全 文 ：第 30 卷 第 1 期
2013 年 3 月
广东工业大学学报
Journal of Guangdong University of Technology
Vol． 30 No． 1
March 2013
收稿日期:2012-09-03
基金项目:广东省千百十人才项目;东莞瀚森生物药业企业项目
作者简介:何带桂(1986-) ，女，硕士研究生，主要研究方向为天然药物化学．
doi:10． 3969 / j． issn． 1007-7162． 2013． 01． 023
血桐叶水提物对人结肠癌 LoVo细胞的
增殖抑制作用
何带桂，温俊林，王华倩，张 磊，赵肃清
(广东工业大学 轻工化工学院，广东 广州 510006)
摘要:水煮浸提血桐叶，减压浓缩后冻干制成粗体样品;以MTT、生长曲线法、集落形成实验考察血桐叶提取物对人
结肠癌 LoVo细胞的增殖抑制作用，并且以倒置显微镜观察其对细胞形态影响． 实验结果表明，血桐叶水提物对
LoVo细胞的增殖有显著抑制作用，呈明显剂量依赖关系，并且对细胞的形态有改变作用．
关键词:血桐;提取物;人结肠癌 LoVo细胞株;抗肿瘤
中图分类号:Q946． 91 文献标志码:A 文章编号:1007-7162(2013)01-0120-05
Inhibitory Effects of Aqueous Extract from Macaranga Ttanarius
Leaves in Human Colon Cell Line LoVo
He Dai-gui，Wen Jun-lin，Wang Hua-qian，Zhang Lei，Zhao Su-qing
(School of Chemical Engineering and Light Industry，Guangdong University of Technology，Guangzhou 510006，China)
Abstract:Aqueous extracts of Macaranga tanarius leave was obtained through water boiling，reduced-
pressure concentrating and freeze-drying． Based on MTT，growth curve and colony formation，it studied
the inhibiting effects of the aqueous extracts on colon cancer LoVo cell． Besides morphological changes of
the cells were observed under an inverted microscope． The results show that the inhiboting effects of the
aqueous extracts on LoVo cells are obvious，the effects depend on the dose，and that the aqueous extract
can bring about morphological chang of the cell．
Key words:Macaranga tanarius;extractive;human colon cancer LoVo cells;antitumor
血桐(Macaranga tanarius)为大戟科 Euphorbi-
aceae血桐属 Macaranga thou植物［1］，在我国主要分
布于广东、海南、台湾、福建等热带及亚热带地区．根
据《中华本草》记载，血桐具有治疗恶性肿瘤，神经
系统及心血管系统等疾病的作用．据文献报道，从该
属植物中也发现了有抗癌活性的物质和活性先导
物［2-3］，民间也有使用血桐叶煮水喝来治疗结肠癌的
用法，应用现代药理方法对其进行抗肿瘤活性筛选
很有必要．本文在文献和民间应用的基础上，研究血
桐水提物对结肠癌 LoVo 细胞形态和增殖活性的影
响，为其进一步研究开发打下基础［4-6］．
1 仪器和材料
1． 1 仪器
二氧化碳培养箱(美国 SHELLAB) ;BDS200 倒
置生物显微镜(重庆奥特光学仪器有限责任公司) ;
96 孔细胞培养板(Corning Incorporated) ;RT-2100C
型酶标分析仪(深圳雷杜生生命科学股份有限公
司) ;WB-2000 旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公
司) ;LGJ-12 冷冻干燥机(北京松原华兴科技发展有
限公司)．
1． 2 细胞株
人结肠癌 LoVo 细胞株购自中山大学实验动物
中心，以含有 10%胎牛血清的 DMEM培养液进行常
规培养．
1． 3 材料与试剂
血桐叶采自华南农业大学校园，并且经华南农
业大学林学院植物分类学专家鉴定证实为大戟科血
桐属植物，胎牛血清(FBS) (美国 Gibco 公司) ，
