、芽
孢 乳 杆 菌 属 （ Sporolactobacillus ） 、 乳 杆 菌 属
（Lactobacillus）、醋杆菌属（Acetobacter）、中度产
丙 酸 菌 （ Propionigenium modestum ） 、 乳 酸 菌
（Tetragenococcus halophilus）等是分析结果中比较有
代表性的菌群，因此本试验使用的土壤中可能含较多
的碳酸、腐殖酸、磷酸、硅酸以及其它有机酸等弱酸
及其盐类。代表性的细菌菌群中也出现了一些可能的
病原菌，例如伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）、罗
尔斯顿菌属（Ralstonia）、黄单胞菌属（Xanthomonas）、
假单胞菌属、土壤杆菌属、不动杆菌属（Acinetobacter）
等（表 1）。

表 1 代表性黄瓜根围土壤细菌优势种属
Table 1 Advantage representative bacteria in cucumber rhizosphere
TRF 片段
TRF fragments (bp)
平均相对丰富度
Average relative abundance (%)
代表细菌
Representative bacterium
89 10.57 Clostridia; Flavobacterium; Chlorobium; Truepera; uncultured bacterium
207 13.08 Burkholderia; Beta-proteobacterium; Gamm-proteobacterium; Pseudomonas; Pseudoalteromonas;
Acinetobacter; Cupriavidus; Variovorax; Nitrosospira; Alicyclobacillus; Ralstonia; Methylophilus;
Rhodospirillum; Alteromonas; Chromohalobacter; Propionigenium modestum; Glaciecola;
Marinobacter; Azoarcus; Thermotoga; Dechloromonas; Dechloromonas; uncultured bacterium
213 11.83 Actinomyces; Neisseria; Fusobacterium; Rhodococcus; Aeromonas; Pseudoalteromonas; Halomonas;
Chromohalobacter; Morganella; Proteus; Alcanivorax; Xanthomonas; Pseudomonas; Proteobacterium;
Stenotrophomonas; Chromohalobacter; Tetragenococcus halophilus; uncultured bacterium
240 6.65 Planomicrobium; Staphylococcus; Clostridium; Cyanobacterium; Synechococcus; Rhizobium;
Bacillus; Agrobacterium; uncultured bacterium
337 11.63 Streptomyces; Synechococcus; Mesorhizobium; Cyanobacterium; uncultured bacterium

2.1.2 T-RFLP 数据的主成分分析 在 Hha I 酶切数
据的基础上进行主成分分析以评价引入木霉 T4 对黄
瓜根围土壤细菌群落结构的影响（图 1）。PC1、PC2
代表数据总变量的 28.89%和 21.05%。在第 7 d 的样本
中，木霉处理组与对照组间细菌群落结构无明显差异。
从第 14 d 开始，木霉的引入对土壤细菌群落结构产生
严重的扰动，不同处理样本间细菌群落结构差异显著，
随后木霉对土壤细菌群落的影响一直持续，在 56 d 样
本中，依然能检测到不同处理组之间群落的明显差异。
为确定木霉的大量释放是否会对土壤细菌群落产生长
期的干扰，笔者将取样时间延长至 70 d（黄瓜收获期
结束 2 周后）。在无植物影响的情况下生防菌处理组
中细菌群落结构基本与对照一致，木霉对细菌群落结
构已无明显影响。收获后土壤中细菌群落结构与黄瓜
生育期内其它时间段的细菌群落结构有着明显差异。
对对照组不同时间样品进行分析，发现不同时期细菌
群落结构存在明显变化。试验前期（7—14 d）的细菌
群落结构较为相似，后期（21—56 d）4 组样本的细菌

K：对照组；T：T4 处理组；7、14、21、28、42、56、70：引入生防菌
至取样的天数。图 2 同
K: Non-inoculated samples; T: T4-inoculated samples; 7, 14, 21, 28, 42, 56
and 70: The days post-inoculation. The same as Fig.2

