全 文 ：［收稿日期］ 20150120(021)
［基金项目］ 广西自然科学基金项目(2012GXNSFAA053079) ;广西中医药科技专项项目(GZKZ10-124) ;桂林市科学研究与技术开发计
划项目(20120121-1-17)
［通讯作者］ * 黄桂红，硕士，主任药师，硕士生导师，从事中药抗糖尿病及抗哮喘研究，Tel:0773-2810610，E-mail:huangguihong120@
126． com
黄皮叶提取物对哮喘大鼠血清
及肺组织 Th1 /Th2 平衡的调节作用
黄桂红* ，韦江红，陈薇，董晓敏，廖曾珍，杨华
(桂林医学院 附属医院，广西 桂林 541001)
［摘要］ 目的:探讨黄皮叶提取物对哮喘大鼠炎症反应中 Th1 /Th2 细胞因子平衡的调节作用。方法:将健康雄性 SD 大
鼠 48 只，随机分为 6 组，分别为正常组、哮喘模型组、地塞米松组(1. 5 mg·kg －1·d －1)、黄皮叶提取物低、中、高剂量组(520，
1 040，2 080 mg·kg －1·d －1)。除正常组外，其余各组分别在第 1，7 天采用卵清蛋白致敏法 ih 致敏液，并于第 15 天开始，各给
药组大鼠每天在灌胃给药后 1 h进行雾化激发，连续 1 周;正常组及模型组以生理盐水灌胃代替。分别采用 ELISA法测定大
鼠血清中一氧化氮(NO) ，白三烯 D4(LTD4) ，白细胞介素-4(IL-4) ，γ-干扰素(IFN-γ)的含量、硝酸还原法测肺组织 NO 含量;
ＲT-PCT法测定肺组织中 IL-4，IFN-γ mＲNA表达及观察肺组织病理学改变。结果:与正常组比较，模型组大鼠血清中 NO，IL-
4，LTD4 的含量明显升高，IFN-γ的含量降低，肺组织 NO含量明显升高，大鼠肺组织中 IL-4 mＲNA表达明显升高，IFN-γ mＲNA
表达明显降低(P ＜ 0. 01) ;与模型组比较，黄皮叶提取物低、中、高剂量组均能明显减少血清中 NO，IL-4 的含量，升高 IFN-γ的
含量(P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) ，黄皮叶提取物高、中剂量组能减少哮喘大鼠肺组织中 NO的含量，黄皮叶提取物高剂量组能明显减
少哮喘大鼠血清中 LTD4 的含量(P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) ，黄皮叶提取物低、中、高剂量组能明显降低哮喘大鼠肺组织中 IL-4
mＲNA表达，增加 IFN-γ mＲNA表达(P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01)。结论:黄皮叶提取物能有效的减少哮喘大鼠的炎症反应，其机制可
能是通过调节 Th1 /Th2 细胞因子的平衡，从而减轻炎症细胞浸润有关。
［关键词］ 哮喘大鼠;黄皮叶提取物;炎症因子;Th1 /Th2
［中图分类号］ Ｒ285． 5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2015)19-0097-04
［doi］ 10. 13422 / j． cnki． syfjx． 2015190097
Ｒegulating Effects of Clausenae Lansii Folium Extracts on Th1 /Th2 Balance in Serum and Lung Tissue of
Asthmatic Ｒats HUANG Gui-hong* ，WEI Jiang-hong，CHEN Wei，DONG Xiao-min，LIAO zeng-zhen，
YANG Hua (Affiliated Hospital of Guilin Medical College，Guilin 541001，China)
［Abstract］ Objective:To explore the regulating effects of Clausenae Lansii Folium extracts on
cytoskines level of type Th1 /Th2 in inflammation reaction on asthmatic rats． Method:Forty-eight healthy male
rats were randomly divided into six groups:normal control group，asthma model group，dexamethasone group
(1. 5 mg·kg －1·d －1) ，Clausenae Lansii Folium extracts groups of low，medium and high doses (520，1 040，
