全 文 ：书桃根癌病菌拮抗放线菌抑菌活性物质的分离及其初步鉴定
季敬霖，刘志民，马焕普* (北京农学院植物科学技术学院，北京 102206)
摘要 ［目的］分离并初步鉴定从桃树高发根癌病土壤中获得的拮抗线菌 G19菌株的抑菌活性物质。［方法］采用蛋白沉淀法对拮抗放
线菌 G19菌株的抑菌活性物质进行粗提，利用高效液相色谱仪、中压制备色谱仪对其进行分离、纯化，应用 MALDI － TOFMS法进行分子
量的测定，最后通过化学显色反应进行相关官能团的验证。［结果］经分离纯化后拮抗放线菌 G19 的抑菌物质被抨击出 7 个肽段，是分
子量范围为 900 ～1 300 Da，同时推断其含有一个 Cys并携带 H2O，Na
+;官能团显色反应验证该物质为多肽且含有糖基。［结论］研究结
果为拮抗放线菌 G19菌株的抑菌物质结构的最终确定奠定了基础。
关键词 桃树根癌病;放线菌;抑菌肽
中图分类号 S436． 621． 1 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2011)15 －09013 －04
Isolation and Preliminary Identification of Antimicrobial Peptides Produced by Antagonistic Actinomycetes against Peach Crown Gall
(Agrobacterium tumefaciens)
JI Jing-lin et al (Department of Plant Science and Technology，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206)
Abstract ［Objective］The paper was to isolate and preliminarily identify the antimicrobial active substances of antagonistic actinomycetes
strain G19 obtained from the soil highly affected by peach crown gall (Agrobacterium tumefaciens)． ［Method］The antimicrobial substances of
antagonistic actinomycetes strain G19 were extracted using protein precipitation method，then isolated and purified using high performance liq-
uid chromatography and middle-pressure chromatography． Its molecular weight was determined by MALDI-TOFMS method，and the related
functional groups were verified through chemical color reaction． ［Result］ Seven peptide portions were produced from the antimicrobial sub-
stances of antagonistic actinomycetes strain G19 after isolation and purification with the molecular weights of 900 － 1 300 Da． It could be also
inferred that it contained Cys，and carried with H2O and Na
+ ． Color reaction of functional groups verified that the substance was polypeptide
