全 文 ： 2009, Vol. 30, No. 19 食品科学 ※生物工程190
亮菌漆酶的初步研究
凌庆枝 1 , 2，董丽辉 1，范三微 1，高莉莉 1，黄贝贝 1，袁怀波 2，魏兆军 2
(1.浙江医药高等专科学校，浙江 宁波 315100；2.合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009)
摘 要：对亮菌(Armillariella tabescens)固体发酵产生的漆酶进行研究，其粗酶液经过硫酸铵盐析、DEAE-cellulose
柱纯化，活力回收率为 42.3%，得到电泳纯的亮菌漆酶，SDS-PAGE法证实其分子量约为 55.6kD。实验表明，亮
菌漆酶最适反应温度为 50℃、最适反应 pH值为 4.0，催化ABTS的米氏常数为 0.018mmol/L，在 pH4.0～5.0的偏
酸性环境中，酶活力较高，活性较稳定。酸根阴离子和金属阳离子对酶活力都有不同程度的影响，其中 SO42 －、
Na+对亮菌漆酶的活力有促进作用，CO 32 －、Cu 2+、Mg 2+对酶的活力有抑制作用。
关键词：亮菌；漆酶；纯化；性质
Preliminary Study on Laccase from Armillariella tabescens
LING Qing-zhi1,2，DONG Li-hui1，FAN San-wei1，GAO Li-li1，HUANG Bei-bei1，YUAN Huai-bo2，WEI Zhao-jun2
(1. Zhejiang Pharmaceutical College, Ningbo 315100, China；
2. School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)
Abstract ：Laccase in Armillariella tabescens solid-state fermentation liquid was purified by ammonium sulfate salting-out and
DEAE-cellulose column chromatography with an overall activity recovery of 42.3%. Electrophoretically pure laccase was
obtained and its apparent molecular weight was approximately 55.6 kD, which was proved by SDS-PAGE analysis. The
optimum reaction temperature and pH for this enzyme were 50 ℃ and 4.0, respectively, and the Km value was 0.018 mmol/L with
2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) as a substrate. This enzyme maintained high and stable activity
at pH 4.0－5.0. Various acid radical ions and metal ions had different effects on laccase activity, which was revealed an enhancement
effect from SO42－ and Na+, and an inhibition effect from CO32－, Cu2+ and Mg2+.
Key words：Armillariella tabescens；laccase；purification；characteristics
中图分类号：Q936 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)19-0190-04
收稿日期：2009-07-05
基金项目：安徽省科技厅重点科研计划项目(07020303041)；浙江医药高等专科学校科研基金项目(ZPCSR2008001)
作者简介：凌庆枝(1963 －)，男，副教授，博士，主要从事生物技术制药和食品生物技术研究。
E-mail：lingqingzhi@sina.com
漆酶(laccase，EC1.10.3.2)是一种含铜离子的多酚氧
化酶。它最早在日本紫胶漆树的渗出液中发现，随后
在许多昆虫和各种真菌，甚至细菌中也发现。现将漆
