全 文 :臭牡丹根提取物的抑菌效果研究
林 娜 ,尹礼国 ,陈超众 ,魏琴 ,李华兰 (宜宾学院生命科学与食品工程学院 ,四川宜宾 644000)
摘要 [目的 ]研究臭牡丹根不同极性溶剂提取物对常见植物病原微生物的抑菌效果。 [方法]采用菌饼法研究臭牡丹根的抑菌能力。
[结果]臭牡丹根的 4种提取物对小麦纹枯病菌 、小麦赤霉病菌、水稻纹枯病菌 、玉米大斑病菌均具有不同程度的抑菌作用 ,其中 ,蒸馏水
提取物对小麦纹枯病菌和小麦赤霉病菌的抑菌效果最好 ,乙醚提取液对小麦赤霉病菌的抑菌效果最好 ,其最小抑菌浓度都 MIC都为 10
mg/ml。臭牡丹根提取物在 pH值 5~ 8的范围内具有不同程度的抑菌作用。 [结论]臭牡丹根对 4种病原微生物具有较好的抑制效果 ,
其抑菌活性受pH值影响较大。
关键词 臭牡丹根;提取物;抑菌效果
中图分类号 S567.1+9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2009)32-15884-03
StudyontheAntimicrobialEfectoftheExtractsofClerodendronbungeiRoots
LINNaetal (ColegeofLifeScienceandFoodEngineering, YibinUniversity, Yibin, Sichuan644000)
Abstract [ Objective] TheaimwastoresearchtheantimicrobialefectoftheextractsofClerodendronbungeirootswithdiferentsolventson
thecommonplantmicrobes.[ Method] ThebacteriacakemethodwasusedtostudytheantimicrobialcapabilityofClerodendronbungeiroots.
[ Result] Theextractshaveanti-bacterialactiononRhixoctoniacerealisV.Hoeven, Fusariumgraminearum, RhizoctoniasolaniandSetospha-
eriaturcica, especialytheextractfromdistiledwaterhasthestrongestanti-bacterialactiononRhixoctoniacerealisV.HoevenandFusarium
graminearum, theextractfrometherhasthestrongestanti-bacterialactiononFusariumgraminearum, theMICwereal10 mg/ml.Theex-
tractshaddifferentantimicrobialeffectwhenpHvaluewasin5-8.[ Conclusion] TheextractsofClerodendronbungeirootscouldinhibitthe
4 pathogenicmicroorganism, andtheantibacterialactivitywasafectedbypHvaluegreatly.
Keywords Clerodendronbungeiroots;Extracts;Antimicrobialefect
基金项目 宜宾学院青年基金(QJ05-22)及宜宾学院博士启动基金
(2005B02)资助。
作者简介 林娜(1979-), 女 ,四川内江人 ,硕士 ,讲师 , 从事植物学方
面的研究。
收稿日期 2009-07-13
臭牡丹(ClerodendronbungeiSteud.)属马鞭草科落叶小
灌木 ,别名大红袍 、臭八宝等 ,广泛分布于华北 、陕西至长江
以南各省区。研究表明 ,臭牡丹富含植物多酚类 、生物碱 、有
机酸 、氨基酸 、糖 、生物类黄酮及挥发油等物质 [ 1] 。臭牡丹的
根 、茎 、叶均可入药 ,性温 ,味苦 ,具有活血化瘀 、消肿解毒 、清
热利湿 、止痛等功效 。现代医学研究表明 ,其还具有抗肿瘤 、