containing glycosyl． ［Conclusion］The result provided basis for the final definition of the structure of antimicrobial substances in antagonistic
actinomycetes strain G19．
Key words Peach crown gall;Actinomycetes;Antimicrobial peptides
基金项目 北京市教委资助项目(KM200910020001) ;北京市自然科学
基金(5112010)。
作者简介 季敬霖(1986 －) ，女，安徽巢湖人，硕士研究生，研究方向:
果品品质生理与生态安全。* 通讯作者，教授，硕士生导
师，从事果品品质生理与生态安全研究工作。
收稿日期 2011-03-22
桃树根癌病是由特殊功能的根癌土壤杆菌(Agrobacteri-
um tumefaciens)以自然转基因引起的基因病害，是一种难以
防治的土传细菌病害［1 －2］。我国果树根癌病发生普遍，造成
的经济损失也很大。在北方地区约有 13个省市均有不同程
度的病发，辽宁、内蒙古、河北、山东、北京等地一些葡萄病害
较严重，发病率为 30% ～ 100%，减产 30%，甚至毁园、
绝收［3］。
果树根癌病的发病诱因多种多样，除了土壤质地、温度、
根系伤口外，重茬也是一个重要诱因。从再植的土壤中种植
桃树，可导致多数植株发生根癌病。李仁芳等结合多年的生
产实践，认为在已使用 1 ～2年的育苗地进行再育苗，其根癌
病发生率明显增加，特别是桃树的根癌病发生率可高达 90%
以上［4］;刘嘉彬等在多年的生产实践中，发现前茬桃树的根
系在多年的生长发育中，分泌大量的代谢物质，如扁桃苷，经
土壤微生物的分解产生有毒物质，对新栽幼树根系产生毒害
作用，从而造成重茬病的发生［5］。后人证实土壤微生物分解
扁桃苷产生的有毒物质是氢氰酸(HCN) ，其对桃树的生长产
生毒害作用［6 －7］。
目前对根癌病最有效的防治措施是生物防治。1980 年
Kerr等［8］发现 K84菌株对桃树等核果类果树及其近源花卉
的根癌病具有良好防效。1998 年王慧敏［9］等发现 K84 可有
效地防治大樱桃根癌病。2004 年王关林等［10］发现WJK84-1
菌株及其产生的 P-2001 细菌素均对樱桃冠瘿瘤病原菌 C58
病原菌具有明显的抑制作用。李金云等［11］研究发现葡萄土
壤杆菌 E26产生的土壤杆菌素不仅对葡萄根癌病菌 K308具
有明显的抑制作用，而且对茄科青枯病菌、番茄疮痂病菌、水
稻白叶枯病菌、棉花细菌性角斑病菌和白菜软腐病菌也有一
定的抑制作用。Hammami 等采用(NH4)2SO4 沉淀法从枯草
芽孢杆菌 14B 中提取的抑菌肽可抑制根癌病［11］。然而，此
类生防菌能否存活于含有高毒物质(HCN)的土壤中尚不得
而知。笔者从桃高发根癌病的再植土中筛出了具有耐氰效
应的生防放线菌菌株 G19，该菌株的发酵液对桃根癌土壤杆
菌有良好的抑菌效果，且性质稳定，经 16S rRNA鉴定与链霉
菌属有 97%的相似性［13］。因而，在此基础上分离、鉴定该放
线菌菌株的抑菌物质意义重大。
1 材料与方法
1． 1 材料 致病菌株:桃根癌土壤菌(Agrobacterium tumefa-
ciens) ，购于中国农业大学;供试生防菌株:从桃高发根癌病
的土壤中分离出的具有抗氰效应的放线菌 G19。
1． 2 生防放线菌抑菌活性物质的粗提 采用硫酸铵沉淀
法。将放线菌菌株置在高氏液体培养基中，在 28 ℃下 180
r /min震荡培养 8 d，其发酵液离心(10 000 r /min，15 min) ，将
上清液用无菌滤膜过滤，然后加入(NH4)2SO4 至 60%饱和
度，静置 2 h，10 000 r /min离心 10 min，取沉淀于截流分子量
为 8 000 ～14 000 Da的透析袋中，0． 1 mol /L磷酸缓冲液(pH
值 7． 0)中透析过夜，低温离心(10 000 r /min，10 min) ，弃不
溶物，上清冷冻干燥即为抑菌活性物质粗提物。
1． 3 抑菌活性检测 在涂好根癌土壤杆菌的平板上，用灭
过菌的打孔器围绕平皿周围打孔，分别注入 100 μl放线菌原
发酵液、100 μl 放线菌上清液、100 μl(NH4)2SO4 沉淀后的上
