全 文 ：收稿日期：2012-02-24
基金项目：广西科技攻关项目（桂科攻0992021-3）；广西教育厅资助项目（200809MS152）。
作者简介：*为通讯作者，冯斗（1963-），博士，教授，主要从事植物资源开发利用、作物遗传育种及良种推广示范研究工作，E- mail：
fengdou@gxu.edu.cn。韩佳宇（1984-），研究方向为生物技术育种，E- mail：648614022@qq.com
石栗树腋芽外植体消毒方法的筛选
韩佳宇，欧克纬，禤维言，宋炫旻，冯 斗*
（广西大学农学院，南宁 530005）
摘要：【目的】筛选石栗树腋芽外植体的消毒方法，解决石栗组织培养中大田外植体污染问题，提高石栗组织培养
的成活率。【方法】设计3因子3水平的正交试验，3因子分别是自来水冲洗、0.1% HgCl2和10% NaClO3溶液；3水平是自来
水冲洗时间分别为60、120、180 min，0.1% HgCl2溶液浸泡时间分别为0、8、16 min，10% NaClO3溶液浸泡时间分别为0、
12、24 min。观察9种处理后石栗枝条表面消毒效果。【结果】自来水冲洗120 min，0.1% HgCl2溶液浸泡16 min，10%
NaClO3溶液浸泡24 min，可使污染率降到最低，为16.67%，而诱导愈伤组织成功率达到80.00%。【结论】石栗外植体灭菌
的最佳组合能在外植体的承受范围之内使污染率降低到16.67%；在低温干燥和树龄小的植株上取材，污染率较低。
关键词：石栗；腋芽；灭菌方法；组织培养
中图分类号：S722.3 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2012）08-1169-04
0 引言
【研究意义】石栗［Aleurites moluccana（L.）Willd］
属大戟科（Euphorbiaceae）植物，根系发达，耐贫瘠，适
于石山区山地种植，是治理石漠化的优良树种和具有
发展潜力的生物柴油原料树种（张若蕙等，1993）。石
栗是异花授粉植物，种子发芽率很低，种苗生产供应
紧张是限制优良石栗大面积种植的主要因素之一（蔡
金标等，1997）。由于利用种子繁殖实生苗的变异性很
大，不能保证母树的优良性状，因此通过组织培养的
方式获得石栗工厂化试管苗是解决其供苗紧张的有
效途径。石栗组织培养中会出现大田外植体污染的现
象，因此，通过筛选石栗树腋芽外植体的消毒方法以
提高石栗组织培养的成活率具有重要意义。【前人研
究进展】刘昌盛等（2008）对石栗仁油份的组成和性质
进行研究，结果表明，石栗仁的粗脂肪含量高达
66.22%，不饱和脂肪酸含量高达90.1%，亚油酸含量
最高为34.6%，多不饱和脂肪酸为57.8%，粗蛋白含量
为21.66%，其中，赖氨酸为2.15 mg/100 mg，蛋氨酸为
DOI：10.3969/j：issn.2095-1191.2012.08.1169
南方农业学报 JOURNAL OF SOUTHERN AGRICULTURE 2012，43（8）：1169-1172
ISSN 2095-1191；CODEN NNXAAB http：//www.nfnyxb.com
Screening of sterilization methods for explants of Aleurites
moluccana axillary bud
HAN Jia- yu，OUKe- wei，XUANWei- yan，SONGXuan- min，FENGDou*
（Agricultural College，Guangxi University，Nanning 530005，Chinaa）
Abstract：【Objective】Appropriate sterilization methods for explants of Aleurites moluccana axillary bud was selected
in order to solve the pollution problem in tissue culture of Aleurites moluccna and improve survival rate of tissue-cultured
Aleurites moluccana. 【Method】Three factors （tap water flushing， 0.1% HgCl2 soaking， and 10% NaClO3 soaking） and three
levels of （60，120， and 180 min for tap water flushing； 0， 8，16 min for 0.1% HgCl2 soaking； 0，12， 24 min for 10%
NaClO3 soaking） orthogonal test was designed to observe the sterilization effect on appearance of Aleurites moluccana
branch processed by nine treatments. 【Result】The results showed that the best combination for explants sterilization was
as follows: flushed by tap water for 120 min， soaked in 0.1%HgCl2 for 16 min， and soaked in 10%NaClO3 for 24 min.
