全 文 ：第 24 期
收稿日期：2011－08－02
基金项目：武汉市科技攻关计划［2009］19 号
作者简介：吴仁锋（1973－），男，湖北天门人，高级农艺师，硕士，主要从事蔬菜病害诊断及综合防控研究，（电话）13260519039（电子信箱）
wuhanwurenfeng＠126．com。
豇豆是我国主要蔬菜作物之一， 其多季节、多
模式、多花色和短周期栽培成为农民增收的主导性
蔬菜。湖北常年种植面积 4万 hm2，武汉市豇豆种植
面积约 0．67 万 hm2，作为“豇豆之乡”的武汉市新洲
区双柳街，年种植约 0．4 万 hm2次。 但是生产中，常
因栽培管理不当或环境条件的影响，造成病害的流
行，特别是土传病害。豇豆根腐病（Cowpea root）［1］是
豇豆的一种典型的土传病害，随豇豆种植年数的增
加、面积的扩大、品种的变化等，已成为豇豆上发病
最重、危害最大、防治最困难的病害。 本研究从武汉
地区豇豆种植区采集并分离发病豇豆根腐病病菌，
并进行鉴定，为后续的研究提供基础材料和条件。
1 材料与方法
1．1 标本来源与病原菌的分离纯化
标样于 2009 年采自武汉市蔬菜科学研究所试
验基地。 病原真菌的分离方法参照方中达 ［2］的植病
研究方法有关介绍，选取新发病豇豆植株茎基部的
根颈作为分离材料，进行常规组织分离，经单孢纯
化、培养获得单孢菌株。
1．2 致病性测定
采用 Kochps 法将发病组织上分离到的病原菌
纯培养物（孢子）制成悬浮液（105～106个孢子 ／ mL）。
采用自然伤根浸孢子液接种植株。 取生长良好的无
豇豆根腐病病原分离鉴定及其核糖体 rDNA－ITS
序列分析
吴仁锋 1，杨绍丽 1，万 鹏 2，黄 薇 2
（1．武汉市蔬菜科学研究所，武汉 430065；2．湖北省农业科学院植保土肥研究所，武汉 430064）
摘要： 采用形态学及分子生物学的方法对采集自武汉的豇豆根腐病分离物进行形态学和分子生物学鉴
定。 结果表明，菌株 JGF 形态学上为茄腐皮镰孢菌；对 JGF 菌株的核糖体 RNA 基因内转录间隔区（rD-
NA－ITS）进行了 PCR 扩增和序列测定，并在 GenBank 中进行了 Blast 搜索和比对分析，根据 rDNA－ITS 序
列分析结果结合豇豆病株症状和病菌的形态学特征， 认为武汉地区豇豆根腐病的病原菌为茄腐皮镰孢
菌（Fusarium solani Schl．）
关键词：豇豆根腐病；形态学；分子鉴定；rDNA－ITS 分析；Fusarium solani Schl．
中图分类号：S436．43 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2011）24－5107-03
Pathogeny Isolation and Identification of Cowpea Root Rot Disease and Sequencing
of Ribosomal rDNA-ITS
WU Ren－feng1，YANG Shao－li1，WAN Peng2，HUANG Wei2
（1． Wuhan Institute of Vegetable Sciences， Wuhan 430065， China
2． Institute of Plant Protection and Soil Science， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， China）
Abstract： The fungal isolate JGF from cowpea root rot disease， which were collected from Wuhan， were studied morphologi-
cally and molecularly． The results showed that the isolate JGF were morphological Fusarium solani Schl． The rDNA－ITS genes
of isolate JGF were amplified and sequenced． Based on the Blast search and the alignment analysis in GenBank database
combined with morphological characters，the pathogen of cowpea root rot disease was identified as Fusarium solani Schl．
Key words： cowpea root rot disease； morphology； molecular identification； rDNA－ITS sequence analysis； Fusarium solani Schl
第 50卷第 24期
2011年 12月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 50 No.24
Dec．，2011
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2011.24.028
