全 文 ：农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2009,17 (1): 159~163
*基金项目：国家自然科学基金项目（No.30640044和 No. 30871665）和北京市自然科学基金（No.6073028）资助。
**通讯作者。 Author for correspondence.教授，博士生导师，主要从事植物病害生物防治及植物微生态研究。E-mail: .
收稿日期：2008-04-09 接受日期：2008-05-12
·研究论文·
纳米 TiO2对黄瓜叶围细菌群落的影响 *
常立艳，王 琦 **，梅汝鸿
（中国农业大学植物病理学系，农业部植物病理学重点开放实验室，北京 100094）
摘要：利用可培养和变性梯度凝胶电泳(DGGE)方法，对经不同浓度 TiO2处理黄瓜(Cucumis sativus)叶围细菌群落结构的
变化进行了分析。研究发现，TiO2处理后黄瓜叶围可培养细菌数量较对照显著降低。随着 TiO2浓度从 0.02 mg/mL提高至 20
mg/mL，黄瓜叶围可培养细菌数量从 1.8×107 cfu/g降低至 3.1×106 cfu/g。DGGE指纹图谱分析表明，当 TiO2的喷雾浓度超过
0.02 mg/mL时，黄瓜叶围细菌的多样性显著降低。对 DGGE条带克隆测序结果显示，在黄瓜叶围至少存在 7种不同属的细菌，
其中只有一种叶围细菌不受 TiO2喷雾浓度影响。
关键词：纳米颗粒；叶围细菌；DGGE；16S rDNA；序列测定
中图分类号:S188 文献标识码:A 文章编号:1006-1304(2009)01-0159-05
Effect of Nano-TiO2 on the Bacterial Community of the Cucumber Phyllosphere
CHANG Li-yan, WANG Qi**, MEI Ru-hong
(Department of Plant Pathology, China Agricultural University, Beijing 100094, China)
Abstract: The impact of nanometer titanium dioxide(nano-TiO2) to the phyllosphere bacterial community were assessed using cul-
turable-depend and PCR-DGGE methods. Results showed that quantities of the culturable phyllosphere bacteria were reduced from
1.8×107 to 3.1×106 cfu/g with the increasing concentrations of the nano-TiO2 (from 0.002 to 20 mg/mL). The diversity of the phyllo-
sphere bacteria was also analyzed by PCR-DGGE. When the concentrations of the nano-TiO2 were higher than 0.02 mg/mL, the
DGGE bands was significantly lower than that of the control. Sequencing results of the bands from the DGGE gel showed that there
were at least 7 bacterial genera on the cucumber phyllosphere. But only one phyllosphere uncultured bacterium was not influenced by
the concentration of the nano-TiO2.
Key words: nano-TiO2; phyllosphere bacteria; DGGE; 16S rDNA; sequencing
在自然环境中的微生物活体特别是单细胞的
细菌，所处的非生物环境非常复杂。随着大气等环境
中纳米颗粒（超细颗粒物）的生物效应研究日渐深入
(赵宇亮等，2005)，已经发现纳米颗粒物对很多细菌
都具有抑制作用（Amézaga et al.，2003；陈惜燕等，
2005；Cho et al.，2005）。这样对于暴露在自然条件下
的细菌，适应这种较为苛刻的环境将是细菌生存的
一个重要考验。
随着材料科学的迅猛发展，纳米技术已经广泛
地应用到科研及生产实践的各个领域。纳米颗粒接
受光产生强电子，使得细胞产生过量自由基毒性，并
最终具有杀菌作用已经得到公认。空气及植物表面
等许多地方都存在纳米级颗粒，微生物在植物叶表
面存活，必须克服这种因素所产生的负面影响。2003
年以来，各个领域的科学家们积极探讨纳米材料与
纳米技术的生物环境效应问题，即纳米颗粒对人体
健 康 (Service，2003；Brumfiel，2003；Service，2004)、
