全 文 ：臭苜蓿根提取物对脂多糖诱导急性炎症中核因子 -κB表达的影响
李晓峰 1 董艳玲 1 郭远瑾 2 李燕华 1 蔺心敬 1 李吕力 1
(1广西壮族自治区人民医院神经内科 , 南宁市 530021;2华中科技大学附属协和医院神经内科 , 武汉市 430022)
【摘要】 目的 探讨核因子-κB(NF-κB)在 LPS诱导急性炎症中的表达及臭苜蓿根提取物的干预作用。方法 通过脂多糖
干预 RAW264.7细胞系建立炎症细胞模型 ,免疫细胞化学法检验 NF-κB的表达及分布变化。结果 免疫细胞化学法结果显示
干预时 , 巨噬细胞胞核被染为棕色 , NF-κB集中分布在细胞核且表达增强。臭苜蓿根提取物干预时 NF-κB多分布在胞质未被激
活。结论 臭苜蓿根提取物通过抑制 NF-κB的激活发挥抗炎作用。
【关键词】 臭苜蓿根提取物;炎症;RAW264.7细胞系;核因子-κB
【中图分类号】 R285.5 【文献标识码】 A 【文章编号】 0253-4304(2009)08-1079-03
EfectofDaghestanSweetcloverHerbExtractonthe
ExpressionofNF-κBInductioninAcuteInflammationbyLPS
LIXiao-feng1 , DONGYan-ling1 , GUOYuan-jin2 , LIYan-hua1 , LINXin-jing1 , LILv-li1
(1DepartmentofNeurology, PeoplesHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion, Nanning530021, China;
2DepartmentofNeurology, UnionHospital, TongjiMedicalColege, HuazhongUniversityofScienceandTechnology, Wuhan430022, China)
【Abstract】 Objective TostudytheexpressofNF-κBinductioninacuteinflammationbylipopolysaccharide(LPS)andtheanti-inflammatory
effectoftheDaghestansweetcloverherbrootextract.Methods InflammatorycellmodelwasconstructedbyLPSactingRAW264.7cellline.
TheexpressionanddistributionofNF-κBweredetectedbyimmunohistochemistrymethod.Results Theimmunohistochemistryresultshowed
thatthemacrophagecellnucleusstainedtobrown, itpresentedNF-κBactivationandconcentratedoncelnucleus, whilethecytoplasm
stainedtobrownwhatpresentedNF-κBinactivationaftertheinterventionofdaghestansweetcloverherbrootextract.Conclusion The
DaghestansweetcloverherbrootextractcanresistinflammationbyinhibitingtheactivationofNF-κB.
【Keywords】 Daghestansweetcloverherbrootextract;Inflammation;RAW264.7celline;NF-κB
核因子-κB(nuclearfactorkappaB, NF-κB)是近年发现的一
种具有多向性调节作用的核转录因子。已有研究证实 NF-κB
能够转录调节编码一系列炎性介质基因, 在炎症反应中起枢纽
作用 [ 1]。 臭苜蓿根, 豆科 (Leguminosae)草木犀属(Melilotus
suaveolensLedeb.)一年生或二年生草本植物 ,是临床用于抗炎
的一种中草药。但是 ,臭苜蓿根产生抗炎作用的分子生物学机
制还不明确。本实验拟通过脂多糖刺激 RAW 264.7小鼠巨噬
细胞系建立炎症细胞模型 [ 2] ,并采用免疫细胞化学法对臭苜蓿
根提取物在炎症中的作用进行研究。
1 材料与方法
1.1 材料 RPMI1640、Trizol购自 Gibico公司;LPS(Esche-
richiacoliO111:B4)和 MTT购自 Sigma公司;兔抗鼠多克隆抗
体 NF-κBp65 IgG抗体购自 SantaCruz公司;SYBRGreen购自
Biotium公司。小鼠巨噬细胞系 RAW 264.7为华中科技大学
同济医学院冻存。
1.2 方法
1.2.1 臭苜蓿根提取物的制备:取 50 g风干的臭苜蓿根磨成
粉末 , 用 700 ml/L乙醇于 85℃提取 3次(一次 500 ml, 每次
1.5 h), 真空过滤浓缩提取液 , 用去离子水稀释至 1 g/ml(药