【Conclusion】The above-mentioned best combination could bring down the contamination rate to 16.67% with no serious
harm to explants. Explants obtained from treelet in low-temperature and dry season had little pollution to the environment.
Key words： Aleurites moluccana；axillary bud；sterilization methods；tissue culture
南 方 农 业 学 报
表 1 石栗腋芽外植体灭菌正交试验设计
Tab.1 Orthogonal experiment of sterilization of axillary buds in
Aleurites moluccana
A：自来水冲洗
Tap water rinse
60
120
180
B：0.1%升汞
0.1% HgCl2
时间（min）Time
0
8
16
C：10%次氯酸钠
10% NaClO3
0
12
24
因子 Factor
3.95 mg/100 mg。胡语婕（2009）对石栗的组织培养进
行了研究，诱导出无菌实生苗的丛生芽。冯斗等
（2010）研究不同药剂处理对石栗种子发芽率及苗木
质量的影响，结果发现，以200 mg/L赤霉素溶液浸泡24
h的种子，其发芽率最高，可达到54%；其次为2000
mg/L的硝酸钾溶液浸泡24 h的种子，发芽率达到32%，
与对照相比，均达显著差异。郭伦发等（2010）研究不
同处理方法对石栗种子发芽率及发芽势的影响，结果
表明，赤霉酸、细胞分裂素和破壳处理对石栗种子发
芽具有促进作用，其中赤霉酸最佳处理时间为56 h，
处理浓度为612 mg/L，最高发芽率可达78.34%。【本研
究切入点】国内外有关石栗树的研究报道大多集中
于分类、细胞学、成分含量等方面，对腋芽外植体诱
导的研究较少。外殖体虽已在无菌实生苗的基础上
诱导出了丛生芽，但实生苗不能保证母树的优良性
状，没有从根本上解决石栗组织培养的目的，要对大
田材料进行组织培养，首先要避免外植体污染。【拟
解决的关键问题】通过筛选，找到适合石栗外植体消
毒的有效方法，以期解决石栗组织培养中大田外植
体污染问题，提高石栗组织培养的成活率。
1 材料与方法
1. 1 供试材料
石栗枝条取自广西大学农学院石栗研究课题组
种质资源圃。
1. 2 试验方法
试验于2010年6月~2011年1月在广西大学农学院
组培中心实验室进行。于晴天下午17：00~18:00选取健
壮、无病虫害的植株枝条。幼嫩茎尖先用75%酒精擦
洗表面，剪下带有3~4个未萌动腋芽的茎尖，放入1%
抗坏血酸溶液的烧杯中。用软毛刷蘸上洗洁精小心刷
洗石栗幼嫩腋芽上的绒毛，并剪切成长约1 cm的腋芽
茎段用于试验。
采用L9（34）正交设计方法对石栗腋芽外植体进行
表面灭菌（表1）。将灭菌后的外植体用灭菌滤纸吸干
表面水分后接种到空白MS培养基上，每瓶接种3个腋
芽，每处理3次重复，每重复接30瓶。14 d后观察污染
情况，统计污染率。最后将未污染的外植体转入诱导
愈伤组织培养基（1/2MS培养基，0.01 mg/L TDZ，2
mg/L NAA）中进行培养，统计其诱导愈伤成功率（陈
庆富，2011）。
1. 3 不同树龄植株的灭菌效果
观察不同树龄对灭菌处理的反应，分别取1、2、3 a
的外植体腋芽，用自来水冲洗120 min，0.1%升汞处理
16 min，10%次氯酸钠处理24 min，进行灭菌处理后接
种到MS培养基上，每瓶接种3个腋芽，每处理3次重复，
每次接30瓶。温度恒定在28℃，12 h光暗交替，14 d后
观察统计污染情况。
1. 4 不同时期取材的灭菌效果
分别在2010年6月下旬、9月下旬和2011年1月中
旬，从广西大学农学院石栗研究课题组种质资源圃取
1 a的腋芽，用自来水冲洗120 min，0.1% HgCl2处理16
min，10% NaClO3处理24 min进行灭菌处理后接种到
MS培养基上，每瓶接种3个腋芽，每处理3次重复，每次