生存环境 (Oberd觟rster，2004)、社会安全（Jia et a1.，
2005）等方面是否存在潜在的负面影响。
目前对纳米 TiO2(nanometer titanium dioxide)的
生物环境效应的研究数据很有限，研究结果也很初
步，主要集中在对动物实验诸如 DNA( Hirakawa et
al.，2004) 和细胞水平的毒性分析（Rahman et al.，
2002），而有关纳米颗粒对植物体影响的研究几乎没
农 业 生 物 技 术 学 报 2009 年
有。纳米 TiO2（P25, Degussa Co）是国际上作为测定
抑菌材料抑菌性能的一个标准样品 (Mills and Lee,
2002)，本研究借助纳米 TiO2研究其对黄瓜叶围微
生物的影响；并建立研究纳米颗粒对植株体表微生
物影响的方法体系。这不仅有利于揭示纳米颗粒的
生物环境效应，也为研究叶围微生物的可利用种群
与有益微生物的筛选提供了基础资料。
1 材料和方法
1.1 植物材料
农大裕农系列黄瓜（Cucumis sativa）品种秋棚 2
号，种植于中国农业大学上庄试验站的日光温室内，
生长至初花期时待用。
1.2 纳米材料
分别称取适量的 nanometer titanium dioxide
（nono-TiO2,P25, Degussa Co.德国），高压灭菌，保存
于暗处。使用前加入无菌磷酸缓冲液（0.1 mol/L，pH
7.0），超声波振荡 30 min。
1.3 样品处理
参照 Monier and Lindow (2005)，用美术喷笔
(Airbrush，HD-470，台湾)将不同浓度的纳米 TiO2悬
浮液（0、0.002、0.02、0.2、2和 20 mg/mL）以极细小的
雾粒（平均体积 750 μm3）喷施到叶围，即不蘸湿叶
围也避免了叶围微生物的空间移动。处理后的植株
在日光温室内自然光照射 5 h。
1.4 叶围细菌平板回收
每一处理取 3个重复，每一重复随机取 30 g上
数第 4片完全展开叶，将叶片分装在装有 50 mL无
菌缓冲液（0.1 mol/L 磷酸缓冲液，
0.1 % Bacto-peptone，pH 7.0）的 3个
灭菌袋内，放入车载冰箱运回实验
室。参照Monier and Lindow（2003），
超声波水浴震荡 7 min，充分洗脱叶
围微生物。叶围洗脱液梯度稀释后
涂布于 TAS平板上（TSA培养基：
1 000 mL中含 15 g trypton；5 g Soya
peptone；5 g NaCl；16 g 琼脂粉，pH
7.2～7.4），30℃培养 7～14 d，菌落
计数估计可培养叶围细菌的数量，
所得数据用 SAS 8.0 统计软件进行
处理。
1.5 叶围细菌总DNA的提取
将叶围洗脱液收集于 50 mL离
心管内，4 ℃，18 000 r/min 离心，15
min，收集沉淀。基因组的提取方法
参考 Sambrook and Russell（2001）。
1.6 基因组DNA PCR扩增及DGGE分析
选择对大多数细菌的 16S rDNA的 V3区能有
效扩增的引物进行 PCR，引物为 PRBA338f（GC）和
PRUN518r (覫vre覽s et al.，1997)。扩增后片段长度约
为 230 bp。变形梯度凝胶电泳 DGGE分析用仪器为
The DCodTM Universal Mutation System (Bio-Rad 公
司，美国)。DGGE参数：聚丙烯酰胺凝胶浓度 8%，胶
厚度 1.0 mm，变性剂梯度 30%～60% (100%变性剂
浓度为 7 mol/L 尿素和 40%去离子甲酰胺的混合
物)，点样量 25 μL已浓缩 PCR产物。电泳在 60℃，
1.0×TAE buffer，130 V电压下进行 7 h。电泳结束后
在 EB液中染色 10～15 min，用 Alphimager成像系
统拍照。利用 Quantity One分析软件（Bio-Rad公司，
美国）确定样品电泳条带的多少和条带亮度的峰值，
得到 DGGE图谱的聚类图。
1.7 测序分析
切取黄瓜叶围细菌群落结构的部分优势种群的
16S rDNA V3 区片段，PCR 产物的 DGGE 凝胶
DNA条带放在 20 μL无菌水中，4 ℃过夜将 DNA
扩散出来。以扩散出的 DNA为模板，用引物 PR-
BA338f和 PRUN518r (覫vre覽s et al.，1997)进行 PCR
扩增。将 PCR产物回收连接到载体 pEASY-T3上，
然后将连接产物转入到感受态细胞 TOP10中。将得
到的克隆产物提交到北京诺赛基因组研究中心有限
公司测序。所得到的序列与 NCBI数据库上的 DNA
基因库进行同源性比较，确定含有目标基因微生物
的类群。
图 1.不同浓度纳米 -TiO2对黄瓜叶围细菌群落的影响
Fig.1. Effect of different concentrations of nano-TiO2 on the bacterial community
of the cucumber phyllosphere
不同字母表示差异显著性（P<0.05）。
Different letters indicate significant difference (P < 0.05).