2 080 mg·kg －1·d －1)． Except normal control group，all the other groups were sensitized with ovalbum by
subcutaneous injection on the first and the seventh day． From the fifteenth day，rats in various administering groups
received atomization treatment 0. 5 hour after gavage 1 hour for 1 week． The normal control group and asthma model
group were treated with normal saline instead． The levels of nitric oxide (NO) ，leukotriene D4 (LTD4) ，
interleukin (IL-4) ，interferon-γ (IFN-γ)in serum were measured by ELISA，and NO in lung tissue was detected
by nitrate reductase method． The expression of IL-4，IFN-γ mＲNA in lung tissue was measured by ＲT-PCＲ． The
pathological changes in lung tissue were observed． Ｒesult:Compared with the normal group，levels of NO，IL-4
and LTD4 in serum of rats in model group were significantly higher，and IFN-γ content was lower． NO content in
lung tissues was also significantly higher，IL-4 mＲNA expression was significantly higher，and IFN-γ mＲNA was
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significantly lower (P ＜ 0. 01)． Compared with the model group，all of Clausenae Lansii Folium groups of low，
medium and high dose could significantly reduce NO and IL-4 levels in serum，and increase IFN-γ level (P ＜
0. 05，P ＜ 0. 01)． Clausenae Lansii Folium groups of high，medium doses could reduce the level of NO in lung
tissues of the asthma rats． Clausenae Lansii Folium high dose group could significantly reduce the level of LTD4 in
serum of asthma rats (P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01)． All of Clausenae Lansii Folium groups of low，medium and high dose
could significantly reduce IL-4 mＲNA expression and increase IFN-γ mＲNA expression (P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01)．
Conclusion:The extracts of Clausenae Lansii Folium are effective in treatment of inflammation reaction in
asthmatic rats by adjusting Th1 /Th2 balance，and reducing the infiltration of inflammation cells．
［Key words］ asthmatic rat;Clausenae Lansii Folium extracts ;inflammation cytoskines;Th1 /Th2
哮喘的发病机制通常与免疫失衡、炎性介质释
放等多种因素有关。Th1 /Th2 细胞亚群在数目和功
能的平衡失调，导致 Th2 类细胞因子表达和释放增
多，使以 γ-干扰素(IFN-γ)为特征因子的 Th1 不能