湖 北 农 业 科 学 2011 年
病豇豆苗，用无菌水将根颈部表面冲洗干净，然后
使根完全浸在孢子悬浮液中 30 min，接种后植株定
植于装有灭菌沙土的花盆中。 每个菌株接种 8 株
苗，3次重复，以无菌水为对照。 植株置于 25 ℃下光
照培养箱中，接种后每隔 1～2 d 观察 1 次。 发病后，
从病斑处再次分离病原菌，确认致病菌。
1．3 病原菌形态学鉴定
1．3．1 PDA 上的病菌形态特征观察 将供试菌株
接种到 PDA 培养基上，25 ℃恒温培养。 7 d 后观察
培养基上的菌落形态，制作玻片，光学显微镜下观
察分生孢子及分生孢子梗的形态特征，并测量分生
孢子的大小。
1．3．2 产孢表型观察 产孢表型的观察采用滤纸
片法。参照张天宇［3］的方法，取滤纸剪成比载玻片稍
小的长方形， 将中心挖一边长约 10 mm 的方孔，灭
菌后用无菌水润湿放于无菌载玻片上。 挑取少量活
化的菌丝块均匀涂于滤纸中央方孔的边缘，然后将
载玻片置于铺有湿润滤纸的灭菌培养皿中，25 ℃恒
温培养。 48 h后显微镜下观察产孢表型。
1．3．3 形态学鉴定依据 根据菌落形态、生长速度
和色素颜色，大型分生孢子的形状、顶细胞和基细
胞的特征，小型分生孢子的有无、形状和着生方式，
分生孢子梗的特征和瓶梗类型，厚垣孢子有无和着
生位置等特征，参照 Booth［4］的分类系统进行病原菌
种的鉴定。
1．4 病菌核糖体 RNA基因内转录间隔区 （rDNA－
ITS）序列比较
1．4．1 菌丝体的培养与收集 将斜面保存的菌株
接种在 PDA培养基上进行活化。将活化后的菌株移
接在铺有灭菌玻璃纸的 PDA 平板上（每皿约 30 mL
培养基），每皿均匀接种 2 个菌丝块，每菌株接 2～3
个平板。 于 25 ℃暗培养 4～6 d 后，用灭菌解剖刀刮
取菌丝，置于 4 ℃保存备用。
1．4．2 基因组 DNA 的提取 基因组 DNA 采用十
六烷基三甲基溴化铵（Cetrimonium Bromide，CTAB）
法提取和纯化［5］。将 300 mg菌丝体放入已灭菌的研
钵中，倒入适量液氮充分研磨，将菌丝粉末装入灭
菌的 1．5 mL 离心管中。 每一离心管中加入 600 μL
2×CTAB 提取缓冲液（0．7 mol ／ L NaCl， 100 mmol ／ L
Tris－HCl， pH 8．0， 20 mmol ／ L EDTA， 10 g ／ L PVP－
360， 20 g ／ L CTAB， 0．1％β－巯基乙醇），涡旋混匀，
65 ℃水浴锅中水浴 30 min，期间颠倒混匀 3 次。 每
管加入 600 μl 氯仿 ／异戊醇（体积比 24∶1）抽提液，
充分混匀后于 12 000 r ／ min离心 15 min。 吸取上清
液至干净离心管中，加等体积氯仿 ／异戊醇再抽提 1
次。 将上清液转入干净的离心管中，加 2 倍体积的
无水乙醇沉淀 20 min，16 000 r ／ min 离心 10 min，去
上清液，沉淀用 70％乙酸冲洗 2 次。 将离心管置于
37 ℃温箱中干燥后用 TE溶解沉淀，经 1％琼脂糖凝
胶电泳检测后－20 ℃冰箱保存备用。
1．4．3 ITS 扩增 用真核生物核糖体 DNA 通用引
物 ITS1 和 ITS4 进行 PCR 扩增［6］。 其序列为，ITS1：
5′ －TCCGTAGGTGAACCTGCGG －3′ ，ITS4：5′ －TC-
CTCCGCTTATTGATATGC－3′。
1．4．4 PCR 反应条件 PCR 反应体系总体积为 50
μL，反应液组分为：10×PCR Buffer 5 μL，25 mmol ／ L
MgCl2 4 μL，10mmol ／ L dNTP 2 μL，5 U ／μL Taq 酶
0．3 μL， 模板 DNA 10 ng， 引物 ITS1 和 ITS4（25
μmol ／ L）各 1 μL，用 ddH2O 使总体积达到 50 μL，在
PTC－100 PCR扩增仪上扩增。 扩增条件：95 ℃预变
性 4 min；94 ℃变性 1 min；54 ℃退火 1 min；72 ℃延
伸 1 min，共 35 个循环； 72 ℃延伸 10 min。 PCR 产
物委托南京金斯瑞生物公司进行纯化和测序。
1．4．5 ITS 序列分析 将测序所得的菌株的 DNA－
ITS 序列与 GenBank 中核酸数据库 （http： ／ ／ www．
ncbi．nlm．nih．gov ／ blast ／ ）中的 ITS 区相关序列进行同
源性比较。
2 结果与分析
2．1 病原菌的分离与培养
从田间采集的发病植株，切取病株茎基部的维
管束组织，按常规的组织分离法进行分离。 经组织
分离， 获得 1 个根腐病菌菌株 JGF。 进行单孢纯化
后，用于致病性测定。
2．2 致病性测定
接种初期植株不显症状，接种 15 d 左右见部分
植株萎蔫，拔出植株，发现其根部自根尖开始发生
褐色病变，由侧根延及主根，致整个根系坏死腐烂，
剖检病根，维管束呈红褐色，并可延及根颈部，对照
植株不发病（图 1）。
2．3 病原菌形态学鉴定
2．3．1 PDA 上的病菌形态特征观察 菌株 JGF 在
PDA 平板上培养，其菌落边缘白色絮状，生长快，底