160
第 1期 常立艳等:纳米 TiO2对黄瓜叶围细菌群落的影响
凝胶的位置
Gel position
Band a
Band a
Band a
Band b
Band b
Band c
Band d
Band e
Band e
Band f
Band g
数据库配对
Database match (GenBank accession No.)
Pseudomonas sp. BSi20397 16S rRNA gene (EU330375.1)
Sphingomonas sp. ATCC 31555 16S rRNA gene (AF503280.1)
Providencia sp. SBS1 16S rRNA gene (EU195872.1)
uncultured Exiguobacterium sp. clone AV 4R-S-O05 16S r RNA gene(EU341181.1)
uncultured bacterium clone 2-3A 16S r RNA gene (EU289492.1)
Pseudomonas sp. m33 16S rRNA gene (EU375658.1)
uncultured Providencia sp. small subunit rRNA gene (DQ533898.1)
Pantoea sp. DAP18 16S rRNA gene (EU302843.1)
Pseudomonas sp. SYW1D 16S rRNA gene (EU293151.1)
uncultured bacterium clone 6224 16SrRNA gene (EU368385.1)
uncultured bacterium clone ARDRA0157 16SrRNA gene (EF050118.1)
GenBank登录号
GenBank accession No.
AB377180
AB377181
AB377182
AB377184
AB377185
AB377183
AB377188
AB377186
AB377187
AB377189
AB377190
序列相似性 /%
Sequence similarity
94
94
99
100
100
100
100
100
100
100
100
2 结果
2.1 纳米TiO2对黄瓜叶围细菌影响的平板回收
纳米 TiO2悬浮液以不同浓度喷施黄瓜叶片上，
在日光温室内自然光照射 5 h后，可培养叶围细菌
数量随着纳米 TiO2悬浮液浓度的增加而呈现逐渐
减少的趋势（图 1）。叶围可培养细菌数量从对照的
2.2×107cfu/g下降到了 3.1×106 cfu/g。与对照相比，所
有浓度的纳米 TiO2悬浮液喷雾处理后的黄瓜叶围
可培养细菌的总量都有显著性差异（P =0.05）。纳米
TiO2悬浮液浓度梯度增加时，除浓度从 0.2 mg/mL
增加到 2 mg/mL时可培养细菌的总量没有显著差
异外，浓度每增加 10倍可培养细菌的总量都显著减
少。说明纳米 TiO2悬浮液浓度越高对可培养细菌存
活能力的影响就越大。
2.2 纳米 TiO2影响下的黄瓜叶围细菌的 16S
rDNA的DGGE指纹图谱分析
日光温室内喷施不同浓度的纳米 TiO2悬浮液
于黄瓜叶面上，在自然光照射 5 h之后提取叶围细
菌的总 DNA，经过 16S rDNA的特异性引物扩增得
到长度相同而碱基序列不同的片段。当纳米 TiO2悬
浮液的浓度达到 20 mg/mL时没有扩增到叶围细菌
的 16S rDNA片段。通过 DGGE对 16S rDNA片段
进行分离。依据 DGGE的原理，它可以将长度相同
而碱基序列不同的片段分离开，电泳条带数越多说
明微生物多样性越丰富，条带信号越强说明微生物
数量越多。纳米 TiO2影响下的黄瓜叶围细菌的 16S
rDNA的 DGGE指纹图谱见图 2。从图 2中可以看
表1黄瓜叶围主要细菌的16SrDNADGGE条带比对
Table1 Blast results of predominant 16S rDNA DGGE bands obtained from the phyllosphere of cucumber leaves
图 2.不同浓度纳米 TiO2对黄瓜叶围细菌影响的 16S rDNA PCR-DGGE
Fig.2. PCR-DGGE 16S rDNA banding profiles of microorganisms from the cucumber phyllosphere
sprayed with different concentrations nano-TiO2
1 and 2, 0 mg/mL nano-TiO2; 3～5, 0.002 mg/mL nano-TiO2 ; 6～8, 0.02 mg/mL nano-TiO2;
9～11, 0.2 mg/mL nano-TiO2; 12～14, 2 mg/mL nano-TiO2 .