图 1 Hha I 酶切 T-RFLP 数据的主成分分析
Fig. 1 Principal component analysis of T-RFLP data sets
derived from Hha I digestion
250 中 国 农 业 科 学 45 卷
群落结构更为接近。前期样本群落结构与后期样本分
别分布于 2 个不同的区间，差异显著。
2.2 基于 DGGE 方法分析土壤细菌群落变化
2.2.1 DGGE图谱分析 图 2为木霉 T4 处理组与对照
组总共 14 个土壤样本的 DGGE 图谱。图谱中条带较
为丰富，有 20 条左右不同位置的条带。不同处理和不
同取样时间的带谱在条带的位置、数量及亮度上均存
在显著的差异。对比不同处理组的带谱，发现有 8 个
条带在生防菌引入后发生了明显的变化，标记为条带
1—8 号。这些条带变化集中在 7—56 d 的样本中，在
第 70 d 样本中检测不到这些条带的变化，也没有发现
明显的新条带变化。条带 1，3，5 是对照组中的优势
条带，在带谱中条带亮度较好，但在 T4 处理组中这
些条带的亮度都严重减弱。从第 14 天样本开始，已无
法在相应位置检测到条带 3。条带 2，8 是对照组中的
次要条带，生防菌引入 7—14 d 后这 2 条条带在 T4 处
理组中消失。第 7 d 开始，生防菌 T4 引入很大程度上
增加了条带 4，6，7 的条带亮度，但随着时间推移这
种增加作用逐渐减弱，28 d 后不同处理组间这 3 条条
带在亮度上基本无显著差异。
UVP 分析软件对 DGGE 图谱条带对比，进行聚类
分析，获得结果如图 3。14 个样品划分为两大聚类主
分支。分别为 T28、K70、T70、T14、T21 和 T56、
T42、K42、K56、K28、T7、K21、K14、K7。第 7 d
样本中不同处理组间细菌群落差异较小，T7 与 K7 相
似度为 82.2%，两者聚于同一小分支上。14 d 时不同
处理组的样本差异显著，T14 与 K14 处于不同主分支
上，相似度为 64.6%。随后这种差异依旧显著，42 d
后有所减弱，相似度为 67.7%。第 70 d 时不同处理样
品间细菌群落相似度极高，基本趋于一致，K70 与 T70



图 2 黄瓜根围细菌群落变化的 DGGE 图谱
Fig. 2 The alterations of the bacterial community in cucumber
rhizosphere soils assessed by DGGE
2 期 尹丹韩等：生防菌哈茨木霉 T4 对黄瓜根围土壤细菌群落的影响 251
的相似度为 100%。
2.2.2 条带序列分析 对图2中8条变化条带进行回
收、克隆、测序，结果见表 2。8 条变化条带序列与
GenBank 数据库中已知的细菌序列同源性较高（≥
98%）。其中条带 1 与条带 5 均包含了 2 种不同的序
列信息，条带 1 中序列分别与蓝细菌和 β-变形细菌同
源性最高，条带 5 中一条序列与沙雷氏菌同源性最高，
另一条序列与之最相似的 16S rDNA 序列来自于土壤
中不可培养的细菌克隆，无法确定其所属类群。其它
的 6 条序列分别归属于以下细菌类群：葡萄球菌、伯
克霍尔德菌、芽孢杆菌、土壤杆菌、芽单胞菌、酸杆
菌等。

表 2 DGGE 条带测序结果
Table 2 Phylogenetic affiliation of sequences retrieved from DGGE bands
条带编号
Band no.
最相似菌株
Closest relative
相似度
Percentage similarity (%)
亲缘关系
Phylogenetic affiliation
GenBank 登录号
GenBank accession
1 Uncultured Cyanobacterium clone Gap-3-60
Uncultured Beta-proteobacterium clone Amr2_C12
100
98
Cyanobacterium
Beta-proteobacterium
EU639772
HQ010201
2 Staphylococcus sp. HJB003 99 Staphylococcus HQ331102
3 Uncultured Burkholderia sp. 100 Burkholderia FN394970
4 Bacillus sp. DYJL-H 100 Bacillus HQ317199
5 Uncultured Bacterium clone FCE40
Serratia sp. BZ49
100
100
Bacterium
Serratia
HQ438926
HQ588851
6 Agrobacterium sp. shui5-22 100 Agrobacterium HQ436450
7 Uncultured Gemmatimonadetes Bacterium 100 Gemmatimonadetes EF662416
8 Uncultured Acidobacterium sp. clone JL123_97 98 Acidobacterium HQ730663