奶油黄色。 菌丝浓密，质地松软，隆起。 大型分生孢
子较易产生，弯或直筒形，两端钝圆，较肿，多数为 3
隔，大小为 20．6～48．8 μm×2．5～4．0 μm；小型分生孢
子微弯，为卵形或椭圆形，0～1 个分隔，大小为 6．4～
10．3 μm×2．5～3．6 μm；厚垣孢子较易产生，顶生或间
生，单个球形或成对顶生，细胞壁粗糙（图 2）。
2．3．2 产孢表型观察 保湿培养 24 h 后在滤纸上
可以观察到滤纸孔边缘的薄层菌丝向中央生长。 培
养 48 h 后在显微镜下观察菌丝直径、产孢表型。 气
5108
第 24 期
对照根部 JGF 接种根部 JGF 接种盆栽
图 1 豇豆植株接种菌株 JGF 后的症状
A．菌落正面；B．菌落背面；C．小型分生孢子；D．大型分生孢子；E．厚垣孢子
图 2 根腐菌菌株 JGF 的形态
A B C D E
生菌丝有隔、无色、细长多分枝，产生 2 种孢子，即
大型分生孢子和小型分生孢子。 大型分生孢子纺锤
形至镰刀形， 多数为 3 隔， 大小为 20．6～48．8 μm×
2．5～4．0 μm；小型分生孢子梗发达而细长，分生孢子
0～1 个分隔，卵形至肾形，假头状着生，大小为 6．4～
10．3 μm×2．5～3．6 μm（图 3a，b，c）。 菌落生长 10 d左
右大量产生厚垣孢子，厚垣孢子顶生或间生，多数
单个，球形，直径 7～10 μm（图 3）。
2．3．3 病原形态学鉴定 通过对 JGF 菌株菌落形
态、色素颜色、分生孢子梗、大小分生孢子形态，厚
垣孢子形态等特征描述，参照 Booth 检索方法确定，
该豇豆根腐病病原为半知菌亚门茄腐皮镰孢菌
（Fusarium solani Schl．）。
2．4 rDNA－ITS 序列分析
豇豆根腐病菌 PCR 产物经 1％琼脂糖凝胶电
泳，获得一个约为 560 bp 的扩增条带，与期望值相
符。 PCR产物送南京金斯瑞生物公司进行序列测序
结果表明，目的片段由 566 个核苷酸组成，测序结
果与 GenBank 中的序列用 BLAST 软件进行同源性
分析。 rDNA－ITS 序列分析表明，所分离的病原菌与
GenBank 中已公布的 Fusarium solani （GenBank 登
录号为 GQ365154、AB470903、EF152426、AB369488、
AJ608989）相应片段完全一致，同源性为 100％，能
够比对上的碱基数目最多，E－value 值为最小值 0。
根据生物信息学同源性比对的结果，将该菌鉴定为
茄腐皮镰孢菌（Fusarium solani Schl．）。 此结果与形
态学鉴定结果一致。
3 小结与讨论
本研究在真菌鉴定上以形态学鉴定为基础，分
子鉴定为补充，rDNA－ITS 序列分析结果作为形态
学鉴定的辅助验证［7］。在病原菌鉴定中，主要根据病
菌在 PDA 和其他培养基上的菌落形态、色素、大型
分生孢子、小型分生孢子和厚垣孢子的形态特征以
及产孢表型参照 Booth 分类系统进行种级鉴定。 根
据孢子的形态和产孢表型将根腐病菌的菌株鉴定
为 Fusarium solani Schl．。 在形态学鉴定的基础上，
a、b、c．分生孢子梗及小型分生孢子；d、e、f．分生孢子梗及大型分
生孢子；g．厚垣孢子间生；h．厚垣孢子顶生；i．厚垣孢子单生或对生
图 3 滤纸片上培养 48 h 后菌株 JGF 的产孢表型
a b c
d e f
g h i
吴仁锋等：豇豆根腐病病原分离鉴定及其核糖体 rDNA-ITS 序列分析 5109
湖 北 农 业 科 学 2011 年
（责任编辑 陈 焰）
通过对病原菌 rDNA －ITS 区扩增所得序列与
GeneBank中的序列进行同源性比较。 结果表明，根
腐病菌株与 Fusarium solani Schl． 的同源性最高为
100％，进一步验证了形态学鉴定结果。
参考文献：
［1］ 吕佩珂，李明远，吴钜文． 中国蔬菜病虫原色图谱［M］． 北京：中
国农业出版社，1992．
［2］ 方中达． 植病研究法［M］．第三版．北京：中国农业出版社，1998．
［3］ 张天宇 ．中国真菌志（第十六卷）链格孢属［M］．北京：科学出版
社，2003．
［4］ BOOTH C． The Genus Fusarium［M］． London： Great Britain by
the Eastern Press Limited London and Reading，1971．
［5］ GRAHAM G C， MAYSER S P， HENRY R J． A simplified
method for the preparation of fungal genomic DNA for PCR
and RAPD analysis［J］． Biotechniques，1994，16：48－51．
［6］ 刘春来，文景芝，杨明秀，等 ．rDNA－ITS 在植物病原真菌分子检
测中的应用［J］．东北农业大学学报，2007，38（1）：101－106．
［7］ 孙广宇，彭友良，李振岐，等． 核苷酸序列分析在真菌系统学研
究中的应用［J］．西北农林科技大学学报（自然科学版），2003，31
（6）：187－191．