161
农 业 生 物 技 术 学 报 2009 年
参 考 文 献
Amézaga-Madrid P, Silveyra-Morales R, Córdoba-Fierro L,
Nevárez-Moorillón G V, Miki-Yoshida M, Orrantia-Borunda
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到纳米 TiO2悬浮液的浓度对叶围细菌的种群丰富
度影响是比较大的。当浓度达到 0.02 mg/mL后通过
DGGE能够检测到的条带数已经很少，只有 d、e、f
和 g这几条带能够被检测到，并且检测到的亮度是
不同的，仅条带 g的亮度没有发生变化。这表明叶围
细菌对高浓度纳米 TiO2悬浮液的耐受能力不同，只
有条带 g所代表的细菌群体能够耐受高浓度的纳米
TiO2，而大部分细菌不能够耐受或者耐受能力较弱。
2.3 不同浓度纳米TiO2影响下黄瓜叶围细菌优势
种群的测序分析
对 DGGE图谱中的部分特异条带进行了测序
分析（表 1）。结果显示：黄瓜叶围至少存在 7大类细
菌，其中有一种 uncultured bacterium未受纳米 TiO2
影响，而其它的一些种群都受到纳米 TiO2的影响，
如 Pseudomonas sp.、Providencia sp.、uncultured bac-
terium， 以 及 Sphingomonas sp.、uncultured Ex-
iguobacterium sp.、Proteobacterium sp.、uncultured
Providencia sp.、Pantoea sp.和 Exiguobacterium sp.。
3讨论
随着纳米材料的大量使用及其在环境中的释
放，极易受环境因素影响的叶围微生物的种群数量
及结构也可能会受到纳米颗粒的影响。本研究探索
了纳米 TiO2对黄瓜叶围细菌组成的影响，为纳米颗
粒生物环境效应的研究提供了有力补充，并对纳米
TiO2的应用提供指导。
本实验将不同浓度的纳米 TiO2悬浮液喷施于
黄瓜叶片表面，在日光照射 5 h后取样回收。平板回
收结果表明：黄瓜叶围可培养细菌的群体数量与对
照相比显著降低（P=0.05），并且表现出明显的浓度
效应，即随着纳米 TiO2浓度的增加叶围可培养细菌
的数量显著降低，此结果与纳米 TiO2对很多微生物
都具有杀菌作用的研究结果相吻合（叶盛英等，
2003；Cho et al.，2005；Amézaga et al.，2003）。目前对
细菌抵御纳米颗粒光催化杀菌作用的机制的研究较
少，本研究可以为微生物抵抗纳米颗粒光催化作用
机制的研究提供一些生物资源。
通过对黄瓜叶围细菌 PCR-DGGE分析显示，不
同的叶围细菌对不同浓度纳米 TiO2的敏感程度是
不同的。从 DGGE指纹图谱中观察到，当纳米 TiO2
悬浮液的喷雾浓度超过 0.02 mg/mL时，可以检测到
的 DGGE条带数即黄瓜叶围细菌的种类数已经很
少。说明大多数细菌对纳米颗粒的光催化杀菌作用
的抵抗能力是比较弱的，而少部分细菌对这种作用
具有较强的抵抗能力，这可能与细菌本身的结构特
征以及不同细菌抵御纳米颗粒的光催化杀菌作用的
机制有关。对 DGGE条带分别进行切胶回收，克隆
测序。测序结果显示，黄瓜叶围存在至少 7大类优势
种细菌，其中只有一种细菌（图 2，条带 g）表现出对
纳米 TiO2较强的抵抗力，而其他的细菌则受到纳米
TiO2不同程度的影响。这反映了不同细菌对纳米
TiO2氧化毒性的敏感程度是不同的。
在纳米科技出现以前，人类忽视了生活环境中
的纳米颗粒物对人体健康的影响。纳米颗粒物对人
类赖以生存的环境的影响，也需要进行深入研究。纳
米材料已经遍及生产生活每个角落，对纳米材料的
环境评价显得尤为重要。在农业上，随着纳米包膜肥
料、纳米土壤改良剂、二氧化钛光合作用促进剂等的
产业化，也会使越来越多的人们注意到这一问题，并
需要有相关的管理办法出台以规范纳米材料的使
用。在本研究的基础上，本实验室也将进一步确定导
致黄瓜叶围细菌组成变化的最小纳米 TiO2剂量，并
将回收到的耐受纳米 TiO2的叶围细菌进行分类鉴
定和有益微生物的筛选。
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第 1期 常立艳等:纳米 TiO2对黄瓜叶围细菌群落的影响
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