接30瓶。温度恒定在28℃，12 h光暗交替，14 d后观察
统计污染情况。
1. 5 统计分析
有关外体污染率和诱导的愈伤组织成功率的计
算公式分别为：
污染率（%）=（污染的外植体数/接种外植体总数）
×100
愈伤诱导成功率（%）=（诱导成功的愈伤外植体
数/未污染的外植体数）×
100
运用SPSS 19.0软件进行正交设计和数据统计
分析。
2 结果与分析
2. 1 石栗外植体灭菌方法的方差分析
单独使用一种消毒剂灭菌，外植体污染率较高，
当用自来水冲洗的时间越长，外植体污染率越低。
0.1% HgCl2溶液和10% NaClO3溶液配合灭菌效果比较
好，使污染率达到较低水平。从表2可以得出，污染率
最小的组合是Ax2Bx3Cx3，即自来水冲洗120 min、0.1%
HgCl2溶液浸泡消毒16 min，10% NaClO3溶液浸泡消毒
24 min，可使污染率降低到16.67%。
对石栗外植体腋芽消毒的结果进行方差分析，
确定各种因素的差异显著性，从表3可知，A因子和B
因子的P小于0.05，说明自来水冲洗和0.1% HgCl2浸
泡处理的方式对污染率的影响达到了显著水平；
而C因子P大于0.05，说明C因子对污染率的影响不
显著。
水平 Level
x1
x2
x3
1170· ·
韩佳宇等：石栗树腋芽外植体消毒方法的筛选
表 5 愈伤组织的成功率极差分析表
Tab.5 Range analysis on success ratio of the calli
处理 因子 Factor
Treatment A B C
x1 66.78 39.99 35.28
x2 155.28 94.29 104.94
x3 28.56 116.37 110.43
x1 22.26 13.33 11.76
x2 51.76 31.43 34.98
x3 9.52 38.79 36.81
极差 Range 42.24 25.46 25.05
表 3 污染率的方差分析结果
Tab.3 Variance analysis result of pollution ratio
表 2 石栗腋芽灭菌方法的正交试验结果
Tab.2 Orthogonal experiments result of sterilization of axillary
buds in Aleurites moluccana
处理 因子 Factor 污染率（%） 成功率（%）
Treatment A B C Pollution ratio Success ratio
H1 60 0 0 100.00 0
H2 60 8 24 23.33 30.43
H3 60 16 12 26.67 36.36
H4 120 0 12 66.67 40.00
H5 120 8 0 43.33 35.29
H6 120 16 24 16.67 80.00
H7 180 0 24 100.00 0
H8 180 8 12 76.67 18.57
H9 180 16 0 90.00 0
2. 1. 1 外植体消毒方法的极差分析 通过极差分析
结果表明，自来水冲洗（A因子）的极差达46.67，为三
者中最大，0.1% HgCl2浸泡消毒（B因子）的极差达
44.44，10% NaClO3溶液浸泡消毒（C因子）的极差为
31.11，为三者中最小（表4）。采用B因子在对石栗腋芽
外植体消毒中对污染率的影响不大；对污染率影响最
大的是A因子；C因子在石栗外植体灭菌中对污染率的
影响最小。
2. 1. 2 诱导愈伤外植体成功率极差分析 从诱导愈
伤成功率极差分析中发现，极差最大的是A因子42.24，
说明对诱导愈伤成功率影响最大的是A因子；B因子极
差是25.46，C因子的极差是25.05，B和C因子的极差数
值接近，说明两者对石栗腋芽外植体成功率的影响不
大（表5）。诱导愈伤组织成功率最高的处理组合为是
Ax2、Bx3和Cx3，即自来水冲洗120 min+0.1% HgCl2溶液
浸泡16 min+10% NaClO3溶液浸泡24 min的处理组合
最佳，可使污染率降到最低（16.67%），而诱导愈伤成
功率达到80%，与污染率极差分析结果相似。Ax2、Bx3
和Cx3的处理组合的浓度和浸泡时间在石栗腋芽外植
体的承受能力范围之内，不会对石栗外植体腋芽造成
