全 文 ：实用医学杂志 2016 年第 32 卷第 3 期
doi：10．3969 ／ j．issn．1006-5725．2016．03．008
基 金 项 目 ： 广 西 自 然 科 学 基 金 项 目 （编 号 ：2012GXNS-
FAA053079）；广西中医药科技专项项目 （编号 ：GZKZ10－124）；桂
林市科学研究与技术开发计划项目 （编号 ：20120121 －1 －17，
20140120－1－9）
作者单位：541199 桂林医学院第二附属医院
通信作者：黄桂红 E-mail：guihonghuang666＠163．com
支气管哮喘（bronchial asthma，BA，简称哮喘）
是以淋巴细胞、 嗜酸性粒细胞浸润气道黏膜为特
征的慢性气道炎症疾病 ［1］。 其发病机制与免疫失
衡、炎性介质释放等多种因素有关。 黄皮叶是芸香
科植物黄皮属（Clausenalansium （Lour．）Skeels 的干
燥叶。 《岭南采药录》中记载黄皮叶具有“疏风解
表、除痰行气。 治温病身热，咳嗽哮喘，气胀腹痛，
黄肿，疟疾，小便不利，热毒疥癞的作用”［2］。课题组
在前期研究中已证实黄皮叶提取物可通过调控
Th1 ／ Th2 平衡达到减少炎症因子产生的作用，在前
期研究的基础上探索其是否减少炎症因子 TNF-α
的产生 ， 及其对 TNF-α 的调控作用是否通过
TLR4 ／ MyD88 ／ TRAF6 ／ TNF-α 信号通路，本研究探
讨黄皮叶提取物对炎症因子的调控作用及其调控
分子机制，为黄皮叶的开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1．1 仪器及试剂 酶标仪： Molecular Devices 公
司 ， 型号 spectra max plus 384； ELISA 试剂盒 ：
BOSTER 公司；LPS：Sigma 公司； 培养基和胎牛血
清 ：Gibcol 公 司 ；β-actin 抗 体 购 自 ZSGB-BIO；
TLR4 抗 体 购 自 GeneTex （USA）；TRAF6 购 自
abcam （English）。
1．2 药物的提取 黄皮叶采自桂林市郊， 经桂林
医学院药用植物学教研室杜泽香教授鉴定为芸香
科植物黄皮属 （Clausenalansium （Lour．）Skeels 的干
燥叶。 黄皮叶提取物的提取：干燥黄皮叶粗粉，用
70％酒精回流提取 3 次，每次 2 h，收集滤液，用减
压旋转蒸发仪 40 ℃浓缩， 得浓缩稠膏状物体，真
空干燥得黄皮叶提取物， 置于－20 ℃保存 （批号：
20140604）。 使用时用 DMSO 溶解到最后体积为
黄皮叶提取物对 TNF-α分泌的影响及其机制
李娟 刘天旭 蒋国君 黄桂红 黄俊何 陶丽群 朱钊铭
摘要 目的： 探索黄皮叶提取物对 TNF-α 的影响及对 TNF-α 蛋白调控是否通过 TLR4 ／ MyD88 ／ TRAF6
信号通路。 方法：ELISA 法检测 TNF-α 含量；MTT 试验检测黄皮叶提取物和 LPS 对 RAW264．7 细胞抑制率
的影响；对细胞随机分组，Western Blot 法检测分组后 TLR4、TRAF6 蛋白表达。 结果：黄皮叶提取物、LPS 对
细胞生长无明显抑制；黄皮叶提取物使 TNF-α 水平降低 ；与 LPS 组比较 ，LPS＋MyD88 抑制剂组 、LPS＋黄皮
叶提取物组、LPS＋黄皮叶提取物＋MyD88 抑制剂组明显抑制 TNF-α 分泌，差异有统计学意义（P ＜ 0．05），分
别使 TLR4 和 TRAF6 蛋白降低至 74％、21％，70％、27％，44％、8．5％。 结论：黄皮叶提取物抑制 TNF-α 形成并
主要介导 TLR4 ／ MyD88 ／ TRAF6 信号通路中 MyD88 依赖信号通路抑制 TNF-α 形成。
关键词 黄皮叶提取物； 炎症因子； 信号通路； RAW264．7 细胞
Extract of HUANGPI inhibits secretion of TNF-α via TLR4 ／MyD88 ／ TRAF6 pathway LI Juan， LIU Tian-