酶按其来源主要分为漆树漆酶(rhus laccase)和真菌漆酶
(fungal laccase)。漆酶的作用底物比较广泛，不同漆酶
的作用范围也不尽相同，涉及的底物主要包括单酚、邻
苯二酚、对苯二酚、甲氧基酚、苯二胺等。近年来，
约有 20多种不同来源的漆酶得到纯化，并对其性质进行
了研究，越来越多的漆酶基因被克隆和表达，漆酶的
应用也取得一些突破性的成果和显著的成就，特别是在
多种有毒化合物的降解、纺织面料处理、纸浆的生物
漂白等多方面发挥着重要作用[1-3]。
亮菌(Arm il la r ie l l a tabesce ns )，学名假密环菌
[Armillariella tabescens(Scop.ex.Fr.) Sing]，属白蘑科蜜
环菌属，最早于 20世纪 60年代在江苏省丹徒县民间用
来治疗当地俗称的“膈食病”，近年的研究证明亮菌
具有抗辐射、抗乙肝病毒等作用，可治疗肝炎、胆囊
炎、胃炎、新生儿高胆红素血症等[ 4 -8 ]。亮菌主产于安
徽、江苏、浙江等地，是重要的药用真菌。本实验
用固体发酵法产生亮菌漆酶，对亮菌漆酶进行分离纯
化，并对其性质进行初步研究，以期为亮菌漆酶的开
发应用提供一定的参考依据。
1 材料与方法
1.1 菌种
亮菌(Armillariella tabescens) 中国科学院中国普通
191※生物工程 食品科学 2009, Vol. 30, No. 19
微生物保藏中心。
1.2 试剂
ABTS[2,2-连氮 -双(3-乙基苯并噻唑咯啉 -6-磺酸)]
美国 Sigma公司；DEAE-纤维素 英国Whatman公司；
低分子量标准蛋白 美国GE公司；其他试剂均为国产
分析纯。
1.3 仪器与设备
TU-1810紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有
限公司；Mini-protean3垂直电泳仪、Bio-rad 凝胶成像
分析系统 Bio-rad公司；Biofuge Stratos冷冻离心机 德
国贺利氏公司；BT1-100恒流泵、SBS-100-LCD数控自
动收集器、HD-21-88紫外检测仪 上海琪特分析仪器公
司；PHS-3C型 pH计 上海精科仪器有限公司；BCM-
1000型生物净化工作台 苏州净化设备有限公司；SPX
智能型生化培养箱 宁波江南仪器厂。
1.4 培养基[9-11]
马铃薯综合培养基：葡萄糖 2%、MgSO 4·7H 2O
0.15%、KH 2PO4 0.3%、VB 1微量、琼脂粉 1.8%、土
豆汁 2 0%；种子培养基：葡萄糖 2%、蛋白胨 1 . 5%、
KH2PO4 0.5%、MgSO4·7H2O 0.1%、(NH4)2SO4 0.5%、
玉米粉 2%；固体发酵培养基：葡萄糖 0.5%、(NH4)2SO4
0.25%、CuSO4 0.02%、VB1少量、玉米粉 15%、CaCl2
0.48%、KH2PO4 0.5%、MgSO4·7H2O 0.5%。
固态发酵培养：将斜面种子接入 100ml种子培养基
中，150r/min、27℃恒温振荡培养 3d，10%接种量接
入固体培养基中，2 7℃培养。
1.5 固体酶曲中漆酶活力测定
取亮菌固体培养基表面生长良好的亮菌，去培养基
后称取 1g 湿曲，研磨，加 99ml 蒸馏水，并迅速放置
4℃冰箱浸泡过夜，将浸泡液过滤得滤液即为粗酶液。
取3.0ml 0.5mmol/L的ABTS(2-连氮 -双 -3-乙基苯并
噻唑啉 -6-磺酸)作为反应底物，在 pH4.5的乙酸 -乙酸钠
缓冲体系中加入 1ml稀释的粗酶液，30℃反应 5min，于
波长 420nm处测定反应吸光度随时间的变化，取吸光度
变化的线性部分。每分钟消耗 1μmol ABTS底物所需的
酶量为一个酶活力单位，以 U /ml 表示。
1.6 亮菌漆酶的分离纯化
1.6.1 盐析
粗酶液用饱和度为 75 % 硫酸铵沉淀，4℃静置过
夜。10000r/min低温离心 10min，弃去上清，沉淀溶解
于 0.02mol/L磷酸钠(pH6.0)缓冲溶液中。
1.6.2 透析
将适量的酶液装入透析袋中，于磷酸钠(pH6.0)缓冲
溶液中透析 24h，每隔 6h 更换一次缓冲液。
1.6.3 DEAE-纤维素阴离子柱层析
将处理过的酶液上已平衡的DEAE-纤维素柱(1.5cm
× 3.0cm)：先用 4℃超纯净水浸泡 DEAE-纤维素 24h，
后用 0.02mol/L、pH6.0磷酸钠缓冲液 4℃下平衡DEAE-
纤维素柱 24h，接着用上述磷酸钠缓冲液洗脱几分钟，
再用 0～0.5mol/L NaCl与磷酸钠溶液进行梯度洗脱，洗
脱速度为 1ml/min，每 4min收集一管，测其 A280nm值并