严重损伤。
2. 2 不同树龄污染率的差异
不同树龄的污染率存在一定差异，1 a石栗外植体
腋芽的污染率为16.67%，2 a石栗外植体腋芽的污染
率为33.33%，3 a石栗外植体腋芽的污染率为40.00%，
这可能与不同树龄外植体表皮结构和内生菌携带量
有关。
2. 3 不同取材时期污染率的差异
研究结果表明，在6月下旬取材的石栗外植体腋
芽污染率为50.00%，9月下旬取材的石栗外植体腋芽
污染率为36.67%，而2011年1月中旬取材的石栗外植
体腋芽污染率为16.67%。可能是因石栗腋芽表面和内
生菌的量会随季节的不同而不同。不同季节取材时，
外植体污染率也存在一定差异，低温干燥季节的污染
率较低。
3 讨论
本研究结果发现，自来水冲洗和0.1% HgCl2浸泡
处理对石栗外植体腋芽污染率的影响达到了显著水
平，单独使用一种消毒剂灭菌，外植体污染率比较高，
自来水冲洗的时间越长，污染率越低。说明用自来水
较长时间冲洗石栗腋芽外植体，是获得有效消毒的重
要环节，这与姚娜和赖志强（2010）对象草腋芽外植体
消毒的研究结果一致。0.1% HgCl2溶液和10% NaClO3
溶液配合灭菌效果比较好。目前用于外植体的灭菌剂
有很多种，使用的浓度水平和时间由外植体本身的性
质决定。石栗腋芽细嫩，且茎段表面有大量茸毛，仅用
软毛刷简单刷洗，腋芽处还有很多绒毛没有清理干
净。在植物组织培养中常以HgCl2溶液和NaClO3溶液等
多种灭菌剂的混合使用以降低污染率和减少对外植
体的损伤。通过多种灭菌剂的有效组合可以成功降低
外植体污染，但由于灭菌剂在消灭各种菌的时候也会
对植物的表皮及各种组织造成损伤，导致愈伤组织不
表 4 污染率的极差分析表
Tab.4 Range analysis of pollution ratio
水平 Level 因子 Factor
A B C
x1 150.00 266.67 233.34
x2 126.67 143.34 170.01
x3 266.67 133.35 140.01
x1 50.00 88.89 77.78
x2 42.22 47.78 56.67
x3 88.89 44.45 46.67
极差 Range 46.67 44.44 31.11
x1、x2、x3分别为x1、x2、x3的平均值
x1，x2 and x3 were average value of x1，x2，x3
因子 离差平方和 自由度 均方 F值 P值
Factor SS DF MS F- value P- value
A 3750.686 2 1875.343 41.030 0.024
B 3676.605 2 1838.302 40.220 0.024
C 1513.390 2 756.695 16.556 0.057
误差 Error 91.412 2 45.706
总计 Total 9032.093 8
1171· ·
南 方 农 业 学 报
能成功诱导甚至整个外植体死亡。此外，汞离子会抑
制生长素对细胞壁的影响，而NaClO3会影响植物对赤
霉素的反应，甚至还有可能导致体细胞胚胎的发生
（潘瑞炽，2001），因此，要根据植物的特性选择灭菌
剂，严格控制灭菌剂浓度及灭菌时间。本研究结果发
现，石栗外植体灭菌的最佳组合为：自来水冲洗120
min+0.1% HgCl2溶液浸泡16 min+10% NaClO3溶液浸
泡24 min。不同树龄的污染率存在一定差异，可能与
其外植体表皮结构和内生菌携带量有关。不同取材时
期的外植体污染率有所差异，可能是因石栗腋芽表面
和内生菌的量会随季节的不同而不同，低温干燥的季
节污染率较低。在低温干燥和树龄小的植株上取材，
污染率较低。
4 结论
本研究结果表明，自来水冲洗石栗外植体120 min+
0.1% HgCl2溶液浸泡16 min+10% NaClO3溶液浸泡消
毒24 min，可使污染率降到最低，为16.67%，而诱导愈
伤成功率达到80.00%，此时HgCl2和NaClO3溶液所选择
的浓度和使用的灭菌时间均在石栗腋芽承受范围之
内。在低温干燥和树龄小的植株上取材，污染率较低。
参考文献：
蔡金标，丁建祖，陈必勇. 1997. 中国油桐品种、类型的分类
［J］. 经济林研究，15（4）：47-50.