增强免疫等药用价值 [ 1-5] 。有机合成农药在防止作物病害 、
确保植物稳产的同时 ,其自身的毒性对人类造成的负面影响
已引起高度重视 ,以植物为原料开发毒性低 、效力强的植物
源农药 ,是解决这一问题的重要途径 。目前 ,臭牡丹根提取
物对植物病原菌抑制作用尚未见报道。因此 ,笔者对以广泛
引发植物病害的小麦纹枯 、小麦赤霉 、水稻纹枯 、玉米大斑病
菌为检测菌 ,对臭牡丹根的抗植物病菌活力进行了研究 ,以
便为臭牡丹的推广应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料 臭牡丹根采自四川宜宾 ,洗净烘干粉碎并密封
保存。小麦纹枯病菌(RhixoctoniacerealisV.Hoeven)、小麦赤
霉菌(Fusariumgraminearum)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniaso-
lani)、玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica)由宜宾学院生命科
学与食品工程系微生物实验室提供 。
1.2 方法
1.2.1 臭牡丹根提取物的制备 。用天平称取 4份 30 g的臭
牡丹根粉末 ,分别放入 4个圆底烧瓶中 ,按照 1∶8的料液比 ,
各加入 240ml的 80%乙醇 、乙醚 、乙酸乙酯 、蒸馏水 ,分别置
于 90、37、77、100℃恒温水箱中回流提取 3h;过滤去渣 ,将滤
液于旋转蒸发器浓缩得浸膏 ,再在真空干燥箱烘干 48 h,密
封置于 4℃冰箱保存备用。
1.2.2 PDA培养基的配制 [ 6] 。
1.2.3 菌种的活化。把灭过菌的培养皿和 PDA培养基倒平
板。冷却凝固后 ,用接种针挑取少许待活化的菌种进行划线
接种 , 28 ℃恒温箱中培养 48 h后 ,再进行活化 ,使这些菌种
有较强的活力 [ 6] 。
1.2.4 提取液的稀释。用针筒取 4 ml的原液 ,经微孔滤膜除
菌后 ,置于无菌的小烧杯中 ,分别用二甲亚砜配成初始浓度为
400、350、300、250、200、160、130、100、50mg/ml的药液。
1.2.5 抑菌实验。将提取液以 1∶10比例加入冷却至 45 ℃
左右的 PDA培养基中混匀 ,制成平板 ,以二甲亚砜和无菌水
作为对照 ,每个处理重复 3次。待平板凝固后接入生长一致
的菌饼(d=7.0mm),每皿 1个 ,置于 28 ℃恒温培养箱中培
养 48h后 ,用十字交叉法测菌落直径 [ 7] 。并用下列公式计
算菌丝生长抑制率:
菌落直径(mm)=测量菌落直径平均值 -7.0
抑制率(%)=对照菌落直径 -处理菌落直径处理菌落直径 ×100
1.2.6 最小抑菌浓度(MIC)的测定。用打孔器取菌落边缘
生长一致的 7 mm的菌饼备用。加热事先已灭菌的 PDA,待
培养基溶化后 ,将臭牡丹根提取液及对照分别 1 ml加入到 9
mlPDA中混匀 ,倒平板 ,则处理药液终浓度分别为 40、35、
30、25、20、16、13、10、5 mg/ml。待平板凝固后将菌饼放置在
含药液培养基和对照培养基上 ,菌丝一面向下 ,每皿接 1块 ,
每个处理重复 3次 ,置于 28℃恒温培养箱中培养 48h后 ,测
量菌落直径 [ 8] ,培养基中无菌落生长的即为该提取物的最小
抑菌浓度。
1.2.7 pH值对抑菌作用的影响。以小麦赤霉为指示菌 ,根
据最低抑菌浓度 ,配制含药 30 mg/ml培养基 ,再用 1 mol/L
的 HCl和 1 mol/L的 NaOH调配成 pH值分别为 5、6、7、8的
培养基 ,凝固后接入生长一致的小麦赤霉菌饼(d=7 mm),
责任编辑 陈秀晨 责任校对 卢瑶安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2009, 37(32):15884-15886, 15898
每皿 1个 ,每个处理重复 3次 , 48 h后用十字交叉法测菌落
直径 ,观察不同 pH值下臭牡丹根提取物的抑菌活性。
2 结果与分析
2.1 不同提取物对受试菌的抑菌圈 由表 1可知 , 4种提取
物对受试菌均有不同程度的抑制作用 ,其中 ,蒸馏水提取物的
