全 文 ：书·论著· 文章编号:1007 － 8738(2014)10 － 1095 － 04
相思子毒素磁性纳米颗粒免疫捕获法的建立
梁龙辉，刘石磊*，高 川，周世坤 (防化研究院，国民核生化灾害防护国家重点实验室，北京 102205

)
收稿日期:2014 － 01 － 17; 接受日期:2014 － 06 － 24
作者简介:梁龙辉( 1988 － ) ，男，甘肃兰州人，硕士研究生
Tel: 18660584460; E-mail: 13919985675@ 163． com
* Corresponding author，刘石磊，E-mail: liushilei402@ 263． net
［摘 要］ 目的 建立一种灵敏度高，特异性强的相思子毒素(abrin)检测方法。方法 使用包被 abrin 单克隆抗体(mAb)7D1
的 Fe3O4 磁性纳米颗粒(MNP)和辣根过氧化物酶标记的 abrin单克隆抗体(HＲP-mAb)，建立了 abrin的免疫捕获检测法。同时
将方法结果和传统双抗体夹心 ELISA进行系统比较。结果 本方法的线性范围为 2． 5 ～ 60 ng /mL，检测限为 2． 5 ng /mL，线性
回归方程为 y = 0． 012x － 0． 015。蓖麻毒素对检测结果无干扰，表明方法特异性良好。该方法能用于污染水样、饮料、牛奶等基
质中 abrin的检测，相对标准偏差为 5． 18% ～ 8． 67%，具有较好的重现性。与建立的双夹心 ELISA 相比，提高了检测灵敏度，
减少了反应时间。结论 成功建立了免疫捕获法检测 abrin，适用于微量 abrin样品的分析。
［关键词］ 相思子毒素;磁性纳米颗粒;免疫捕获;双抗体夹心法
［中图分类号］ Q946-3，Ｒ446． 61，S852． 4 + 4 ［文献标志码］ A
The establishment of a magnetic nanoparticle-based immunocapturing method for
the detection of abrin
LIANG Longhui，LIU Shilei*，GAO Chuan，ZHOU Shikun
State Key Laboratory of NBC Protection for Civilian，Ｒesearch Institute of Chemical Defence，Beijing 102205，China
［Abstract］ Objective To develop a high sensitive and specific method for the detection of abrin． Methods The abrin
monoclonal antibody (mAb)7D1 coated with Fe3O4 magnetic nanoparticles (MNPs)and abrin mAb labeled with horseradish
peroxidase (HＲP-mAb)were used to establish the immunocapturing method for abrin detection． The results were compared
with the traditional double antibody sandwich ELISA． Ｒesults The detecting linear of immunocapture for abrin was
2． 5 － 60 ng /mL，and the linear regression equation was y = 0． 012x － 0． 015 with the detection limit of 2． 5 ng /mL． Ｒicin at
different concentrations did not interfere the abrin detection results，which demonstrated that the method had a good specificity．
This approach showed good reproducibility with relative standard deviation ranging from 5． 18% － 8． 67%． It could be used for
analyzing abrin-contaminated specimens such as water，beverage，and milk，etc． The results of comparison with the conventional
double antibody sandwich ELISA indicated that the immunocapture have a broader linear scale，higher sensitivity，and a