计算酶活力，合并有活力的组分。
1.7 电泳
采用垂直型 SDS-PAGE凝胶电泳，分离胶 10%、浓
缩胶 4%的不连续体系，电极缓冲液为 pH8.3，配胶比
例按照文献[12]进行，并用凝胶成像系统进行分析。
1.8 亮菌漆酶性质研究
1.8.1 分子量测定
将样品及已知分子量的标准蛋白质进行 SDS-PAGE
电泳，然后以相对迁移率计算出亮菌漆酶的分子量[13]。
1.8.2 亮菌漆酶最适反应 pH值测定
将亮菌漆酶分别加到 pH3.0、3.5、4.0、4.5、5.0
的柠檬酸 -柠檬酸钠缓冲液中，在 30℃条件下测定漆酶
活力，以最高活力为 1 0 0 %，其他与之相比作图，得
酶最适反应 p H 值。
1.8.3 亮菌漆酶最适反应温度测定
亮菌漆酶在最适反应 pH值条件下，分别在不同温
度(20、30、40、50、55、60℃)下测定亮菌漆酶活力，
得出最适反应温度，以最高活力为 100%，其他与之相
比作图，得出亮菌漆酶的最适反应温度。
1.8.4 亮菌漆酶热稳定性测定
亮菌漆酶在不同温度(20、25、30、35、40、45、
50、55℃)保温 1h，在最适反应温度、pH 值下测试酶
活力，以保温前的酶活力为对照，计算相对活力，得
出亮菌漆酶的热稳定性。
1.8.5 亮菌漆酶 pH值稳定性测定
将漆酶分别加到 pH3.0、4.0、4.5、5.0、6.0的柠
檬酸 -柠檬酸钠缓冲液中浸泡 24h后，在 30℃反应条件
下测试酶活力，以浸泡前的酶活力为对照，计算相对
活力，得出漆酶的 p H 值稳定性。
1.8.6 阴离子对亮菌漆酶的影响
将亮菌漆酶分别加到 1mmol/L和 100mmol/L的
Na 2CO3、NaCl、Na 2SO4、NaNO3溶液中浸泡 24h后，
在 30℃、pH4.0反应条件下测试酶活力，以浸泡前的酶
活力为对照，计算相对活力，得出亮菌漆酶的阴离子
稳定性。
1.8.7 阳离子对亮菌漆酶的影响
将亮菌漆酶分别加到 1、100mmol /L 的 C uSO 4、
ZnSO4、MnSO4、MgSO4、Na2SO4溶液中浸泡 24h后，
2009, Vol. 30, No. 19 食品科学 ※生物工程192
在 30℃、pH4.0反应条件下测试酶活力，以浸泡前的酶
活力为对照，计算相对活力，得出亮菌漆酶的阳离子
稳定性。
1.8.8 亮菌漆酶米氏常数测定
在 pH4.0条件下，配制 5个不同的ABTS底物浓度
(0.03、0.04、0.05、0.07、0.1mmol/L)，30℃条件下反
应，测定漆酶反应初始速度，求出两者倒数，以[1/v ]
对[1/S]作图，按照双倒数法作图，得到斜率为 K m/v 的
直线，由此得到 K m 的值。
2 结果与分析
2.1 亮菌漆酶的分离纯化
固体发酵后提取的亮菌粗漆酶液，经硫酸铵盐析、
DEAE-纤维素柱层析后，活力回收率为 42.3%，见表 1。
该酶样品经 SDS-PAGE实验，根据已知分子量的标准蛋
白质的相对迁移率，计算出亮菌漆酶的分子量约为
55 .6kD，见图 1。
纯化步骤 酶活力(U/g) 活力回收率(%)
粗酶液 22180 100
盐析 18463 83.2
DEAE-纤维素柱 9400 42.3
表 1 亮菌漆酶的纯化与活力的关系
Table 1 Summary of purification procedures of laccase from
Armillariella tabescens solid-state fermentation liquid
图1 亮菌漆酶SDS-PAGE电泳图
Fig.1 SDS-PAGE pattern of laccase purified from Armillariella
tabescens solid-state fermentation liquid
97.0kD
样品 Marker
66.0kD
45.0kD
30.0kD
14.4kD
2.2 亮菌漆酶的最适反应 pH值
图2 pH值对亮菌漆酶活力的影响
Fig.2 Effects of pH value on laccase activity from Armillariella
tabescens
100
80
60
40
20
0
相
对
酶
活
力
(%
)
pH
2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5
本实验测定了亮菌漆酶与ABTS在不同的pH值缓冲
溶液中的酶活力，结果如图 2所示，实验表明亮菌漆酶
与ABTS的最适反应是 pH4.0，且在 pH3.0～5.0酸性环
境中活力较好。
2.3 亮菌漆酶的最适反应温度