抑菌效果最好 ,其次为乙酸乙酯 、乙醚、80%乙醇提取物的抑菌
效果最差 ,表明蒸馏水能有效提取出臭牡丹根对供试菌的抑菌
活性成分。4种溶剂提取物对小麦赤霉病菌的抑制效果几乎
都优于其他的菌种 ,而对玉米大斑病菌的抑制效果最差 ,可能
是其抑菌机理不同 ,导致对不同菌的抑菌能力产生差异。
表 1 臭牡丹根 4种溶剂提取物对受试菌的抑菌效果
Table1 AntimicrobialefectoftheextractsofClerodendronbungeirootswith4solventsondiferentthali mm
溶剂提取物Solventextracts
小麦纹枯病菌抑制圈直径InhibitioncyclediameterofRhixoctoniacerealis
小麦赤霉病菌抑制圈直径InhibitioncyclediameterofFusariumgraminearum
水稻纹枯病菌抑制圈直径InhibitioncyclediameterofRhizoctoniasolani
玉米大斑病菌抑制圈直径InhibitioncyclediameterofSetosphaeriaturcica
蒸馏水 Distiledwater 7.0 7.0 7.7 12.3
80%乙醇 80%ethanol 11.4 10.8 12.7 9.5
乙酸乙酯 Ethylacetate 9.4 7.9 10.0 10.1
乙醚 Ether 9.4 7.0 9.3 10.2
水(CK)Water(CK) 26.0 17.0 20.0 21.0
二甲亚砜(CK)Dimethylsulfoxide(CK) 20.0 18.0 19.0 22.0
由表 2可知 ,蒸馏水提取液对小麦纹枯病菌和小麦赤霉
病菌抑制效果最好 ,抑制率为 87.76%,其次为水稻纹枯病
菌 ,对玉米大斑病菌的抑制效果最差。 80%乙醇提取液对玉
米大斑病菌的抑制效果较好 ,对其他 3种菌的抑制效果都不
理想 ,抑制率均低于 22%。乙酸乙酯提取液对小麦赤霉病菌
的抑制效果最好 ,抑制率为 72.12%。乙醚提取液对水稻纹
枯病菌的抑制效果最好 ,抑制率为 87.86%。
表 2 臭牡丹根 4种溶剂提取物对受试菌的抑制率
Table2 InhibitionrateoftheextractsofClerodendronbungeirootswith4solventstodifferentthali %
溶剂提取物Solventextracts 小麦纹枯病菌Rhixoctoniacerealis 小麦赤霉病菌Fusariumgraminearum 水稻纹枯病菌Rhizoctoniasolani 玉米大斑病菌Setosphaeriaturcica
蒸馏水 Distiledwater 87.86 87.86 70.78 6.22
80%乙醇 80% ethanol 14.45 21.09 3.37 37.84
乙酸乙酯Ethylacetate 38.86 72.12 31.50 29.81
乙醚 Ether 39.90 40.79 87.86 42.93
2.2 不同提取物对受试菌的最小抑菌浓度(MIC) 由表 3
~6可知 ,乙酸乙酯提取液对小麦赤霉病菌 、小麦纹枯病菌 、水
稻纹枯病菌和玉米大斑病菌最小抑菌浓度为分别为 16、20、20、
25mg/ml;80%乙醇提取液对水稻纹枯病菌和小麦赤霉病菌的
最小抑菌浓度为 30mg/ml,而对小麦纹枯病菌和玉米大斑病菌
的最小抑菌浓度为 35mg/ml;蒸馏水提取液对小麦纹枯病菌和
小麦赤霉病菌的最小抑菌浓度为 10mg/ml,水稻纹枯病菌和玉
米大斑病菌的最小抑菌浓度分别为 16、20 mg/ml;乙醚提取液
对小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌 、水稻纹枯病菌和玉米大斑病
菌最小抑制浓度分别为 10、20、20、30 mg/ml。
4种提取物对 4种受试菌均有不同程度的抑菌效果 ,其
中 , 4种提取物对小麦赤霉病菌的抑制效果都较理想 ,除了
80%乙醇和乙酸乙酯提取物的 MIC大于 16 mg/ml外 ,另 2
种提取物的 MIC均为 10 mg/ml;其次为水稻纹枯病菌 , MIC