清液、100 μl粗提物、100 μl无菌水，以磷酸缓冲液做对照，28
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2011，39(15):9013 － 9016 责任编辑 高晓余 责任校对 况玲玲
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2011.15.175
℃恒温培养 12 h，观察抑菌圈直径大小。
1． 4 生防放线菌抑菌活性物质的纯化 抑菌活性物质粗
提物分别经过高效液相色谱和制备色谱分离纯化。样品经
0． 22 μm微孔滤膜过滤，流动相均为乙腈∶水 = 3∶7(V∶V) ;268
nm 紫外检测，柱温 25 ℃。高效液相色谱的色谱柱为 zor-
boxXDB-C18(4． 6 mm × 150 mm，5 μm) ，流速为 1． 0 ml /min，
进样量为 10 μl;制备色谱质谱柱为 zorboxXDB-C18(4． 6 mm
×250 mm，20 μm) ，流速为 10 ml /min，进样量为 200 μl。经
制备色谱后，收集冷冻干燥后的粉状样品备用。
1． 5 生防放线菌抑菌活性物质的鉴定
1． 5． 1 生防放线菌抑菌活性物质分子量的确定。取适量样
品用少量基质［乙腈∶水 =3∶7 (V∶V) ］溶解，取 0． 5 μl该水溶
物于 MALDI (matrix-assisted laser desorption ionisation)目标
板上，等风干后进行 MS/MS检测。得到该样品的分子量后，
在 CNBI数据库中进行 Blast比对。
1． 5． 2 生防放线菌抑菌活性物质相关官能团的确定。
1． 5． 2． 1 氨基酸、蛋白质性质确定。称取 0． 1 g样品粉末，
用水溶解配成质量分数为 1%为测试样品。取 1 ml 该测试
样品于试管中，加入 1%茚三酮 2 ～3滴，沸水中 10 ～ 15 min，
观察颜色变化。分别以 0． 1%牛血清蛋白和无菌水作对照。
1． 5． 2． 2 糖类性质确定。按“1． 5． 2． 1”中方法制备测试样
品，在 1 ml测试样品中加入莫里许试剂(2． 5 g α-萘酚于 50
ml乙醇中，用乙醇稀释至 100 ml)2滴。混匀后将试管倾斜，
沿管壁徐徐注入浓 H2SO4 约 1 ml。分层后，静置，观察颜色
变化。分别以 0． 1%葡萄糖和无菌水作对照。
1． 5． 2． 3 酚类性质确定。按“1． 5． 2． 1”中方法制备测试样
品，在 0． 5 ml测试样品中加入 1% FeCl3 溶液 2 ～ 3 滴，观察
颜色变化。分别以 0． 1%水杨酸和无菌水作对照。
2 结果与分析
2． 1 抑菌活性物质的提取、纯化及活性测定 抑菌活性物
质粗提物进行高效液相色谱分析时，在保留时间为 1． 244
min时出现 1个主峰，保留时间为 1． 625、2． 069 min时，出现
2个极小的峰(图 1-A) ;制备色谱中，1． 244 min出现的主峰
呈现出 1个单峰，对其进行收集(图 1-B)。抑菌物质的活性
测定结果表明，G19原发酵液(图 2-A)、放线菌上清液(图 2-
B)、粗提物(图 2-C)及(NH4)2SO4 沉淀后上清液(图 2-E)对
根癌土壤杆菌均有一定的抑制作用;而 PBS缓冲液(图 2-D)
及无菌水(图 2-F)没有抑制作用。
注:A为 268 nm高效液相色谱图，流速 1． 0 ml /min;B为流速为 10 ml /min时，其他条件相同下，主峰的中压制备色谱图。
Note:A represents high performance liquid chromatogram at 268 nm with flow speed of 1． 0 ml /min;B represents the chromatogram with main maximum
in the middle when flow speed is 10 ml /min and the other conditions are the same．
图 1 放线菌 G19菌株抑菌活性物质的色谱图