xu， JIANG Guojun， HUANG Gui-hong， HUANG Jun-he， TAO Li-qun ，ZHU Zhaoming． The second Affiliated
Hospital of Guilin Medical University， Guilin， Guangxi 541199， China
Corresponding author：HUANG Gui-hong E-mail：guihonghuang666＠163．com
【Abstract】 Objective To investigate whetherthe extract of HUANGPI inhibitthe secretion of TNF-αvia
TLR4 ／ MyD88 ／ TRAF6 signaling pathway． Methods ELISA assay was performed to determine TNF-α level in
cell culture medium． MTT assay was used to detect the effects of the extract of HUANGPI and LPS on the
viabilities of RAW 264．7 cells． Proteinexpressions of TLR4 and TRAF6 were detected by Western blotting assay．
Results The extract of HUANGPI inhibited the secretion of TNF-αin a dose-dependent manner． Compared to
LPS group， were TNF-αwas significantly suppressed in the cells in LPS＋MyD88 inhibitor group， LPS＋extract
group and LPS＋extract ＋MyD88 inhibitor group，with the corresponding reductions of TLR4 and TRAF6 protein
expression at74％ and21％，70％ and27％，44％ and8．5％， respectively． Conclusion MYD88-dependent signaling
pathway might be involved in the mechanism underlying the effect of the extract of HUANGPI on suppressing
LPS-induced inflammation．
【Key words】 Extracts； Inflammatory factors； Signaling pathway； RAW264．7 cell
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A
注：n ＝ 3，*P ＜ 0．01
图 1 LPS 不同浓度、不同时间点对 RAW264．7 细胞分泌 TNF－α 的影响
B
0．1％（DMSO 对细胞生长没有影响）。
1．3 细胞培养 RAW264．7 细胞（小鼠单核 ／巨噬
细胞系） 购自武汉大学细胞所， 用含 10％胎牛血
清、青霉素 （100 U ／ mL）及链霉素 （100 mg ／ mL）有
酚红高糖 DMEM 培养液于 5％ CO2、37 ℃和 90％
湿度条件下传代培养。
1．4 LPS 诱导 RAW264．7 细胞分泌 TNF-α 分析
（1） 以 4 × 106个 ／孔接种于 6 孔培养板中，细
胞贴壁后， 每孔加入不同浓度 LPS（0．1、1、10、100
ng ／ mL），另设空白对照组，24 h 后收集各组培养细
胞的培养基，ELISA 法检测培养基中 TNF-α 的水
平 ， 具体步骤按试剂盒说明书进行操作 。 （2）
RAW264．7 细胞以 4 × 106 个 ／孔接种于 6 孔培养
板中， 细胞贴壁后， 每孔加入浓度为 1 ng ／ mL 的
LPS， 分别在 4、8、12、24、48 h 收集培养细胞的培