3 讨论
3.1 试验田土壤细菌群落多样性
本研究田间土壤中细菌多样性较为丰富，有利于
保持土壤良好的肥力，为植物生长创造一个良好的土
壤环境。该土壤中含有丰富的耐盐、耐酸细菌菌群以
及功能菌群。耐盐、耐酸细菌菌群能在高酸、高盐条
件下正常生长，对维持细菌群落多样性以及土壤体系
的稳定有着重要意义。另外，根瘤菌属、亚硝化球菌
属等多种功能菌的存在，有利于土壤中各项新陈代谢
过程顺利进行。
研究发现，TRF207、TRF213、TRF240、TRF337
为田间黄瓜土壤中的优势菌群。Hjort 等 [30]利用
T-RFLP 分析 Plasmodiophora brassicae 对土壤细菌群
落影响，检测到土壤对照组样品中 TRF207、TRF212、
TRF239、TRF338 相对含量较为丰富；Artursson 等[33]
研究在不同土壤条件下引入菌根真菌 Glomus mosseae
后土壤细菌宏基因组的变化，运用 T-RFLP 技术结果
表明，土壤样本的酶切产物中 TRF212、TRF241 为优
势片段。因此这些片段所代表的细菌群落可能为土壤
中普遍存在的优势菌群。
3.2 哈茨木霉 T4 对土壤细菌群落的影响
T-RFLP 分析发现，木霉施用后 14 d 的细菌群落
发生较大变化，21 d 后变化减弱趋于平稳并持续到收
获期，收获后 2 周则恢复到正常水平。DGGE 方法分
析也表明，木霉施用后 14 d 时不同处理组的样本差异
显著，相似度为 64.6%。这种差异一直持续到 42 d 后
有所减弱，相似度为 67.7%。收获后 2 周完全无影响，
相似度为 100%。虽然分析方法的灵敏度和数据分析
方式有所不同，DGGE 图谱聚类分析与 T-RFLP 主成
分分析结果是一致的，木霉 T4 对根围土壤细菌群落
产生短期显著影响后，可持续一定的时间，随后逐渐
减弱。引入生防菌 1 周内，是木霉开始在土壤和植物
上定殖时期，木霉与土壤尚未建立密切的联系。经过
2 周的适应，木霉发挥作用，对土壤细菌群落产生较
大影响，随着木霉与土壤微生物的互作，其数量可能
会有所减少，因此，对土壤细菌作用减弱，但可以一
直持续到收获期。Cordier 等[34] 运用传统培养技术以
及 T-RFLP 手段分析 Trichoderma atroviride I-1237 对
土壤可培养性微生物以及整个微生物群落的变化时，
选择 Epoisses 与 Marlins 两地土壤进行试验。在 2 种
不同土壤中，I-1237 引入对土壤细菌群落仅在短时间
内维持较弱的影响，但不同土壤类型样本引起细菌群
落的差异显然要更显著。将对病原菌 Armillaria mellea
252 中 国 农 业 科 学 45 卷
有较强的抑制能力的 Trichoderma atroviride SC1 施用
于意大利北部的葡萄园土壤中，自动核糖体间隔分析
（ARISA）结果表明生防菌 SC1 的引入对土壤微生物
群落产生的影响发生在施用生防菌后的 2 周内[35]。后
期的土壤微生物群落演变主要归因于环境因素而非生
防菌的应用。可见，不同的木霉对土壤微生物的影响
具有一定的差异。
Grosch 等[36]在利用 Trichoderma 抑制植物病原菌
Rhizoctonia solani 的研究中发现，土壤样本间微生物
群落的差异主要是归因于植物病原菌的出现以及取样
时间的差异，而不是生防菌木霉的引入。本研究中笔
者也观察到生防菌处理与对照组之间存在相似的细菌
群落变化，这类群落变化与生防菌的引入无关，主要
是由气候、植物生长阶段、生态微环境条件等[37-41]诸
多因素引起的。这些因素对细菌群落的影响远远大于