在 16 ~30mg/ml。总的看来 ,臭牡丹根提取物对这几种常见
植物致病菌的 MIC均在 35mg/ml以下。
表 3 不同浓度乙酸乙酯提取物的抑菌效果
Table3 Antimicrobialefectoftheextractsfromethylacetateunderdiferentconcentrations
乙酸乙酯提取液浓度∥mg/mlConcentrationofethylacetateextract
小麦纹枯病菌抑制圈直径∥mmInhibitioncyclediameterofRhixoctoniacerealis
小麦赤霉病菌抑制圈直径∥mmInhibitioncyclediameterofFusariumgraminearum
水稻纹枯病菌抑制圈直径∥mmInhibitioncyclediameterofRhizoctoniasolani
玉米大斑病菌抑制圈直径∥mmInhibitioncyclediameterofSetosphaeriaturcica
40 7.0 7.0 7.0 7.0
35 - - - 7.0
30 - - - 7.0
25 - - - 7.0
20 7.0 7.0 7.0 7.8
16 7.0 7.7 7.6 8.3
13 7.3 8.5 8.9 9.4
10 7.9 9.4 11.0 10.1
5 20.5 12.4 13.7 11.1
MIC∥mg/ml 16 20 20 25
注:-表示此浓度的提取液没有做抑菌试验 ,下同。
Note:-meansbacteriostatictestwasnotexperimentedatthisconcentration, thesameastable5-6.
1588537卷 32期 林娜等 臭牡丹根提取物的抑菌效果研究
表 4 不同浓度乙醇提取物的抑菌效果
Table4 Antimicrobialeffectoftheextractsfromethanolunderdifferentconcentrations
乙醇提取液浓度∥mg/mlConcentrationofethanol
小麦纹枯病菌抑制圈直径∥mmInhibitioncyclediameterofRhixoctoniacerealis
小麦赤霉病菌抑制圈直径∥mmInhibitioncyclediameterofFusariumgraminearum
水稻纹枯病菌抑制圈直径∥mmInhibitioncyclediameterofRhizoctoniasolani
玉米大斑病菌抑制圈直径∥mmInhibitioncyclediameterofSetosphaeriaturcica
40 7.0 7.0 7.0 7.0
35 7.0 7.0 7.0 7.0
30 7.0 7.4 7.0 7.4
25 7.5 8.6 7.4 8.0
20 8.6 9.3 8.2 8.7
10 10.1 10.3 12.7 9.5
5 12.5 11.5 14.9 11.2
MIC∥mg/ml 30 35 30 35
表 5 不同浓度蒸馏水提取物的抑菌效果
Table5 Antimicrobialefectoftheextractsfromdistiledwaterunderdifferentconcentrations
蒸馏水提取液浓度∥mg/mlConcentrationofdistiledwater
小麦纹枯病菌抑制圈直径∥mmInhibitioncyclediameterofRhixoctoniacerealis
小麦赤霉病菌抑制圈直径∥mmInhibitioncyclediameterofFusariumgraminearum
水稻纹枯病菌抑制圈直径∥mmInhibitioncyclediameterofRhizoctoniasolani
玉米大斑病菌抑制圈直径∥mmInhibitioncyclediameterofSetosphaeriaturcica
40 7.0 7.0 7.0 7.0
20 7.0 7.0 7.0 7.0
16 - - 7.0 7.4
13 - - 7.4 8.7
10 7.0 7.0 7.7 12.3
5 7.8 7.5 8.5 19.5
MIC∥mg/ml 10 10 16 20