shorter detection time． Conclusion The developed immunocapturing method can be used for detecting traces of abrin．
［Key words］ abrin;magnetic nanoparticle;immunocapture;double antibody sandwich ELISA
从天然豆科植物相思(Abrus Precatorius)种子中
提取出的相思子毒素(abrin)是一种 2 型核糖体失活
蛋白(ribosome-inactivating protein，ＲIP2)［1 － 2］。Abrin
由 2 个肽链(A 链、B 链)通过 1 个二硫键相连接而
成，其中 A 链具有 N-糖苷酶活性，能够脱去细胞内
28 S rＲNA上特定的腺嘌呤残基。而 B 链是一种乳
糖结合凝集素。Abrin 通过 B 链与细胞表面相结合，
然后经过内吞作用进入细胞内部，然后通过 A 链的
脱嘌呤作用，从而抑制蛋白质的合成，使细胞死
亡［3 － 5］。Abrin是自然界中毒性最强的毒素之一，是
普通化学武器的几百倍。由于相思子植物天然资源
丰富，并且易于提取，能够实现大批量生产，具备作
为生物毒素武器的典型特征，极有可能被不法分子
利用制造极端恐怖事件［6］，是《禁止生物武器公约》
中的管控化合物。
关于 abrin的检测方法，比较成熟的是基于抗原-
抗体特异性反应建立的免疫检测法。本实验结合了
纳米磁颗粒的富集分离优势以及单克隆抗体
(monoclonal antibody，mAb)的特异识别能力，设计
了一种免疫捕获检测方法［7］，并与传统的双抗体夹
5901细胞与分子免疫学杂志(Chin J Cell Mol Immunol)2014，30(10)
DOI:10.13423/j.cnki.cjcmi.007131
心 ELISA［8 － 9］进行了系统比较。结果表明，所建的免
疫捕获法达到了提高检测灵敏度，缩短检测时间的
目的。适用于污染样品中微量相思子的检测，所建
方法目前在国内还未见报道。
1 材料和方法
1． 1 材料 Abrin 标准品由植物相思子提取纯化而得，包被
abrin mAb 7D1 的 Fe3O4 磁性纳米颗粒，辣根过氧化物酶
(horseradish peroxidase，HＲP)标记的 abrin mAb 以及 HＲP 标记
的山羊抗小鼠 IgG(HＲP-IgG)均由中科院生物物理所提供。
牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)购自北京欣经科生物
技术公司，N-四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)购自华
美生物技术有限公司。550 型酶标仪购自Bio-Ｒad公司。12 道
磁力架为 Promega公司产品。
1． 2 方法
1． 2． 1 Abrin mAb 7D1 以及 HＲP-mAb 的效价测定 用间接
ELISA判断抗体的活性［10］。用包被液(0． 1 mol /L碳酸盐缓冲
液，pH9． 5)将 abrin标准品稀释到浓度为 5 μg /mL，包被酶标
板，4℃过夜。用含 0． 5 mol /L Tween-20 的 PBST 洗 3 次。酶
标板上未包被的位点用含 10 g /L BSA的 PBST溶液(封闭液)
封闭，37℃孵育 1 h。用 PBST 洗 3 次后取出 2 条酶标板，每
条板的第 1 个孔作为空白，将 4． 6 mg /mL的 abrin mAb 7D1 以
及2． 2 mg /mL HＲP-mAb 分别稀释 10 －4、10 －5、10 －6、10 －7倍，
每孔 100 μL加入其余各孔，37℃孵育 0． 5 h。用 PBST洗 3 次
后，加入 50 μL稀释 3 000倍 HＲP-IgG，37℃孵育 1 h。用 PBST
洗 3次后每孔加 TMB显色剂，室温 5 min后加入 50 μL 2 mol /L
H2SO4 终止反应。用 Bio-Ｒad 550 型酶标仪测定 A450值。
1． 2． 2 免疫磁珠捕获方法的建立
1． 2． 2． 1 加入磁性纳米颗粒 取出 11 个 1． 5 mL离心管，标
号 0 ～ 10，每个离心管中加入 1 mL 的抗体稀释液(10 g /L
BSA)和 10 μL的连接 abrin mAb 7D1 的 Fe3O4 磁性纳米颗粒。
1． 2． 2． 2 加待检样品 除 0 号管作为空白外，将 abrin 标准
品按(2． 5 ～80)ng /mL稀释到各个离心管中，37℃孵育30 min。
把各个离心管放入用带有磁铁的离心管架中，磁吸附，用移液
枪吸排上层液体，再用 PBST洗涤，重复 3次上述操作。
1． 2． 2． 3 加入 HＲP标记的 abrin捕获抗体 各管中加入稀释
3 000 倍的辣根过氧化物酶标记的 abrin mAb(HＲP-mAb)
200 μL，37℃孵育 15 min。
1． 2． 2． 4 洗涤、显色、读数 用 PBST 洗涤 3 次，每孔加