材:水)浓度。取 5 ml浓缩液至 100ml的分液漏斗中 ,连续石
油醚提取直至其干重达 0.425g。用 RPMI1640培养基将其稀
释成 3种浓度 10mg/L, 5 mg/L和 1 mg/L备用。
1.2.2 细胞培养:小鼠巨噬细胞系 RAW 264.7 使用
RPMI1640培养液(加入 100 U/ml青霉素 , 100 mg/L链霉素 ,
100 ml/L胎牛血清), 50ml/LCO2培养箱中 37℃培养。
1.2.3 细胞模型的建立和干预:处理前 24h将细胞接种于 6、
24或 96孔板上 , 24 h后细胞贴壁后弃上清 , 加入含 10 g/L
LPS的培养液和不同浓度的提取物 , 作用不同时间后收集细
胞 ,使用 MTT法 、免疫细胞检测。
1.2.4 实验分组:实验共分 4组。 (1)阳性对照组:地塞米松
0.5 g/L作阳性对照;(2)阴性对照组:黄芪多糖 100 mg/L作
为阴性对照;(3)空白对照组:只用 10 g/L的 LPS处理而不加
药物干预;(4)正常对照组:不用处理也不加药物干预。
1.2.5 药物细胞毒性的检测:MTT法 ,在终止细胞培养前 4 h
加入 20 μlMTT溶液(浓度 5 g/L, pH7.4), 终止细胞培养后
每孔加入 150μlDMSO, Spectramax250全自动定量绘图酶标
仪测定 A490值。细胞病变效应(cytopathiceffect, CPE)检测 ,细
胞在提取液中培养 24 h后在显微镜下观察细胞形态以检测细
胞病变。
1.2.6 NF-κB的检测:使用免疫细胞化学法(SP)检测 NF-κB
的表达及分布变化。将盖玻片置于培养板中 , 并将细胞接种于
培养板 , 细胞爬片后使用药物干预细胞 2 h。 PBS洗涤 , 4℃丙酮
固定 10min;30 ml/L过氧化氢甲醇溶液孵育 20 min以封闭内
源性过氧化物酶;10ml/LTritonX-100 37℃ 5 min, PBS洗涤;加
入山羊血清室温孵育 20 min;然后加入兔抗鼠多克隆抗体NF-κ
Bp65 IgG抗体(1 ∶200), 4℃冰箱过夜 , PBS洗涤;加入二抗
(生物素化羊抗兔 IgG, 1 ∶400), 37℃孵育 30 min, PBS洗涤;
加入 HRP结合链霉亲合素(1∶400), 37℃孵育 30min, PBS洗
涤;DAB/H2O2显色 ,苏木素衬染 ,常规脱水 、透明 、封片。
1079广西医学 2009年 8月第 31卷第 8期
1.3 统计学分析 应用 SPSS12.0统计分析软件包,采取单因素
方差分析对实验数据进行处理,以 P<0.05为有统计学意义。
2 结 果
2.1 药物对细胞的毒性 MTT实验结果显示 ,浓度 10 mg/L、
5mg/L和 1mg/L药物干预细胞 24 h后吸光度分别为(0.88 ±
0.083)、(0.97±0.086)、(0.92±0.085),模型组(0.87±0.084),正
常组(0.92±0.092),表明 3种浓度药物干预细胞 24h后对细胞活
性没有明显影响, CPE结果亦如此 ,见图 1。
A 正常巨噬细胞
A Normalmacrophage
B 10mg/L药物干预后巨噬细胞
B macrophageby10mg/Lextract
图 1 CPE结果
Fig1 ResultofCPE
2.2 药物对 NF-κB的抑制效果 免疫细胞化学法结果显示:
臭苜蓿根提取物干预时 , 胞质被染成棕色(图 3A～ C), DM干
预时 ,胞质被染成棕色(图 3D), 表示 NF-κB多分布在胞质未
被激活;APS干预时 ,胞核被染成棕色(图 3E),仅有 LPS干预
时 ,胞核被染成棕色(图 3F), 表示 NF-κB集中分布在细胞核
表达增强 ,说明 APS、LPS能诱导其向细胞核转位 ,使 NF-κB活
化。
图 2 提取物 MTT结果
Fig2 ResultofMTT
A 10mg/L臭苜蓿根
提取物干预后图片
A 10 mg/Ldaghestansweetclover
rootextractintervention
B 5mg/L臭苜蓿根
提取物干预后图片
B 5mg/Ldaghestansweetclover
rootextractintervention
C 1mg/L臭苜蓿根
提取物干预后图片
C 1mg/Ldaghestansweetclover
rootextractintervention
D 为地塞米松干预后
D dexamethasoneintervention
E 黄芪多糖干预后
E APSintervention
F 脂多糖干预后
F LPSintervention
G 正常对照
G normalgroup
图 3 免疫细胞化学法观察不同组 NF-κB的位置
Fig3 PositionofNF-κBinthegroupsbyimmunocytochemicalmethod
3 讨 论
巨噬细胞在炎症的启动过程中起着非常关键的作用 , 它
通过激活机体的免疫系统 ,释放细胞因子 、具有生物活性的脂
类介质及活性氧等一系列炎症介质参与炎症反应 [ 3] 。根据其
对炎症反应的促进或抑制效应的不同 , 这些炎症介质大致上