有效的抑制以白细胞介素-4(IL-4)为代表的 Th2 细
胞因子，使得 Th2 型细胞因子过度释放，从而加重气
道炎症，导致哮喘的反复发作［1］。黄皮叶在广西壮
族民间主要用于治上感、痰咳哮喘等相关疾病，本课
题组前期研究已证实黄皮叶提取物具有镇咳、祛痰
及平喘的作用［2］，但其作用机制尚未清楚，为更好
的研究黄皮叶提取物的平喘作用，本课题组拟从黄
皮叶提取物调控以 IFN-γ，IL-4 为代表的 Th1 /Th2
细胞平衡，探讨其抗炎平喘作用机制，为开发新的民
族草药提供理论依据。
1 材料
1. 1 动物 SPF级 SD大鼠，雄性，体重(200 ±30)g，
由桂林医学院动物实验中心提供，合格证号为
SCXK(桂)2007-0001。
1. 2 药物及试剂 黄皮叶提取物经桂林医学院生
药学教研室杜泽香教授鉴定为芸香科植物黄皮属黄
皮 Clausena lansium 的干燥叶(黄皮叶干燥粗粉用
70%乙醇提取后浓缩后所得，批号 20130506)。卵清
蛋白(OVA，美国 Sigma 公司，批号 9006-59-1) ，氢氧
化铝凝胶(美国 Sigma公司，批号 A8222) ，灭活百日
咳杆菌(北京生物制品研究所，批号 Ｒ201002) ，地塞
米松片(天津药业集团新郑股份有限公司，批号
120307) ，一氧化氮(NO)试剂盒(南京建成公司，批
号 A102) ，蛋白定量测试盒(南京建成公司，批号
A045-2) ，IL-4，IFN-γ ELISA 试剂盒(武汉博士德公
司，批号 EK0406) ，PCＲ 引物，内参照 β-actin 引物
均由上海生物工程有限公司合成，Trizol 试剂(美国
Invitrogen 公司，批号 15596-026) ，逆转录试剂盒
(美国 Fermentas 公司，批号 k1622) ，DreamTaqTM
Green PCＲ Master Mix (2 ×，美国 Fermentas公司，批
号 k1081)。黄皮叶提取物制备:黄皮叶干燥粗粉
500 g依次以物液比 1∶ 10，1∶ 8，1∶ 6加入 70%乙醇溶
液，回流提取 3 次，每次 2 h，滤过，合并滤液，将滤液
于旋转蒸发仪减压浓缩并真空干燥至稠膏状备用
(批号 20130506)。
1. 3 仪器 FA2004 型电子天平(上海精密仪器
厂) ，ＲE-52AA 型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器
厂) ，402AI 型超声波雾化器(江苏鱼跃公司) ，
Axioert 40 型倒置显微镜(德国 ZEISS 公司) ，libra
S32PC型紫外分光光度计(英国 Biochrom 公司) ，
PTC-100 型 PCＲ仪(美国 MJ Ｒesearch公司)。
2 方法
2. 1 分组与给药 取健康雄性 SD 大鼠 48 只，随
机分为 6 组，正常组，哮喘模型组，地塞米松组(1. 5
mg·kg －1) ，黄皮叶提取物低、中、高剂量组(520，
1 040，2 080 mg·kg －1) ，每组 8 只。正常组、哮喘模
型组以等量生理盐水 ig。
2. 2 哮喘大鼠模型的建立 除正常组外，其余各组
大鼠进行哮喘模型的建立。致敏阶段:大鼠分别于
第 1，7 天给予 ih 致敏液 1 mL(致敏液含 OVA 10
mg +氢氧化铝凝胶 200 mg +灭活百日咳杆菌 5 ×
109) ;激发阶段:从第 15 天开始每天将大鼠置于自
制密闭有机玻璃箱内，用 402AI 型超声雾化器给予
2%OVA /PBS溶液 50 mL雾化吸入，雾化吸入前 1 h
分别给予地塞米松(1. 5 mg·kg －1) ，黄皮叶提取物
低、中、高(520，1 040，2 080 mg·kg －1)剂量 ig，每天
激发 1 次，激发时间为 30 min，共雾化激发 1 周。在
雾化过程中大鼠出现喘息、咳嗽、躁动等典型的哮喘
发作症状为诱喘成功。正常组则以生理盐水代替致
敏原注射和雾化吸入。
2. 3 标本采集 大鼠于最后 1 次激发后 24 h内，ip
10%水合氯醛(0. 3 mL /100 g)麻醉，用无菌手术器
械开胸后迅速以一次性负压真空采血管行心脏采
血，以 3 000 r·min －1离心 15 min，去上清装于高压过
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的 EP 管内，并置于 － 80 ℃ 低温冰箱冻存用于
ELISA检测;采血后取出右上肺、右中肺及右下肺，
剪成大小约 1 cm ×1 cm，用 0. 1%DEPC水漂洗后装
入冻存管内，立即放于液氮中保存，之后放于
－ 80 ℃冻存，用于 ＲT-PCＲ及肺组织内 NO的测定;
左肺则经主支气管内灌注 4%多聚甲醛 6 mL 固定，
置于 4%多聚甲醛中保存，24 h 后做石蜡包埋，切片
(4 μm左右厚度) ，常规 HE染色。
2. 4 黄皮叶提取物对哮喘大鼠血清一氧化氮