10 g /L TMB显色剂 A 和显色剂 B 各 100 μL，室温下放置
15 min，再加入 50 μL 2 mol /L 的 H2SO4，使反应终止;用移
液枪吸取各管中的液体 50 μL 加入酶标板条中，在
Bio-Ｒad 550型酶标仪上测定 A450值，用试剂空白孔调零。
1． 2． 3 双抗体夹心 ELISA 方法的建立 用常规双抗体夹心
ELISA检测 abrin［11］。用 5 μg /mL 的 abrin mAb包被 ELISA酶
标板，每孔 100 μL，4℃ 24 h，用 PBST洗 3 次，甩干后封闭。
除留 1 排孔作为空白对照外，其余各孔加入成比例稀释的
abrin标准品各 100 μL，空白对照加 100 μL 的 10 g /L
BSA-PBST，37℃ 1 h，用 PBST洗 3 次。甩干后加入 100 μL酶
标二抗((1∶3 000) ，37℃ 1 h，用 PBST 洗 5 次，甩干。加入
TMB底物，室温下 15 min 显色后再加入 50 μL 2 mol /L 的
H2SO4，终止反应。在酶标仪上测 A450值。
1． 2． 4 线性范围、检测限、重现性 通过以上实验建立 2 种
检测方法工作曲线，并对 2 种方法的检测限、线性范围、重现
性等指标进行比较。
1． 2． 5 免疫捕获方法的特异性考察 在 abrin的响应浓度范
围内，配制梯度浓度的蓖麻毒素(ricin)标样。用建立的免疫捕获
方法检测与 abrin性质、结构都很相似的蓖麻毒素，将得到的实
验结果与 abrin比较。考察方法的特异性。
1． 2． 6 免疫捕获法测定 abrin模拟样品 取 5 mL自来水，可
乐以及牛奶，每个样品中加入 abrin至浓度为 15 ng /mL，混匀
离心取上清液 1 mL，同时配制 abrin 标样的随行工作曲线。
用免疫捕获方法检测各模拟样品中 abrin的浓度，并计算回收
率和重复性。
2 结果
2． 1 Abrin mAb 7D1 和 HPＲ-mAb的效价测定 通
过实验得到 abrin mAb 7D1 和 HPＲ-mAb 的效价可达
到 1∶1 × 105 和 1∶5 × 104 表明 2 种抗体能够用于免疫
捕获和夹心 ELISA实验中。
2． 2 免疫捕获法与双抗体夹心 ELISA法的系统比较
2． 2． 1 免疫捕获法工作曲线的建立以及重复性实验
2． 2． 1． 1 工作曲线 以 abrin 标准品浓度(2． 5 ～
80 ng /mL)的对数值为横坐标，以 A450值为纵坐标作
图，建立免疫捕获法检测 abrin 的工作曲线(图 1)。从
图中可以得到检测的线性范围为 2． 5 ～60 μg /mL，线性
回归方程为 y =0． 011x +0． 016(Ｒ2 =0． 981，n =8)。
图 1 磁珠免疫捕获法检测 abrin工作曲线
6901 细胞与分子免疫学杂志(Chin J Cell Mol Immunol)2014，30(10)
2． 2． 1． 2 检测限和重复性 在 10 ～ 60 ng /mL 检测
的浓度范围内，以阳性数据和阴性数据的比值
(P /N)＞ 2． 1 作为判断阳性的标准［12］。则检测限为
10 ng /mL。在线性范围内，取浓度分别为 10、30 和
40 ng /mL 的 abrin标准品，每个浓度的样品测 3 次，
分析检测方法的重现性(表 1)。
表 1 磁珠免疫捕获法检测不同浓度 abrin的数据
Abrin
(ng /mL)
A450值
1 2 3
x ± s ＲSD(%)
10 0． 19 0． 20 0． 21 0． 19 ± 0． 01 4． 60
30 0． 31 0． 31 0． 32 0． 31 ± 0． 01 2． 75
50 0． 62 0． 63 0． 66 1． 22 ± 0． 02 3． 25
2． 2． 2 双抗体夹心 ELISA法工作曲线的建立以及检
测限考察
2． 2． 2． 1 最适抗体包被浓度的确定 分别用(0． 5、
l． 0、2． 5、5． 0、10． 0、15． 0、20． 0)μg /mL 的 abrin
mAb 7D1 包被酶标板，然后依次再加入浓度为
10 ng /mL 的 abrin 标准品及 1 ∶ 2 000 倍稀释的
HＲP-mAb，同等条件下显色反应后，根据 A450值的变化
选择适合的包被浓度(图 2)。在质量浓度0． 5 ～5 μg /mL
范围内，A450值呈递增趋势，当抗体包被浓度大于
5 μg /mL时，A450值趋于饱和，故本实验确定 abrin多
抗最适包被浓度为 5 μg /mL。
图 2 不同包被浓度的 abrin mAb 7D1 与 A450值的关系
2． 2． 2． 2 工作曲线 以(0． 5 ～ 50)ng /mL abrin 标
准品浓度为横坐标，以 A450值为纵坐标作图，建立夹
心 ELISA的工作曲线(图 3)。从图中可以得到检测
的线性范围为(5 ～ 30)ng /mL，线性回归方程为
y = 0． 022x + 0． 033(Ｒ2 = 0． 971，n = 6)。