表 6 不同浓度乙醚提取物的抑菌效果
Table6 Antimicrobialefectoftheextractsfrometherunderdifferentconcentrations
乙醚提取物浓度∥mg/mlConcentrationofether
小麦纹枯病菌抑制圈直径∥mmInhibitioncyclediameterofRhixoctoniacerealis
小麦赤霉病菌抑制圈直径∥mmInhibitioncyclediameterofFusariumgraminearum
水稻纹枯病菌抑制圈直径∥mmInhibitioncyclediameterofRhizoctoniasolani
玉米大斑病菌抑制圈直径∥mmInhibitioncyclediameterofSetosphaeriaturcica
40 7.0 7.0 7.0 7.0
35 - - - 7.0
30 - - - 7.0
25 - - - 7.4
20 7.0 7.0 7.0 8.9
16 - 7.3 7.6 -
13 - 8.5 8.4 -
10 7.0 9.4 9.3 10.2
5 7.5 11.1 11.7 13.1
MIC∥mg/ml 10 20 20 30
2.3 pH值对抑菌作用的影响 由表 7可知 ,同一提取物在
不同的 pH值条件下 ,对小麦赤霉病菌的抑制作用不同 。乙
酸乙酯提取物在中性条件下 ,抑菌效果较好 ,然后 ,随着 pH
值增加或减小而变差;80%乙醇提取物的抑菌效果与前者相
似;乙醚提取物在酸性下 ,对小麦赤霉病菌的抑制作用大于
在中性和碱性条件下;而蒸馏水的则与乙醚相反 ,表明其抑
菌活性受 pH值的影响较大。
表 7 不同pH值下 4种提取物的抑菌效果
Table7 Antimicrobialefectof4extractsunderdifferentpHvalneconditions
pH值pHvalue
乙酸乙酯提取物Ethylacetateextract
乙醚提取物Etherextract
80%乙醇提取物
80%ethanolextract
蒸馏水提取物Distiledwaterextract
5 21.8 15.1 21.1 20.3
6 18.0 15.3 18.0 16.7
7 16.3 21.8 14.0 14.5
8 13.2 15.5 19.0 18.3
3 结论与讨论
由臭牡丹根不同溶剂提取物对 4种供试病原菌离体生
物活性的测试结果可知 ,臭牡丹根有较好的抑菌活性。不同
溶剂提取物的抑菌活性不同 ,相同溶剂对不同菌种的抑菌活
性也不同 ,这是因为不同溶剂所提取的化学成分的类别和含
量不同以及活性成分对不同菌种的菌丝或孢子的生长抑制
机理不同所致 ,因此 ,还有待于进一步更深入的研究 。
臭牡丹根提取物的抑菌活性受 pH值的影响 ,因此 ,在作
为植物源杀菌剂使用时 ,要注意 pH值 ,以提高杀菌的效果。
在长期使用化学农药产生一系列公害问题的情况下 ,寻找
“绿色农药 ”成为了时下非常紧迫的任务。植物源农药具有
取之自然 ,用之自然 ,低毒 、低残留 、不易产生抗药性 ,可降低
或避免化学农药带来的 “农药公害 ”等优点 [ 9] 。臭牡丹为开
发天然植物源杀菌剂增加了新的选择。目前 ,国内外对臭牡
(下转第 15898页)
15886 安徽农业科学 2009年
子和时间纳入同一模型中进行同一分析的重要性及可靠性 。
模型中 γj值的大小反映了在第 j个时段内感病幼虫平均死
亡率高低 , γ5值最大 ,表明宿主幼虫饲毒后的第 5个时段(第
5天)病毒对宿主的平均致死率最高 ,与实际观察结果一致 。
模型各系数经 t检验相关极显著 ,经 Pearson卡方检验(检验
值 43.18>χ20.05 =35.17), TDM模型模拟值与观测值差异显
著 ,而 Hosmer-Lemoshow统计量检验不显著(统计量 6.88<
χ20.05 =15.51),这样复杂的模型要通过 Pearson卡方检验显得
过于苛刻 ,因而只要能通过 Hosmer-Lemoshow拟合度测试 ,
表明模型仍能较好地拟合试验数据 。
表 1 时间 -剂量-条件死亡率模型的参数估计及显著性检验
Table1 Parametersestimationanditssignificancetestfromthemod-