图3 温度对亮菌漆酶活力的影响
Fig.3 Effects of temperature on laccase activity from Armillariella
tabescens
温度(℃)
10 20 30 40 50 60
100
80
60
40
20
0
相
对
酶
活
力
(%
)
亮菌漆酶与底物ABTS在不同温度下发生反应时的
相对活力如图 3所示，结果表明，亮菌漆酶在 50℃时，
酶活力最高，故最适反应温度为 50℃。当温度由 20℃
升至 50℃时，酶的相对活力从 83%左右持续升至 93%左
右；温度超过 50℃时，酶的活力下降速度较快，温度
60℃时酶活力只剩最高时的 40%。
2.4 亮菌漆酶的热稳定性
环境温度对酶的稳定性有较大影响，是引起酶失活
的原因之一。本实验研究了亮菌漆酶在不同温度下的热
稳定性，结果如表 2 所示。当温度在 30℃以下时，稳
定性较好，1h内至少能保持 84%的活性；当温度在 35～
45℃之间，1h后酶只能保持 50%左右的活性；当温度
高于 50℃时，1h 后几乎丧失全部活性。
温度(℃) 20 25 30 35 40 45 50 55
相对酶活力(%) 98.2 89.6 84.4 64.0 57.2 24.7 5.2 1.1
表2 亮菌漆酶的热稳定性(1h后)
Table 2 Theramal stability of laccase from Armillariella
tabescens (at different temperatures after 1h)
2.5 亮菌漆酶的 pH值稳定性
pH值 3.0 4.0 4.5 5.0 6.0
相对酶活力(%) 2.2 27.4 97.6 74.1 24.1
表3 亮菌漆酶在不同pH值溶液中的稳定性
Table 3 pH stability of laccase from Armillariella tabescens
环境 pH值对酶的稳定性有较大影响，也可能是引
起酶失活的主要原因。本实验将亮菌漆酶置于不同 pH
值环境下 2 4 h，结果如表 3 所示。实验表明，亮菌漆
193※生物工程 食品科学 2009, Vol. 30, No. 19
酶在 pH4.0～5.0酸性环境中较稳定，pH＜ 4.0或 pH＞
5 .0，对亮菌漆酶的稳定性影响均较大。
2.6 酸根阴离子对亮菌漆酶活力的影响
溶液中所含阴离子也可能是影响酶活力的因素。本
实验研究了不同浓度下的 4种阴离子对亮菌漆酶活力的
影响，结果如表 4 所示。实验表明，高浓度的酸根阴
离子对酶活力的影响较大，在这 4种阴离子中，SO 42 －
对酶活力影响最小，且低浓度对酶活力有增强作用。
CO32－对酶活力影响最大，100mmol/L的CO32－溶液可使
亮菌漆酶活力几乎完全丧失。
2.7 金属阳离子对亮菌漆酶活力的影响
酸根离子(mmol/L)
CO32－ NO3－ SO42－ Cl－
1 100 1 100 1 100 1 100
相对酶活力(%) 27 8 95 83 105 98 96 42
表4 酸根离子对亮菌漆酶活力的影响
Table 4 Effects of acid radical ions on laccase activity from
Armillariella tabescens
金属离子(mmol/L)
Cu2+ Na+ Zn2+ Mn2+ Mg2+
1 100 1 100 1 100 1 100 1 100
相对酶活力(%) 90 79 106 91 91 74 100 86 94 94
表5 不同金属离子对亮菌漆酶活力的影响
Table 5 Effects of metal ions on laccase activity from Armillariella
tabescens
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
l/
[V
]
(L
·
m
in
/m
m
ol
)
l/[s](mmol/L)
－60 －40 －20 0 20 40
图4 亮菌漆酶的动力学曲线
Fig.4 Iinewear-Durk plot for of laccase from Armillariella
tabescens
由表 4 可知，SO 4 2 －对亮菌漆酶活力的影响较小，
故本实验研究了不同阴离子硫酸盐(均含 SO42 －但金属阳
离子不同)对亮菌漆酶活力的影响，结果如表 5所示。实
验表明，高浓度的不同金属阳离子对酶活力的影响较大
(Mg2+除外)，在这 4种金属离子中，Cu2+对酶活力影响
最大，Na+对酶活力影响最小，且低浓度的 Na+对亮菌