Cai J B，Ding J Z，Chen B Y. 1997. Classification of Chinese
tung oil tree varieties and species［J］. Economic Forest Re－
search，15（4）：47-50.
陈庆富. 2011. 生物统计学［M］. 北京：高等教育出版社：36-43.
Chen Q F. 2011. Biostatistics［M］. Beijing：Higher Education
Press，36-43.
冯斗，胡语婕，车夏，禤维言. 2010. 不同药剂处理对石栗种子
发芽率及苗木质量的影响［J］. 中国农学通报，26（14）：
149-153.
Feng D，Hu Y J，Che X，Xuan W Y. 2010. Effect of different
pharmacy treatments on seed germination and seedling
quality of Aleurites moluccana［J］. Chinese Agricultural Sci－
ence Bulletin，26（14）：149-153.
郭伦发，何金祥，王新桂，周浩. 2010. 不同处理方法对石栗种
子发芽率及发芽势的影响［J］. 广东农业科学，（4）：34-
38.
Guo L F，He J X，Wang X G，Zhou H. 2010. Effects of diffe-
rent treatments on germination percentage and germination
energy of Aleurites moluccana seeds［J］. Guangdong Agri－
cultural Sciences，（4）：34-38.
胡语婕. 2009. 生物柴油树种石栗繁殖技术研究［D］. 南宁：广
西大学：33-37.
Hu Y J. 2009. Studies on propagation of biodiesel species
Aleurites moluccana［D］. Nanning：Guangxi University：33-
37.
刘昌盛，黄凤洪，李重屹，王明霞，南占东，韩伟，廖李. 2008.
木本油料石栗的初步研究［J］. 中国油料作物学报，30
（1）：106-107.
Liu C S，Huang F H，Li C Y，Wang M X，Nan Z D，Han W，
Liao L. 2008. Primary study on oil wood（Aleurites moluc－
cana）［J］. Chinese Journal of Oil Crop Sciences，30（1）：
106-107.
潘瑞炽. 2001.植物组织培养［M］.广州：广东高等教育出版社：
40-44.
Pan R C. 2001. Plant Tissue Culture［M］. Guangzhou：Guang－
dong Higher Education Press：40-44.
姚娜，赖志强. 2010. 象草腋芽外植体消毒方法的筛选［J］. 基
因组学与应用生物学，29（5）：943-946.
Yao N，Lai Z Q. 2010. Screening of explant disinfection method
for Pennisetum purpureum axillary bud［J］. Genomics and
Applied Biology，29（5）：943-946.
张若蕙，刘洪谔，汪祖谭. 1993. 中国主要树木幼苗形态［M］.
北京：科学出版社：636-637.
Zhang R H，Liu H W，Wang Z T. 1993. Seedling Morphology of
Major Chinese Trees［M］. Beijing：Science Press：636-637.
（责任编辑 王冠玉）
1172· ·