(NO) ，白三烯 D4(LTD4) ，IFN-γ，IL-4 及肺组织 NO
的影响 采用 ELISA 检测试剂盒分别检测各组血
清中 NO，LTD4，IL-4，IFN-γ 的蛋白含量及硝酸还原
法测肺组织 NO含量。
2. 5 ＲT-PCＲ 法测定肺组织 IFN-γ，IL-4 mＲNA 的
表达 大鼠肺组织制备匀浆后，加入 1. 0 mL Trizol
裂解液中(按试剂说明书操作)抽提肺组织总 ＲNA。
逆转录及 cDNA的扩增严格按照试剂盒操作方法进
行。IL-4 ＲT-PCＲ 扩增反应 IL-4 上游引物 5-
CGGAATTCAACACCACGGAGAT-3，下游引物 5-
CCGCTCGAGCAGTGAGTTCAGT-3，扩增产物长度
为 211 bp。IFN-γ基因引物序列如下，上游引物 5-
CGAATTCCAAGGCACACTCATT-3，下 游 引 物 5-
CCGCTCGAGTCAGCACCGACTT-3，扩增产物长度
为 383 bp。内 参 为 β-actin，上 游 引 物 5-
ATGGGTTTTAGGCGCAGAGTTT-3，下 游 引 物 5-
ATGGGTTTTAGGCGCAGAGTTT-3，扩增产物长度为
424 bp。PCＲ反应条件为:94 ℃预变性 3 min，94 ℃
变性 30 s，退火(IL-4 59. 5 ℃，IFN-γ 63 ℃，β-actin
50 ℃)30 s，72 ℃延伸 30 s，(IL-4 37 s，IFN-γ 37 s，
β-actin 32 s)循环;72 ℃总延伸 10 min。取 5 μL
PCＲ扩增产物用 1. 5%琼脂糖凝胶电泳，并使用凝
胶成像系统进行扫描分析。
2. 6 统计学分析 采用 SPSS 19. 0 分析软件进行
统计学分析，实验结果均采用 珋x ± s 表示，各组间的
比较采用方差分析，两两比较采用 q 检验，以 P ＜
0. 05 为差异有统计学意义。
3 结果
3. 1 对哮喘大鼠血清 NO，LTD4，IFN-γ，IL-4 及肺
组织 NO的影响 与正常组比较，模型组大鼠血清
中 NO，LTD4，IL-4 及肺组织 NO 的含量明显升高，
IFN-γ 的含量明显降低(P ＜ 0. 01) ;与模型组比
较，黄皮叶提取物低、中、高剂量组均能明显减少
血清中 NO，LTD4，IL-4 及肺组织 NO 的含量，明显
增加IFN-γ的含量(P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01)。见表 1。
表 1 黄皮叶提取物对哮喘大鼠血清 NO，LTD4，IFN-γ，IL-4 及肺组织 NO的影响(珋x ± s，n = 8)
Table 1 Effects of Clausenae Lansii Folium extracts on levels of NO，LTD4，IFN-γ，IL-4 in serum and NO in lung tissue of asthmatic rats
(珋x ± s，n = 8)
组别
剂量
/mg·kg －1
血清
NO /μmol·L －1 LTD4 /mg·L －1 IFN-γ /ng·L －1 IL-4 /ng·L －1
肺组织 NO
/μmol·g － 1
正常 － 25. 62 ± 3. 662) 3. 00 ± 1. 012) 44. 17 ± 2. 282) 62. 64 ± 2. 382) 6. 34 ± 2. 912)
模型 － 49. 98 ± 9. 37 6. 48 ± 2. 73 34. 24 ± 1. 55 111. 71 ± 2. 39 10. 28 ± 2. 82
地塞米松 1. 5 30. 82 ± 4. 372) 4. 75 ± 1. 861) 82. 92 ± 3. 102) 71. 97 ± 1. 892) 6. 18 ± 2. 212)
黄皮叶提取物 520 43. 32 ± 3. 521) 6. 15 ± 2. 47 56. 36 ± 1. 902) 93. 54 ± 1. 942) 10. 16 ± 0. 87
1 040 36. 32 ± 8. 912) 5. 50 ± 2. 09 65. 30 ± 3. 452) 85. 70 ± 2. 292) 7. 48 ± 1. 981)
2 080 36. 00 ± 4. 022) 4. 30 ± 1. 371) 73. 95 ± 2. 012) 77. 33 ± 1. 712) 6. 96 ± 2. 751)
注:与模型组比较1)P ＜ 0. 05，2)P ＜ 0. 01(表 2 同)。
3. 2 对哮喘大鼠肺组织 IFN-γ，IL-4 mＲNA 表达的
影响 与正常组比较，模型组大鼠肺组织中 IFN-γ
mＲNA表达明显降低，IL-4 mＲNA表达明显升高;与
模型组比较，黄皮叶提取物高、中、低剂量组哮喘大
鼠肺组织中 IFN-γ mＲNA表达明显增多，IL-4 mＲNA