漆酶活力有增强作用。
2.8 亮菌漆酶的米氏常数测定
的关系曲线，如图 4 所示，从而计算得到亮菌漆酶对
ABTS的Km值为 0.018mmol/L。
3 结 论
真菌漆酶是一种含多个铜原子的多酚氧化酶，催化
机理独特，底物广泛多样，参与真菌的木质素降解、
色素沉着、子实体和孢子的形成，甚至致病机制的形
成等生理过程，在生物制浆、印染废水脱色、洗涤剂、
绿色有机合成等工业领域具有巨大的应用潜力。近年
来，多种来源的真菌漆酶通过超滤、硫酸铵一步沉淀、
阴离子交换层析和凝胶过滤等常规分离方法进行了分离
和纯化，但未见有关亮菌漆酶的研究报道。本实验采用
硫酸铵盐析、DEAE-纤维素柱层析方法，对亮菌粗酶液
进行初步分离，得到的亮菌漆酶分子量约为 55.6kD。亮
菌漆酶与底物ABTS反应的最适 pH值为 4.0，最适反应
温度为 50℃，米氏常数为 0.018mmol/L；在亮菌漆酶的
稳定性研究实验中发现，当环境在 pH4.0～5.0的酸性范
围，酶活力较高，酶较稳定；当环境温度在 30℃以下
时，酶活力较高，酶较稳定。在阴、阳离子对亮菌
漆酶活力影响的实验中，发现 SO 42 －阴离子对其活力影
响最小，C O 3 2 －对其活力影响最大；C u 2 +、M g 2 +对亮
菌漆酶的活力有抑制作用；Na+对亮菌漆酶的活力有促
进作用。有关亮菌漆酶的性质及其应用，本课题组将
作进一步的研究。
参考文献：
[1] MIKOLASCH A, SCHAUER F. Fungal laccase as tools for the synthe-
sis of new hybrid molecules and biomaterials[J]. Appl Microbiol
Biotechnol, 2009, 82(4): 605-624.
[2] MAI C, MILSTEIN O, HUTTERMANN A. Fungal laccase grafts
acrylamide onto lignin in presence of peroxides[J]. Appl Microbiol
Biotechnol, 1999, 51(4): 527-531.
[3] JOLIVALT C, MADZAK C, BRAULT A, et al. Expression of laccase
Ⅲ b from the white-rot fungus Trametes versicolor in yeast Yarrowia
lipolytica for environmental applications[J]. Appl Microbiol Biotechnol,
2005, 66(4): 450-456.
[4] 沈业寿, 马金宝. 亮菌研究的现状与展望[J]. 安徽大学学报: 自然科
学版, 2007, 31(1): 82-86.
[5] 凌庆枝, 袁怀波, 王妮娜, 等. 亮菌固态和液体发酵多糖及其醒酒作
用研究[J]. 食品科学, 2008, 29(5): 324-326.
[6] 姜天俊, 闫慧颖, 范荣, 等. 亮菌口服液治疗急性黄疸型肝炎临床研
究[J]. 实用医学杂志, 2006, 22(7): 826-827.
[7] 黄炳贺, 姚冬生, 陈伟强, 等. 假密环菌杂多糖Y-HW组分在实验性
肝损伤中护肝作用的研究[J]. 实用医学杂志, 1998, 14(8): 602-603.
[8] 曾少娟, 刘曼玲, 王淑娥, 等. 亮菌口服液防治新生儿高胆红素血症
的临床观察[J]. 医学理论与实践, 2002, 15(6): 686-687.
[9] 徐勇, 朱均均, 叶汉玲, 等. 白构菌液体发酵合成漆酶的培养条件研
究[J]. 林产化工通讯, 2004, 38(3): 1-5.
[10] 陶君, 马爱民, 郭爱玲, 等. 灵芝漆酶活性的测定及其产漆酶条件的
优化[J]. 食品科学, 2008, 29(3): 310-313.
[11] 高恩丽, 张树江, 夏黎明. 云芝菌发酵产漆酶及其对靛蓝脱色的研
究[J]. 高校化学工程学报, 2007, 21(1): 111-115.
[12] 郭晓君. 蛋白质电泳实验技术[M]. 北京: 科学出版社, 2001: 128-140.
[13] 王重庆, 李云兰. 高级生物化学实验教程[M]. 北京: 北京大学出版
社, 2001: 42-53.
用 A B T S 作为亮菌漆酶反应底物，在 3 0℃、
pH4.0条件下取不同浓度的 ABTS(0.03、0.04、0.05、
0.07、0.1mmol/L)，测定其反应速度 v，得到 1/[v]与 /l/[s]