可分为两类:促炎介质和抗炎介质 , 两者的比例关系及动态变
化是决定炎症转归的关键因素 [ 4] 。当细胞面临有毒性的化学
物质或病原体侵袭的时候 , 机体的免疫系统会释放出 NF-κB。
NF-κB是调控众多炎症基因表达的关键转录因子 ,其通常以非
1080 GuangxiMedicalJournal, Aug.2009, Vol.31, No.8
活性状态存在于细胞质中 , 当细胞受到 TNF等刺激时 , NF-κB
得以活化并从细胞质易位到细胞核 , 启动多种炎症基因表达 ,
使大量的炎性细胞浸润于炎症部位 [ 5] 。 NF-κB发生核转位是
一些免疫和炎症反应的重要步骤。 NF-κB是目前筛选中药成
分中最有潜力抗炎靶点 , 应用 NF-κB抑制剂以减少炎症介质
的产生成为治疗炎症的新思路。
近期研究已证实 , 臭苜蓿根提取物能通过抑制促炎介质
和细胞因子 TNF-α、IL-1、IL-6、NO的产生发挥抗炎作用。而这
些促炎介质和细胞因子都受 NF-κB的调控 , 这就提示臭苜蓿
根提取物可能通过抑制 NF-κB信号通路而抑制脂多糖所致巨
噬细胞高水平表达 TNF-α、IL-1β 等发挥抗炎作用。本实验结
果显示脂多糖刺激细胞后 NF-κB得以活化并向核内转位 , 药
物干预后 NF-κB以非活性状态存在于胞质中未被激活 , 进一
步证实了臭苜蓿根提取物能通过抑制 NF-κB活化发挥抗炎作
用。本实验选用地塞米松和黄芪多糖分别作为阳性和阴性对
照。地塞米松是传统的抗炎药物;黄芪多糖是临床上用于增
强免疫的免疫调节剂 ,能够增强促炎因子的释放 [ 6 , 7] 。结果显
示 , 一定浓度的地塞米松可显著降低 NF-κB活化 , 而黄芪多糖
则没有这方面的作用 ,这与文献报告的结果基本一致 [ 8, 9] 。
本研究从分子水平探讨了臭苜蓿根提取物的体外抗炎活
性及其可能的分子机制。 通过本研究发现 , 臭苜蓿根提取物
通过抑制促炎介质的表达 ,并促进抗炎介质的表达 , 从而产生
广泛的抗炎作用。
参 考 文 献
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(收稿日期:2009-02-20 修回日期:2009-04-28)
△基金项目:广西医疗卫生科学研究基金(桂卫 Z2006080)
肾病综合征患者心理状况调查分析△
黄燕林 1 林剑珊 2 缪丽春 1 滕艳娟 1 王明军 1 李浩宇1 龙娟凤1
(广西医科大学 1第一附属医院肾内科 , 2研究生学院 , 南宁市 530021)
【摘要】 目的 调查分析肾病综合征患者的心理状况 ,为临床心理干预 , 提高患者的依从性提供参考依据。方法 采用焦
虑自评量表(SAS)、抑郁自评量表(SDS)调查 300例肾病综合征患者心理状况 ,与国内常模比较 , 并进行不同性别 、年龄和经济收
入患者的 SAS和 SDS总分值比较。结果 肾病综合征患者的焦虑总分和抑郁总分均高于国内常模 , 差异均有统计学意义
(P<0.05);不同性别 、年龄和经济收入患者的 SAS和 SDS总分值比较差异均有统计学意义(P<0.05),女性患者焦虑抑郁程度
高于男性;随着年龄增大 ,焦虑抑郁程度减轻;月收入越高的患者 , 其焦虑抑郁程度越轻。结论 肾病综合征患者存在不同程度
的心理问题 , 对于存在消极情绪的患者应采取必要的干预性措施 , 提高治疗依从性 , 促进患者康复。
【关键词】 肾病综合征;焦虑;抑郁;心理状况调查
【中图分类号】 R692 【文献标识码】 A 【文章编号】 0253-4304(2009)08-1081-03
StudyofAnxietyandDepressiononthe300 PatientswithNephroticSyndrome
HUANGYan-lin, LINJian-shan, TENGYan-juan, WANGMing-jun, LIHao-yu, LONGJuan-feng
(1DepartmentofNephrology, theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity, Nanning530021, China;
2Post-GraduateColege, GuangxiMedicalUniversity, Nanning530021, China)
【Abstract】 Objective Toinvestigatetheincidenceofanxietyanddepressionsituationofthepatientswithnephroticsyndromeand
provideabasisfortheclinicalpsychologicalintervention.Methods Dataof300 patientswithnephroticsyndromefromselfratinganxiety
scaleandself-ratingdepressionscalewereanalyzed, andcomparedthetotalscoresoftwoscalesinsex, ageandincome.Results Scoresof
1081广西医学 2009年 8月第 31卷第 8期