表达明显减少，且呈剂量依赖性。见图 1。
3. 3 对哮喘大鼠肺组织病理学的影响 哮喘模型组
肺泡间质明显增宽、充血，有较多的炎症细胞，肺泡功
能萎缩;黄皮叶提取物高、中剂量组显示大鼠肺泡间
质较模型组有明显改善，炎症细胞明显减少，肺泡功
能有所好转。说明黄皮叶提取物有减少哮喘大鼠肺
组织炎症细胞浸润，改善肺泡功能的作用。见图 2。
4 讨论
支气管哮喘是由多种炎症细胞参与的慢性变态
反应性疾病，炎性细胞通过合成和释放多种炎症介
质及细胞因子而诱发哮喘发作，辅助性 TLY控制哮
喘的炎症反应［3］。研究认为初始 Th0 激活后，可以
分化为 Th1 细胞，Th2 细胞和调节性 T 细胞(Treg)
等。Th2 细胞介导体液免疫应答，辅助 B 淋巴细胞
合成 IgE，上调 IL-4 和 IL-13 等，加重哮喘炎症反应;
Th1 细胞介导细胞免疫应答，通过促进分泌 IFN-γ，
IL-12 等细胞因子，而逆转哮喘气道炎症。本实验通
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A. 正常组;B. 模型组;C. 地塞米松组;D. 黄皮叶提取物 2 080
mg·kg －1组;E. 黄皮叶提取物 1 040 mg·kg －1组;F. 黄皮叶提取物
520 mg·kg －1组(图 2 同)
图 1 黄皮叶提取物对哮喘大鼠肺组织 IFN-γ，IL-4 mＲNA 表达
的影响
Fig． 1 Effects of Clausenae Lansii Folium extracts on expression of
IFN-γ，IL-4 mＲNA on lung tissues in asthmatic rats
图 2 黄皮叶提取物对哮喘大鼠肺组织病理学的影响(HE，× 100)
Fig． 2 Effects of Clausenae Lansii Folium extracts on pathological
changes of lung tissues in asthmatic rats (HE，× 100)
过建立哮喘大鼠模型，分别检测哮喘大鼠血清中
IFN-γ，IL-4含量及肺组织中 IFN-γ，IL-4 mＲNA 的表
达，结果提示:与哮喘模型大鼠组比较，黄皮叶提取物
高、中、低剂量组大鼠血清中 IL-4 含量及IL-4 mＲNA
的表达明显降低;而血清中 IFN-γ 含量及 IFN-γ
mＲNA表达明显升高。说明黄皮叶提取物可以通过
降低 IL-4 的表达和升高 IFN-γ 的表达来调节 IL-4 /
IFN-γ比例的失衡，从而减少哮喘的炎症反应。
与哮喘相关的炎症介质有 20 多种，主要有组
胺、白三烯(LTs)、前列腺素、血小板活化因子、碱性
蛋白质和细胞因子［4］。而白三烯的合成与释放和
肥大细胞，EOS 密切相关，这两种细胞正是与哮喘
有关的关键细胞。LTD4 可以通过促进炎性细胞尤
其是嗜酸性粒细胞聚集及增加其他细胞因子，如
IL-4，IL-5，TNF-α等的生成和增加其活性，引起气道
毛细血管血管通透性增加、黏液分泌增多，导致气道
炎症发生。而 NO 在哮喘的发病中具有双相作用，
在生理状态下，机体产生低浓度 NO 可以选择性的
提高对 Th1 细胞的诱导，而对 Th2 细胞无影响。因
此低浓度 NO可介导支气管平滑肌的松弛和血管的
舒张反应，降低哮喘患者的气道高反应;在病理状态
下，局部大量高浓度的 NO 可选择性抑制 Th1 细胞
增殖和 IL-12，IFN-γ的产生，使 Th2 细胞大量增殖，
促使释放 IL-4，IL-5 等细胞因子，加重气道嗜酸粒细
胞的浸润，引起气道充血、血浆渗漏，造成肺上皮细
胞及组织损伤，诱发和加重气道的炎症反应［5］。本
实验通过检测哮喘大鼠血清中 LTD4，血清及肺组织
中 NO含量，发现黄皮叶提取物高、中剂量组能明显
降低哮喘大鼠血清及肺组织中 NO 的含量，从而减
少高浓度的 NO 对气道及肺组织的损伤，缓解气道
的炎症反应。而黄皮叶提取物组高剂量组能减少哮
喘大鼠血清中 LTD4 的含量，说明黄皮叶提取物高
剂量组能减少气道炎症介质的释放，从而减少哮喘
的炎症反应。
总之，本实验利用黄皮叶提取物对哮喘大鼠模
型进行干预，结果显示黄皮叶提取物能减少哮喘大
鼠的炎症反应，其作用机制可能为通过减少血清
IL-4含量及肺组织中 IL-4 mＲNA 表达，增加血清中
IFN-γ及肺组织中 IFN-γ mＲNA 的表达，调节 Th1 /
Th2 比例的失衡，减少哮喘炎症反应;另黄皮叶提取
物还可通过减少血清中 NO 及肺组织中 NO 含量、
减少 LTD4 中含量，从而减少炎症介质对气道及组
织的损伤，从而改善哮喘大鼠的炎症反应。
［参考文献］
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［责任编辑 周冰冰］
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