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收稿日期：2011-11-21
基金项目：湖北省农业科技创新中心资助项目（2007－620－003－03－02）
作者简介：武怀恒（1980－），男，河北邢台人，助理研究员，硕士，研究方向为棉花害虫综合治理，（电话）027－87380522（电子信箱）whhhb＠126．com；
通讯作者，黄民松，研究员，（电子信箱）zbshms＠126．com。
第 50卷第 24 期
2011年 12月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 50 No.24
Dec．，2011
四种农药对斜纹夜蛾幼虫的生物测定
武怀恒 1，黄民松 1，许 冬 1，丛胜波 1，姜干明 2
（1． 湖北省农业科学院植保土肥研究所 ／农作物重大病虫草害防控湖北省重点实验室，武汉 430064；
2． 黄冈市植物保护工作站，湖北 黄冈 438000）
摘要：采用点滴法和浸叶法对斜纹夜蛾（Spodoptera litura Fabricius）进行了毒力测定，并对其在田间进行
了药效测定。 结果表明，点滴法处理后 48 h，甲维盐的 LD50为 8．70 μg ／ g，毒死蜱的 LD50为 10．37 μg ／ g，虫
螨腈的 LD50为 13．16 μg ／ g，虫酰肼的 LD50为 64．26 μg ／ g。 浸叶法处理后 48 h，甲维盐的 LC50为 0．70 μg ／
mL，虫螨腈的 LC50为 1．52μg ／mL，虫酰肼的 LC50为 6．77μg ／mL，毒死蜱的 LC50为 36．41μg ／mL。 室外测
定的结果表明，甲维盐与虫螨腈的防效较高，药效持续时间较长。 由此可见，甲维盐和虫螨腈对斜纹夜蛾
的毒力相对较高。
关键词：斜纹夜蛾；农药；毒力；田间防效
中图分类号：S433.4；TQ450.2+6；TQ453.8 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2011）24－5110-03
Insecticidal Activity of Four Chemicals against Spodoptera litura
WU Huai－heng1，HUANG Min－song1，XU Dong1，CONG Sheng－bo1，JIANG Gan－ming2
（1． Institute of Plant Protection and Soil Science， Hubei Academy of Agricultural Sciences ／ Hubei Key Laboratory of Crop Diseases， Insect
Pests and Weeds Control， Wuhan 430064， China； 2． Huanggang City Station of Plant Protection， Huanggang 438000， Hubei， China）
Abstract： In order to screen out the pesticides for controlling Spodoptera litura Fabricius effectively， topical application
method， leaf－dipping method and outdoor determination method were used to test the toxicity of 4 pesticides on S． litura． The
results showed that the LD50 of the drop method was 8．70 μg/g for peacekeeping salt， 10．37 μg/g for chlorpyrifos， 13．16 μg/g
for chlorfenapyr， 64．26 μg/L for tebufenozide 48 h after treatment． The LC50 of the leaf－dipping method was 0．70 μg/mL for
peacekeeping salt， 1．52 μg/mL for chlorfenapyr， 6．77 μg/mL for tebufenozide， 36．41 μg/mL for chlorpyrifos 48 h after
treatment． The results of the outdoor measuring method showed that peacekeeping salt and chlorfenapyr had better control
effect and longer lasting time． Thus， the virulence of peacekeeping salt and chlorfenapyr against S． litura was relatively higher．
Key words： Spodoptera litura Fabricius； pesticide； virulence； field control effect