生防菌的引入。
在引入生防菌后，木霉在短时期内对黄瓜根围土
壤细菌群落中多个菌属产生较大扰动，表现为对蓝细
菌、β-变形细菌、葡萄球菌、伯克霍尔德菌、沙雷氏
菌、酸杆菌和一些不可培养细菌的有效抑制作用，以
及对芽孢杆菌、土壤杆菌、芽单胞菌的显著促进作用。
这可能是因为田间土壤为酸性，真菌对酸的耐受力更
强，在该土壤中土壤真菌比细菌更为活跃。在酸性土
壤中引入大量木霉会对土壤细菌群落的稳定性产生影
响，同时与木霉属的其它菌株一样 T4 能产生大量具
有抗细菌活性的次级代谢产物，这些物质对细菌群落
产生选择压力，最后使细菌群落组成发生变化，另外，
木霉 T4 在土壤中的强竞争能力，也是其影响土壤细
菌群落变化的一个重要因素。
分析变化菌群信息发现在受生防菌影响的菌群中
有几类菌与土壤理化性质以及土壤健康有着密切的联
系，如蓝细菌、芽孢杆菌、土壤杆菌、伯克霍尔德菌
等。蓝细菌是一类光能自养型原核生物，许多蓝细菌
都具有固氮功能，对蓝细菌的抑制作用有可能会导致
短期内土壤氮循环受影响。芽孢杆菌属是一个丰富的
生防菌库，该属中的许多菌株都具有良好的生防潜力，
对芽孢杆菌的促进则可能有利于降低植物病害的发生
率、提高土壤健康状况。伯克霍尔德菌、土壤杆菌的
情况比较复杂，这两类菌的不同菌株对土壤影响差异
极大。伯克霍尔德菌中许多菌对动物、人类、植物有
致病性，同时也存在着生防潜力的菌群，如
Burkholderia cepacia 具有生物降解、调节植物生长、
防治植物病害的作用[42]。土壤杆菌除放射杆菌外，
其它都可通过侵入植物组织，导致植物细胞的自
发增生而转化为肿瘤细胞，是一类致病菌，但土
壤放射杆菌则有较强的生防活性，其中最有名的
生防菌为土壤放射杆菌（Agrobacterium radiobact）
K84[43]。但由于分类信息的缺乏，还无法将变化菌鉴
定到种的水平，因此，确定生防菌对这些菌的影响会
造成土壤理化性质以及土壤健康怎样的变化，还需要
进一步研究。
3.3 T-RFLP方法与DGGE方法综合研究土壤微生物动
态变化
利用 T-RFLP 与 DGGE 方法研究土壤细菌群落动
态变化，均得到较为丰富的细菌多样性信息。虽然分
析方法和数据处理方式有所不同，但对 DGGE 图谱做
聚类分析，获得的结果与 T-RFLP 的主成分分析结果
一致，通过对 DGGE 图谱中条带回收测序发现的变化
菌群，均能在 TRF 代表性种属中找到，因此认为以
DGGE 技术和 T-RFLP 方法结合分析根围细菌群落动
态变化结果可靠性高，较为全面。
虽然 T-RFLP 技术和 DGGE 方法是 2 种较为成熟
的微生物多样性分析手段，但到目前为止尚未有人将
这 2 种方法结合应用到生防菌的安全性评估中。本研
究将 DGGE 和 T-RFLP 序列分析技术结合，不仅全面
描述土壤细菌群落结构变化，还初步定性描述变化细
菌的种类信息，为下一步变化菌群的定量分析及变化
菌群与土壤状态之间的联系研究提供理论基础和研究
方向。
4 结论
将 DGGE 和 T-RFLP 序列分析技术结合能进一步
描述土壤细菌群落结构变化。生防菌哈茨木霉 T4 的
引入对土壤细菌群落产生短期显著影响，并可持续一
段的时间，随后逐渐减弱，不会长期对土壤细菌群落
稳定构成威胁。在黄瓜生育期内，木霉的引入对黄瓜
根围土壤多个细菌菌属产生较大扰动，受影响的细菌
种类包括蓝细菌，β-变形细菌，葡萄球菌，伯克霍尔
德菌，芽孢杆菌，沙雷氏菌，根瘤菌，芽单胞菌，酸
杆菌以及一些不可培养菌。

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（责任编辑 岳 梅）