养基，ELISA 法检测培养基中 TNF-α 的水平，具体
步骤按试剂盒说明书进行操作， 在不同时间点均
设置空白组作阴性对照。
1．5 黄皮叶提取物、LPS 对 RAW264．7 细胞抑制
率的影响 MTT 试验 ：RAW264．7 细胞以 1 × 106
个 ／孔接种于 96 孔培养板中，细胞贴壁后，分别加
入黄皮叶提取物（25、50、100 μg ／ mL）和 LPS（1 ng ／
mL），第 48 小时加入 5 mg ／ mL 的 MTT 液 15 μL，4
h 后加入 150 μL DMSO，振荡 10 min，置入酶标仪
中检测，490 nm 测定吸光度。
1．6 ELISA 法测定黄皮叶提取物对 LPS 诱导
RAW264．7细胞分泌 TNF-α水平 RAW264．7细胞
以 4 × 106个 ／孔接种于 6孔培养板中，细胞贴壁后，
实验分组：空白对照组、LPS 组、黄皮叶提取物不同
浓度组（25、50、100 μg ／ mL）。 将黄皮叶提取物加入
细胞中干预，1 h 后加入 LPS （1 ng ／ mL），48 h 后收
集各组上清液，ELISA 法检测培养基中 TNF-α 的水
平。
1．7 ELISA 法 检 测 黄 皮 叶 提 取 物 是 否 介 导
TLR4 ／ MyD88 ／ TRAF6 ／ TNF-α 信号通路对 TNF-
α 分泌产生影响 RAW264．7 细胞以 10 × 106 个 ／
孔接种于直径为 10 cm2的培养皿中，实验分组（文
章中实验各分组代表都如此）：（1）正常组、（2）LPS
组 、（3）LPS＋MyD88 抑制剂组 、（4）LPS＋黄皮叶提
取物组、（5）LPS＋黄皮叶提取物＋MyD88 抑制剂组。
根据分组加入黄皮叶提取物（50 μg ／ mL），1 h 后加
入 LPS （1 ng ／ mL）， 第 46 小时加入 5 mmol ／ L
MyD88 抑制剂 ，2 h 后收集各组细胞培养基及细
胞，ELISA 法检测培养基中 TNF-α 的水平； 细胞用
RIPA buffer（Thermo）提取总蛋白，－80 ℃冰箱保存。
1．8 Western Blot 法测定黄皮叶提取物对 LPS
诱导 RAW264．7 细胞中 TLR4 和 TRAF6 蛋白的
影响 提取总蛋白的蛋白含量测定使用 PierceTM
BCA 蛋白含量测定试剂盒（Thermo），根据蛋白的
分子量选择不同浓度的分离胶和浓缩胶， 蛋白于
沸水中煮 5 min，跑胶完成后蛋白转至 TVDF 膜，一
抗比例分别为：TLR4 （1∶1 000）， TRAF6（1∶5 000）， β-
actin（1∶500），一抗封闭过夜，洗膜后 37 ℃孵二抗 1
h，二抗浓度为 1∶5 000，洗膜后使用 X-ray 曝光。
1．9 统计学方法 测得指标均用 x ± s 表示，采用
SPSS 18．0 软件包进行统计分析， 组间比较采用 F
检验， 两两比较采用 q 检验，P ＜ 0．05 为差异有统
计学意义。
2 结果
2．1 LPS 诱导 RAW264．7 细胞对 TNF-α 分泌影
响的结果 不同浓度的 LPS 诱导 RAW264．7 细胞
24 h， 均能增加 TNF-α 的分泌， 当 LPS 浓度为 1
ng ／ mL 时，TNF-α 的分泌量最多。 不同时间点诱导
RAW264．7 细胞，TNF-α 的分泌随时间的增加而不
断增多。 见图 1。
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注：n ＝ 3，P ＜ 0．05
图 2 黄皮叶提取物、LPS 对 RAW264．7 细胞抑制率的影响
注：n ＝ 3，与正常组比较，＃P ＜ 0．05；与 LPS 组比较，*P ＜ 0．05
图 3 黄皮叶提取物对 LPS 诱导 RAW264．7 细胞 TNF－α
分泌的影响
注：n ＝ 3，与正常组比较，＃P ＜ 0．01；与 LPS 组比较，*P ＜ 0．05
图 4 黄皮叶提取物通过介导 TLR4 ／ MyD88 ／ TRAF6 ／ TNF-
α 信号通路对 TNF-α 分泌的影响
2．2 黄皮叶提取物、LPS 对 RAW264．7 细胞抑制
率的影响 MTT 试验显示， 不同浓度黄皮叶提取