2． 2． 2． 3 检测限和重复性 在(5 ～ 30)ng /mL 检测
的浓度范围内，以阳性数据和阴性数据的比值
(P /N)＞ 2． 1 作为判断阳性的标准。测定的检测限为
5 ng /mL。在线性范围内，取浓度分别为1 0 ． 0和
25． 0 ng /mL的 abrin 标准品，每个样品测 3 次，分析
检测方法的重现性(表 2)。
图 3 双抗体夹心 ELISA检测 abrin工作曲线
表 2 双抗体夹心 ELISA检测不同浓度 abrin的数据
Abrin
(ng /mL)
A450值
1 2 3
x ± s ＲSD(%)
10 0． 59 0． 55 0． 56 0． 59 ± 0． 02 3． 49
25 1． 12 1． 28 1． 27 1． 22 ± 0． 09 7． 56
2． 3 免疫捕获方法的特异性考察 随着 abrin 浓度
增加，吸光度增加趋势(图 4)，而检测蓖麻毒素时，
响应值与空白对照很接近，基本可以忽略，这表明建
立的免疫捕获方法对 abrin具有很好的特异性。
图 4 免疫捕获分析法特异性检测曲线
2． 4 免疫捕获法测定 abrin 模拟样品 利用免疫捕
获法检测自来水、可乐、牛奶等人工模拟样品中的
abrin，能够得到理想的结果(表 3)。
790110 期 梁龙辉，等． 相思子毒素磁性纳米颗粒免疫捕获法的建立
表 3 Abrin模拟样品的测定
样品
种类
实际浓度
(ng /mL)
测定浓度
(ng /mL)
回收率
(%)
相对标准
偏差(%)
自来水 15 14． 67 ± 0． 46 97． 80 5． 18
可乐 15 14． 53 ± 0． 30 96． 80 5． 98
牛奶 15 13． 97 ± 0． 28 92． 00 8． 67
3 讨论
本研究基于纳米磁珠的特异性富集作用建立了
abrin的免疫捕获分析法，该方法能够成功用于染毒
水源、饮料、牛奶等模拟样品中微量 abrin 的检测。
本方法将磁性纳米颗粒和 abrin 抗体相结合，建立了
MNP-abrin-HＲP-mAb的检测结构，具有较高的灵敏
度、重现性和特异性。检测结果与本实验建立的传
统双夹心 ELISA 相比较，检测限更低，线性范围也
更宽。
利用电化学修饰的放大作用，对传统 ELISA 检
测方法进行优化，大大提高检测灵敏度，对土壤样品
中的目标蛋白检测限达到了0． 5 ng /g［13］。相比于此
类方法，免疫捕获方法有两方面优势。首先，无论是
传统的还是经过改进的 ELISA 都需要进行包被、封
闭等冗长造作，不但耗时长，而且极易产生交叉污染
甚至产生假阳性结果［14 － 15］。而建立免疫捕获法整个
实验仅耗时约 2 h，反应耗时短，操作步骤少，大大
减少了交叉污染，提高了方法的准确性。其次，
ELISA分析方法功能单一，只能实现目标物的检测
而不能得到目标物的结构信息。而免疫磁珠可以对
复杂样品中的目标物进行富集提纯，能够作为一种
样品制备技术与其他分析手段相结合，实现化合物
的准确鉴定。目前已经出现了免疫捕获和质谱以及
生物传感器等技术相结合的相关研究报道［16 － 17］。当
然免疫捕获方法也存在一定的缺点:实验所需的专
一性免疫磁珠制备复杂且成本较高，首先需要对蓖
麻毒素抗体进行生物素标记，然后对 Fe3O4 磁珠进
行链霉亲和素修饰，将修饰过的抗体和磁珠按特定
的比例混合反应，对实验人员要求较高。另外，与传
统 ELISA 相比，该方法的缺点是在免疫捕获过程中
会损失部分样品，回收率较低。
综上所述，本实验将抗原-抗体的特异性识别作
用与纳米磁珠的强磁响应性相结合，建立的免疫捕
获分析方法能够实现 abrin 的快速、准确、灵敏的分
析检测。在反恐安全、食品检疫、中毒诊断等方面都
有着重要的意义。
参考文献:
［1］Silva AL，Goto LS，Dinarte AＲ，et al． Pulchellin，a highly toxic
type 2 ribosome-inactivating protein from Abrus pulchellus cloning
heterologous expression of A-chain and structural studies［J］．
FEBS J，2005，272(5):1201 － 1210．
［2］马惠海，罗胜军，王 哲，等． 相思子毒素研究进展［J］． 动物
医学进展，2006，27(9):50 － 54．
［3］Bagaria A，Surendranath K，Ｒamagopel UA，et al． Sructure-function
analysis and insights into the reduced toxicity of Abrus precatorius
agglutinin Ⅰ in relation to abrin［J］． J Biol Chem， 2006，
281(45) :34465 － 34474．
［4］Narayanan S，Surolia A，Karande AA． Ｒibosome-inactivating protein and