Fig． 1 Chromatogram of antimicrobial substances of actinomycetes strain G19
注:A为 G19原发酵液，B 为上清液，C 为粗提物，D 为 PBS 缓冲
液，E为 60%硫酸铵沉淀后上清液，F为灭菌水。
Note:A． original fermentation broth of G19;B． supernatant;C． crude
extract;D． PBS buffer;E． supernatant after precipitation of 60%
ammonium sulfate;F． sterile water．
图 2 放线菌 G19菌株的抑菌活性测定
Fig． 2 Antimicrobial activity determination of actinomycetes
strain G19
2． 2 生防放线菌抑菌活性物质的鉴定
2． 2． 1 生防放线菌抑菌活性物质分子量的确定。制备色谱
纯化的样品经 MALDI-TOFMS 激光抨击测定其分子量。如
图 3所示，共 7个肽段，分子量范围为 900 ～1 300 Da，其中分
图 3 放线菌 G19菌株MALDI-TOFMS质量纹图谱
Fig． 3 MALDI-TOFMS chromatogram of actinomycetes strain
G19
4109 安徽农业科学 2011 年
子量为 1 078． 5、1 096． 5、1 118． 5 Da 为主要部分。
1 078． 5 Da 与 1 096． 5 Da 间相差 18 Da，应该间隔为
H2O;1 096． 5 Da和 1 118． 5 Da 应该相差 Na
+，因为 MS/MS
间存在 + 1 的差异。同理 1 037 Da 和 1 199 Da 间相差 162
Da，推断之间存在 1 个葡萄糖残基，1 096 Da 和 1 199 Da 间
相差 103 Da，表明其可能结合 1个 Cys。Blast比对结果显示
其分值较低，数据库里没有匹配的氨基酸序列。
2． 2． 2 生防放线菌抑菌活性物质的相关官能团的确定。如
图 4所示，抑菌活性物质与茚三酮反应呈阳性，可知其含有
蛋白质，多肽或氨基酸类结构;且与 α-萘酚反应也呈阳性，表
明其分子结构中含有糖类基团(图 5) ;但在与 1% FeCl3 反应
中呈现阴性，说明其分子结构中不含酚类基团(图 6)。
注:A．牛血清蛋白;B．纯化的抑菌肽;C．灭菌水。
Note:A． Bovine serum albumin;B． Purified antimicrobial peptide;C．
Sterile water．
图 4 抑菌肽与茚三酮反应
Fig． 4 Reaction between antimicrobial peptide and ninhydrin
注:A．灭菌水;B．纯化的抑菌肽;C．葡萄糖。
Note:A． Sterile water;B． Purified antimicrobial peptide;C． Glucose．
图 5 抑菌肽与 α-萘酚反应
Fig． 5 Reaction between antimicrobial peptide and α-naphhthol
3 讨论
在植物病害生物防治中生防菌为链霉菌属(Streptomy-
ces)及其相关类群的研究较多。张永春从土壤中分离得到的
放线菌菌种 A4 和 A24 对烟草黑胫病具有较好的防效［14］。
胡俊等从向日葵菌核病土壤中分离纯化出 8 株对向日葵核
盘菌具有拮抗作用的放线菌菌株［15］。陈洁从土壤中分离纯
化得到的放线菌 K5对棉花枯萎病菌具有很强的拮抗作用，
对水稻稻瘟病菌也有一定的抑制作用［16］。张璐等的研究表
明，放线菌 SG-126防治黄瓜枯萎病的效果为42． 86%［17］。涂
注:A．灭菌水;B．纯化的抑菌肽;C．水杨酸。
Note:A． Sterile water;B． Purified antimicrobial peptide;C． Salecyl-
ic acid．
图 6 抑菌肽与三氯化铁反应
Fig． 6 Reaction between antimicrobial peptide and ferric chlo-