物、LPS（1 ng ／ mL）均对细胞的生长无显著抑制作
用。 见图 2。
2．3 黄皮叶提取物对 LPS 诱导 RAW264．7 细胞
分泌 TNF-α 的影响 与 LPS 组比较，黄皮叶提取
物不同浓度组 ， 分别使 TNF-α 的分泌降低至
30．2％、25．5％、21．8％，说明在一定的浓度范围内黄
皮叶提取物具有抗炎作用， 且其效果随浓度增加
而增加。 见图 3。
2．4 黄皮叶提取物对 TNF-α 的分泌的影响 LPS
组与空白对照组比较， 差异有统计学意义， 说明
LPS 诱导细胞炎症模型成功；与 LPS 组比较，LPS＋
MyD88 抑制剂组、LPS＋黄皮叶提取物组、LPS＋黄皮
叶提取物＋MyD88 抑制剂组均能减少 TNF-α 分泌，
LPS 组与 LPS＋MyD88 抑制组比较说明 MyD88 抑
制剂有抑制炎症形成的效果，LPS 组与 LPS＋黄皮
叶提取组比较说明黄皮叶提取物具有抗炎效果，
各组之间比较说明黄皮叶产生抗炎作用可能主要
通过抑制 MyD88 依赖通路。 见图 4。
2．5 Western Blot 法测定黄皮叶提取物对 LPS 诱
导 RAW264．7 细胞中 TLR4 和 TRAF6 蛋白的影
响 与 LPS 组比较，LPS＋MyD88 抑制剂组、LPS＋黄
皮叶提取物组、LPS＋黄皮叶提取物＋MyD88 抑制剂
组分别使 TLR4 和 TRAF6 蛋白降低至 74％、21％，
70％、27％，44％、8．5％， 进一步表明黄皮叶提取物
抗 炎 作 用 机 制 可 能 主 要 通 过 TLR4 ／ MyD88 ／
TRAF6 ／ TNF－α 信号通路中的 MyD88 依赖信号通
路来完成。 见图 5。
3 讨论
RAW264．7 属小鼠巨噬细胞系，广泛分布于全
身的免疫细胞，特别在肺组织中分布数量最多，巨
噬细胞炎症应答是引起多种疾病的关键 ［3－4］。 根据
巨噬细胞活化后功能不同， 大致可分为经典活化
巨噬细胞和替代活化巨噬细胞。 而经典活化巨噬
细胞高表达促炎因子 TNF-α、IL-1 等；替代活化巨
噬细胞则高表达抵抗素样分子家族蛋白、 壳多糖
酶等 ［5］。
LPS 是革兰阴性菌的外膜的主要成分， 在激
a
注：n ＝ 3，与正常组比较，＃P ＜ 0．01；与 LPS 组比较，*P ＜ 0．05
图 5 黄皮叶提取物对 LPS 诱导 RAW264．7 细胞中 TLR4
和 TRAF6 蛋白的影响
b c
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活 Toll（TLR4）样受体和激活炎症信号中起重要作
用 ［6］。刺激 TLR4 信号通路可导致 MyD88 依赖途径
和 MyD88 非依赖途径激活 。 而 MyD88 依赖性
TLR4 信号通路为多数病原相关分子模式［如革兰
阴性杆菌的内毒素脂多糖（LPS）、革兰阳性菌的肤
聚糖（PCN）和脂磷壁（LTA）等］所诱导 ［7］。
大量的研究 ［8－9］已证明，许多中药有抗炎作用。
国外有文献报道黄皮叶提取物中 Lansiumamide B
和 SB-204900 有抗炎作用， 包括抑制组胺的释放，
lL-6、cox-2 和 TNF-α 分泌， 其抗炎作用可能通过抑
制 p38 MAPK 通路的磷酸化 ［10］。 而 p38 MAPK通路
的上游通路有 MyD88 依赖性通路和 MyD88 非依
赖性通路，这给笔者提出了进一步研究依据。 本研
究使用 LPS 诱导细胞炎症模型；MTT 试验证实黄
皮叶提取物及 LPS 均对细胞的生长无明显抑制作
用 ； 细胞炎症模型形成后 ， 黄皮叶提取物处理
RAW264．7 细胞，结果发现黄皮叶提取物可以抑制
TNF-α 的形成 ； 将试验分为 5 组 ，ELISA 法检测
TNF-α 分泌情况，通过各组间的比较，发现黄皮叶
提取物抗炎作用机制可能主要通过 TLR4 ／ MyD88 ／
TRAF6 ／ TNF-α 信号通路中的 MyD88 依赖信号通
路 ；Western Blot 法检测 TLR4、TRAF6 蛋白的表
达， 本研究结果进一步证明黄皮叶提取物抗炎经
上述机制抗炎。 分析研究结果可知，黄皮叶提取物