apoptosis:abrin causes cell death via mitochondrial pathway in Jurkat
cells［J］． Biochem J，2004，377(Pt 1) :233 － 240．
［5］Ｒamnath V，Kuttan G，Kuttan Ｒ，et al． Effect of abrin on cell-mediated
immune responses in mice［J］． Immunopharmacol Immunotoxicol，
2006，28(2) :259 － 268．
［6］Garber EA． Toxicity and detection of ricin and abrin in beverages
［J］． J Food Prot，2008，71(9) :1875 － 1883．
［7］Yin HQ，Jia MX，Yang S，et al． A nanoparticle-based bio-barcode
assay for ultrasensitive detection of ricin toxin［J］． Toxicon，2012，
59(1) :12 － 16．
［8］Zhou Y，Tian XL，Li YS，et al． Development of a monoclonal antibody-
based sandwich-type enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
for detection of abrin in food samples［J］． Food Chem，2012，
135(4) :2661 － 2665．
［9］穆晞惠，童朝阳，郝兰群，等． 双抗体夹心 ELISA法检测相思子
毒素［J］． 细胞与分子免疫学杂志，2007，23(8):763 － 766．
［10］Garber EA，Walker JL，O’Brien TW，et al． Detection of abrin in food
using enzyme-linked immunosorbent assay and electrochemiluminescence
technologies［J］． J Food Prot，2008，71(9) :1868 － 1874．
［11］李成文． 现代免疫化学技术［M］．上海科学技术出版社，1990:
79 － 101．
［12］穆唏惠，童朝阳，郝兰群，等． 双抗体夹心生物素-亲和素 ELISA
法检测相思子毒素［J］． 免疫学杂志，2007，23(5):571 － 574．
［13］ Brandon DL． Detection of ricin contamination in ground beef by
electrochemiluminescence immunosorbent assay ［ J］． Toxins
(Basel) ，2011，3(4) :398 － 408．
［14］Alexiou C，Jurgons Ｒ，Seliger C，et al． Delivery of superparamagnetic
nanoparticles for local chemotherapy after intraarterial infusion and
magnetic drug targeting［J］． Anticancer Ｒes，2007，27 (4A) :
2019 － 2022．
［15］ Xu J，Liang Y，Belisle D，et al． Characterization of monoclonal
antibodies to an antigenic protein from Stachybotrys chartarum and its
measurement in house dust［J］． J Immunol Methods， 2008，
332(1 /2) :121 － 128．
［16］Becher F，Duriez E，Volland H，et al． Detection of functional ricin
by immunoaffinity and liquid chromatography-tandem mass
spectrometry［J］． Anal Chem，2007，79(2) :659 － 665．
［17］Zhuang JL，Cheng T，Gao L，et al． Silica coating magnetic nanoparticle-based
silver enhancement immunoassay for rapid electrical detection of ricin toxin
［J］． Toxicon，2010，55(1) :145 － 152．
8901 细胞与分子免疫学杂志(Chin J Cell Mol Immunol)2014，30(10)