ride
璇等研究发现，在盆栽条件下 0108 和 0110 拮抗放线菌都能
通过影响辣椒根系微生物数量控制辣椒疫霉菌，且对辣椒根
系生长有显著促进作用［18］。原犇犇等筛选出的 8 株放线菌
对杨树腐烂病原菌(Valsa sordida)有较强拮抗作用［19］。姚敏
等通过对峙试验筛选出 26株对番茄叶霉病菌和番茄早疫病
菌、番茹灰霉病菌有拮抗作用的内生放线菌菌株［20］。展丽
然等从土壤中筛选的放线菌菌株 Z-6、Z-8、Z-23、Z-42 和 5-1
对苹果轮纹病菌具有一定的拮抗作用［21］。刘洪亮等从土壤
样品分离得到的 6 株生防放线菌菌株对玉米丝黑穗病有拮
抗作用［22］。李增波等从青藏高原的土壤样品中分离到 1 株
生防放线菌 AL-04，产生的抑菌物质对多种植物病原真菌和
细菌有较强的抑制作用［23］。汪倬等从济南地区 10多种作物
田采集的 20份土样中，筛选出 3 个对黄瓜灰霉病菌有明显
拮抗作用的放线菌菌株［24］。
对于抑菌肽的提取，普遍采用硫酸铵沉淀法。韩冬梅等
用饱和度 30%的硫酸铵沉淀和超滤离心的方法从枯草芽孢
杆菌 BSn5发酵上清中分离纯化 Apn5蛋白［25］。张玉芬等用
饱和度 50%的硫酸铵沉淀法从番茄灰霉病拮抗菌 B26 中提
取了抑菌蛋白［26］。李永刚等分别用不同梯度的硫酸铵对芽
孢杆菌 L1发酵液进行抑菌蛋白提取，且抑菌蛋白对水稻稻
瘟病有抑菌作用的硫酸铵饱和度为 50% ～60%，而对水稻纹
枯病则在 60% ～70%［27］。
然而，对于抑菌蛋白的纯化方法，各有不同。张玉芬等
采用 DEAE-纤维素离子交换层析法［26］;韩冬梅等采用不同
分子截留量的透析袋进行纯化［25］;吕淑霞等对乳酸链球菌
素的纯化采用 Sephadex G-50 凝胶柱层析法，280 nm 检
测［28］。对于采用色谱柱的也有报道。邱宏端等采用 CM-
Sephadex C-50色谱柱对耐盐红螺菌拮抗物质进行纯化;醋酸
缓冲液洗脱，流速 0． 3 ml /min，紫外 280 nm检测［29］。陈贝等
应用 DEAE-650柱纯化抗真菌蛋白 MAP13，2 mmol /L的磷酸
缓冲液洗脱，流速 2． 0 ml /min，紫外 280 nm 检测进行纯
化［30］。笔者采用的正是硫酸铵沉淀法提取抑菌蛋白，是 zor-
boxXDB-C18色谱柱纯化，紫外 268 nm 检测，然后用中压制
备色谱进行纯化物的制备。
510939卷 15期 季敬霖等 桃根癌病菌拮抗放线菌抑菌活性物质的分离及其初步鉴定
4 结论
试验通过硫酸铵蛋白沉淀法得到拮抗放线菌 G19 的抑
菌物质粗提物，利用高效液相色谱仪及中压制备色谱仪进行
分离纯化，利用 MALDI-TOFMS、一系列化学反应确定其结构
性质。可判断拮抗放线菌 G19 的抑菌物质是一种分子量范
围为 900 ～1 300 Da的含有糖基的抑菌肽，同时推断其含有
一个 Cys并携带 H2O，Na
+，且其官能团显色反应亦验证该物
质为多肽且含有糖基。
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94 －96．
GB/T 7714 －2005 题 名
题名包括书名、刊名、报纸名、专利题名、科技报告名、标准文献名、学位论文名、析出的文献名等。题名按著录信息源所
载的内容著录。
(1)同一责任者的多个合订题名，著录前 3 个合订题名。对于不同责任者的多个合订题名，可以只著录第一个或处于显
要位置的合订题名。在参考文献中不著录并列题名。
示例 1:自己的园地;雨天的书(原题:自己的园地 雨天的书 周作人著)
示例 2:美国十二名人传略(原题:美国十二名人传略 Twelve Famous Americans)
(2)文献类型标志依据 GB /T 3469《文献类型与文献载体代码》著录;对于电子文献不仅要著录文献类型标志，而且要著
录文献载体标志。
(3)其他题名信息可根据文献外部特征的揭示情况决定取舍，包括副题名，说明题名文字，多卷书的分卷书名、卷次、册
次等。
示例 1:地壳运动假说:从大陆漂移到板块构造
示例 2:中国科学:D辑 地球科学
6109 安徽农业科学 2011 年