通过抑制 MyD88 接头蛋白的激活，减少 MyD88 对
下游因子 TRAF6 的激活，从而抑制 NF-κB 游离进
入细胞核内，最终减少 TNF-α 的产生。目前黄皮研
究甚少， 仅有一些关于其单体的提取及作用方面
的研究 ［11］。 因此笔者希望通过实验来挖掘黄皮叶
不同的抗炎机制，为抗炎领域带来突破，也使黄皮
叶的药理作用更充分的被人们认识及利用， 在以
后的实验中也将提取黄皮叶不同的单体成分来研
究不同成分的作用及机制。
综上所述 ， 通过实验发现黄皮叶提取物对
TNF-α 有抑制作用， 其机制可能主要通过 TLR4 ／
MyD88 ／ TRAF6 ／ TNF-α 信号通路中的 MyD88 依赖
信号通路来完成， 黄皮叶提取物是否可能存在其
他抗炎途径，这还需要下一步的深入探讨。
4 参考文献
黄东晖，吴少丽，王慧贤，等 ． 喘可治注射液通过调节 Th17 ／
Treg 平衡抑制哮喘模型小鼠气道炎症的实验研究 ［J］． 中
药材，2014，37（3）：480－483．
江苏新医学院 ． 中药大辞典（下） ［M］． 12 版 ． 上海：上海科
学技术出版社，2003：2049．
PANT S， DESHMUKH A， GURUMURTHY GS， et al．
Inflammation and atherosclerosis－revisited ［J］． J Cardiovasc
Pharmacol Ther， 2014， 19（2）：170－178．
WALLERT M， SCHMOLZ L， KOEBERLE A， et al． alpha-
Tocopherol long-chain metabolite alpha-13′ -COOH affects the
inflammatory response of lipopolysaccharide-activated murine
RAW264．7 macrophages ［J］． Mol Nutr Food Res，2015， 59
（8）： 1524－1534．
刘敏，聂汉祥，杨巧玉，等 ． 哮喘小鼠肺间质巨噬细胞的表型
特征分析 ［J］． 武汉大学学报 ：医学版 ，2014，35 （3）：357－
361．
BEUTLER B． TLR4 as the mammalian endotoxin sensor ［J］．
Curr Top Microbiol Immunol， 2002， 270： 109－120．
周红光 ，陈海彬 ，吴勉华 ． 中国中西医结合杂志 ［J］． 2010，
30（8）：884－888．
冯玉环，石颜军，李春先 ． 中药的抗炎免疫抑制作用 ［J］． 实
用医学杂志，1996，12（11）：769－770．
刘丽娟 ，王允亮 ，许树青 ，等 ． 靛玉红 、色胺酮对 LPS 诱导
RAW264．7 炎症细胞模型的抗炎作用研究 ［J］． 世界中西医
结合杂志，2015，10（8）：1069－1072．
MATSUI T， ITO C， FURUKAWA H， et al． Lansiumamide B
and SB －204900 isolated from Clausena lansium inhibit
histamine and TNF－alpha release from RBL－2H3 cells ［J］．
Inflamm Res， 2013，62 （3）：333－341．
JIANG HY， WANG CF， FAN L， et al． Cytotoxic Constituents
from the Stems of Clausena lansium （Lour．） Skeels ［J］．
Molecules， 2013， 18（9）：10768－10775
（收稿：2015－09－19 编辑：王冰）
［1］
［2］
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本刊对上述这一类论文均作退稿处理。 在此提醒作者，如您所投的稿件与以前刊出的文章可能被认为是重复发表时要
加以说明，以便编辑正确判断与处理。
本刊编辑部
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