DMEM 培养液(Amresco 公司) ，0. 25% 胰蛋白酶
(Sigma公司) ，氟尿嘧啶(上海三维制药有限公司) ，
MTT(Sigma公司) ，二甲基亚砜(上海生工生物工程
有限公司)．
2 实验方法
2． 1 血桐提取和配制
将新鲜血桐叶自然晾干至恒重，粉碎后过 20 目
筛．称取 50 g血桐粉末，加入 400 mL的蒸馏水加热
煮沸 2 h，重复 3 次．以 4 重纱布过滤提取液，减压浓
缩得到浸膏，真空冷冻干燥后得血桐粗品．用 DMSO
溶解配制成 100 mg /mL 的样品母液，以含有 10%
FBS 的 DMEM 培养液稀释成 0. 5、0. 25、0. 125、
0. 062 5 和 0. 031 25 mg /mL 5 个不同质量浓度，经
0. 22 μm微孔滤膜过滤，4 ℃保存备用．
2． 2 细胞形态观察
LoVo细胞培养至对数生长期，用 PBS缓冲液荡
洗 1 ～ 2 次，加入 0. 25%胰蛋白酶液消化 2 ～ 3 min;
用含血清培养液终止消化，离心，弃上清，加入
DMEM培养液适量，混匀，将细胞以 1 × 105 个 /mL
密度接种于 96 孔细胞培养板，常规培养 24 h，弃原
培养液，加入 PBS缓冲液 100 μL，弃液，各组如下加
入内容物:空白对照组加入 200 μL DMEM 培养液;
阳性对照组加入 200 μL 氟胞嘧啶(5-Fu)终质量浓
度为 50 μmol /L的含血清培养液;受试药物组分别
加入 200 μL 血桐水提物终质量浓度为 0. 5、0. 25、
0. 125、0. 062 5和 0. 031 25 mg /mL 的含血清培养
液，常规培育 3 h，弃液，用 PBS 缓冲液洗 2 次，加入
含 10% FBS 的 DMEM 培养液继续培养，24 h 后观
察细胞形态并拍照［7］．
2． 3 MTT检测
将 LoVo细胞调制成浓度为 4 × 104 个 /mL的细
胞悬液，以 200 μL /孔种植于 96 孔板，每组平行复
种 6 孔，板边缘加入无菌 PBS 缓冲液，第二列作为
空白孔调零(只加培养液不加细胞，其他操作全部
平行操作) ，常规培养． 约 24 h 时换液，空白对照组
用含有 FBS的 DMEM培养液交换，阳性对照组用氟
尿嘧啶终质量浓度为 50 μmol / L 的含血清培养液
交换，受试物组分别用血桐水提物终质量浓度为
0. 5、0. 25、0. 125、0. 0625 和 0. 031 25 mg /mL的含血
清培养液交换，置于培养箱中继续培养． 48 h后每孔
加 20 μL MTT溶液(终质量浓度为 5 mg /mL) ，继续
培养 4 h，弃上清液，每孔加入 200 μL 二甲基亚砜，
慢速振荡 10 min，使紫色结晶物充分溶解，用酶标仪
在检测波长 492 nm、参考波长 570 nm 处测定 OD
值［8-10］．根据测得的吸光度值计算细胞的生长抑制
率，按下列公式计算生长抑制率:
抑制率 =［(A对照组 － A药物组)/A对照组］× 100% ．
2． 4 细胞生长曲线法测定
取对数生长的 LoVo细胞，用培养液稀释至 5 ×
104 个 /mL，分别接种于 7 块 96 孔板，100 μl /孔，放
入 5% CO2、37 ℃培养箱中孵育 24 h 后，各实验组
和空白组分别加入等体积的不同剂量药物(0. 5、
0. 25、0. 125、0. 062 5、0. 031 25 mg /mL)和 DMEM培
养液，实验组、空白组及阳性对照组均平行 6 孔． 继
续培养 24、48、72、96、120、144、168 h 后，分别取出 1
板，加入 20 μL MTT，温育 4 h 后，弃去培养基，加入
150 μL DMSO，振荡 10 min后在酶标仪上于 492 nm
读板测各孔的吸光值．以培养时间为横轴，细胞抑制
率为纵轴，绘出细胞的生长曲线［11-12］．
2． 5 集落形成法
将细胞悬液(200 个 /孔) ，接种于 6 孔板中，3
个为一组，培养 24 h 后，实验组分别加入最终质量
浓度为 0. 5、0. 25、0. 125、0. 062 5、0. 031 25 mg /mL
血桐水提物的培养液 2 mL，阳性对照组加入等浓度
为 50 μmol /L的氟尿嘧啶，对照组加入等体积培养
液，置 5% CO2、37 ℃培养箱培养 7 d 后，弃去固定
液，PBS清洗二次，纯甲醇 4 mL固定 15 min．弃去固
定液，加适量 Giemsa 染液染色 30 min，流水缓慢洗
去染色染液，空气中干燥． 在显微镜下观察计数含
50 个细胞以上的细胞集落数［13-14］．按下列公式计算
生长抑制率:
集落抑制率 =(1 －给药组集落数 /对照组集落
数)× 100%［15］．
2． 6 统计学分析
所有数据以平均值 ±标准差(珋x ± s)表示，使用 t
检验，P ＜ 0. 05 为显著性差异，P ＜ 0. 01 为极显著性
121第 1 期 何带桂，等:血桐叶水提物对人结肠癌 LoVo细胞的增殖抑制作用
差异．
3 结果