elingoftime-dosage-mortalityofS.lituranuclearpolyhedro-
sisvirus
参数Parameter
方程系数Equationcoeficient
标准误差Standarderor
t值tvalue
显著水平Levelofsignificance
β -1.014 1 0.349 7 2.899 9 0.008 1
γ1 -5.459 5 1.108 5 4.925 3 0.000 1
γ2 -4.353 9 0.595 1 7.315 9 0.000 1
γ3 -3.487 5 0.385 6 9.044 7 0.000 1
γ4 -1.966 2 0.202 5 9.708 5 0.000 1
γ5 -1.510 7 0.174 5 8.658 8 0.000 1
γ6 -1.522 7 0.192 0 7.931 5 0.000 1
γ7 -1.806 9 0.228 3 7.915 9 0.000 1
γ8 -1.825 1 0.247 5 7.374 6 0.000 1
γ9 -1.749 3 0.250 7 6.977 1 0.000 1
γ10 -2.455 5 0.362 4 6.775 2 0.000 1
γ11 -1.708 2 0.277 7 6.151 8 0.000 1
γ12 -2.080 2 0.356 8 5.830 9 0.000 1
2.2 病死中时间(LT50)和 LT90的估计 病死中时间(LT50 )
和 LT90的估计值见表 2。由表 2可以看出 ,随着饲毒浓度的
升高 , LT50值在减小 ,在浓度为 200倍时 ,需要 8.992 8d才能
引起 50%的个体死亡;而在浓度为 50倍时 ,只需要 6.425 6 d
就能引起 50%的个体死亡。这表明时间效应是浓度相关函
数 。由于是子代幼虫 ,所以死亡率均未达到 90%, LT90值为
空白。
3 结论与讨论
应用 TDM模型分析生物测定数据 ,近几年来在国际上
表 2 不同浓度处理下 TDM模型估计的 LT50和LT90
Table2 LT50 andLT90 valuesestimatedbytheTDMmodelindiferent
concentrations
稀释度 Dilution LT50∥d LT90∥d
50倍 50times 6.425 6 -
100倍 100times 7.933 6 -
200倍 200times 8.992 8 -
逐渐流行 ,正在取代已沿用半个世纪的机率值分析方法。昆
虫种群内的不同个体感染同一病原物后 ,死亡时间存在差
异。采用目前常用的平均致死时间和致死中时间难以反映
这种差异 ,更难准确预测或模拟种群的整个病死动态过程。
通过 TDM模型能将时间和剂量效应统一到一个模型中 ,使
模型有了坚实的生物学基础 。该研究引入 TDM模型分析了
斜纹夜蛾田间子代染病种群 ,及在孵化后 13 d内的每日病死
时间分布 ,取得了初步结果 ,表明在有效的病毒浓度和流行
的时间范围内 , TDM模型能有效地模拟斜纹夜蛾田间子一代
种群的每天病亡率。
衡量病毒类杀虫剂对害虫的防治效果 ,以往国内外通常
用当代害虫的死亡百分率作为唯一标准 ,但是 ,由于病毒有
急性和慢性致病作用 ,即病毒不仅对当代害虫有致病作用 ,
对子代害虫也有亚致死作用 ,且这种亚致死作用效果甚至可
以延续多代。试验应用 TDM模型评价了虫瘟 1号病毒液对
斜纹夜蛾子代的效果 ,结果表明了虫瘟 1号对斜纹夜蛾成虫
当代饲毒后 ,对子代也有明显的控制效果 ,而化学农药对当
代害虫虽有很好的控制作用 ,但子代害虫种群呈上升趋势 ,
大量使用化学农药易引起害虫再猖獗。
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(上接第 15886页)
丹的研究甚少 ,且主要是对臭牡丹的成分和医药方面的研究
较少 。该试验为新农药的研制和先导化合物的发现提供理
论依据和技术支撑 ,也为臭牡丹综合开发利用提供新的
途径。
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