3． 1 对 LoVo细胞形态的影响
显微镜下观察显示正常对照组细胞生长旺盛，
形状呈梭形、三角形，胞体大，呈高折光率(见图
1a) ;给药剂量组(0. 5 ～ 0. 062 5 mg /mL)及阳性对
照组细胞的突起减少或消失，细胞肿胀变圆，折光率
下降，部分细胞裂解成碎片，且随着药物剂量增加，
细胞形态改变愈明显(见图 1)．
a:正常细胞;b:阳性对照;c ～ f:不同质量浓度血桐水提物(0. 5、0. 25、0. 125、0. 062 5 mg /mL)
图 1 血桐水提物对人结肠癌细胞形态影响
Fig． 1 Effects of aqueous extract from Macaranga tanarius on the morphology of colon cancer cells
3． 2 对 LoVo细胞增殖的抑制作用
与空白对照组比较，血桐水提物药物组及阳性
对照组细胞增殖活力均显著下降(P ＜ 0. 01) ，且随
着药物质量浓度增加，细胞生长抑制率也增加，呈现
明显的剂量依赖关系，结果见表 1．
表 1 血桐水提物对 LoVo细胞活力的影响
Tab． 1 Effects of Macaranga extract on the
vitality of LoVo Cells (n = 6)
组别 剂量 OD570 抑制率 /%
空白对照组 － 0． 741 ± 0． 065 －
药物组 0． 5 mg /mL 0． 348 ± 0． 0791) 38． 7
药物组 0． 25 mg /mL 0． 438 ± 0． 1081) 26． 5
药物组 0． 125 mg /mL 0． 546 ± 0． 0701) 15． 6
药物组 0． 062 5 mg /mL 0． 625 ± 0． 0701) 12． 0
药物组 0． 031 25 mg /mL 0． 705 ± 0． 078 4． 7
氟尿嘧啶 50μmol /L 0． 326 ± 0． 0261) 59． 3
1)与空白对照组比较，其中 P ＜ 0. 01．
3． 3 对 LoVo细胞体外生长分化的抑制作用
LoVo细胞经血桐叶水提取物处理后，其增殖抑
制率不仅随提取物质量浓度的增加而且随作用时间
的延长而增加，呈现质量浓度、时间 －效应依赖关系
(见图 2)． 其中第 7 天时药物质量浓度组(0. 5、
0. 25、0. 125 mg /mL)的抑制率均大于 70% ．
图 2 血桐水提物对 LoVo细胞的增殖抑制作用
Fig． 2 Inhibition effects of aqueous extract from
Macaranga tanarius on LoVo cell proliferation
如图 3 所示，将不同质量浓度(0. 5、0. 25、
0. 125、0. 062 5、0. 031 25 mg /mL)的血桐叶水提物
与 LoVo 细胞作用 7 d 后，0. 5、0. 25、0. 125 mg /mL
的集落形成抑制率均达到 100%，0. 062 5、0. 031 25
mg /mL其集落形成抑制率分别为 97. 4%、76. 6% ．
结果表明血桐水提物具有细胞毒性依赖关系，水提
物可有效抑制体外培养的 LoVo细胞的生长分化．
221 广 东 工 业 大 学 学 报 第 30 卷
图 3 血桐水提物对 LoVo细胞集落形成的影响
Fig． 3 Effect of aqueous extracts from
Macaranga tanarius on colony formation of LoVo cells
4 讨论
结直肠癌是一种人类高发恶性肿瘤，其发病率
一直呈上升趋势，严重威胁人类的生命与健康，从天
然产物中寻找有效药物很有价值．本研究结果显示，
血桐叶水提物对人结肠癌 LoVo 细胞体外增殖有抑
制作用，而且呈现时间、剂量依赖关系，初步认为血
桐叶有一定的抗肿瘤活性，为进一步研究其抗肿瘤
作用打下了基础．
用 MTT法对中草药有效成分的初步筛选，操作
简便、敏感，可重复性好，但由于生成的甲瓒产物不
溶于水，需溶解后方可定量测定，常用的溶剂如二甲
基亚砜(DMSO)可与培养液中的 FBS 蛋白形成沉
淀，需要去培养基上清，这不仅使工作量增加，也会
对实验结果的准确性产生影响，另外，甲瓒受作用时
间的影响，样品较多时测定 OD值随时间而变，会增
加实验误差，为此，本实验增加了细胞集落形成法和
细胞生长曲线实验，几种实验方法的联合应用使实
验结果更可靠．
本实验只针对人结肠癌 LoVo 细胞株进行了体
外抗肿瘤活性初筛，并且水提物只能得其极性较强
部分活性成份，下一步研究计划进行多瘤株筛选，并
补充进行有机溶剂提取物的抗肿瘤试验，根据其抑
制率计算对各瘤株的半数抑制浓度(IC50) ，根据
IC50来判断其细胞毒性大小，以确定是否有继续研
究的价值，在此基础上，进一步进行整体动物抗肿瘤
试验，以确证其抗肿瘤活性．
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