全 文 ：体外释放度试验，结果见图 4。结果表明:3 批舒胸
脉冲控释滴丸处方与制备工艺重现性良好，平均时
滞约为 4 h，随后 4 h的累积释药百分率均大于 80%。
3 讨论
3. 1 本实验采用双层包衣模型制备溶胀-膜控型舒
胸脉冲控释滴丸，该模型内层为水溶胀型材料，外层
控释包衣为惰性高分子材料，药物的释放通过外层
膜的破裂而触发。当包衣滴丸口服后，并不立即释
药，而是胃肠液不断通过控释层向内部渗透，溶胀层
吸水逐渐膨胀，一定时滞后，溶胀层的膨胀力达到一
定程度，将外层衣膜撑破，药物通过裂口迅速完全释
放出来。其中，药物的释放时滞和时滞后药物的迅
速释放是制备该剂型的难点和关键。
3. 2 本实验选用 CCMC-Na 作为溶胀层材料，该材
料是超级崩解剂中的一种，具有很强的吸水膨胀性，
所产生的膨胀力能较快撑破外层衣膜，使药物可以
迅速释放，达到脉冲释药效果。选用 Surelease 作为
控释层材料，其乙基纤维素固含量高，成模性好，使
用方法简单，能够实现较好的脉冲释放效果。
3. 3 溶胀层材料、厚度(包衣增重)以及控释层厚
度的选择是能否实现脉冲释药的关键。溶胀层材料
的选择取决于材料遇水膨胀的能力，膨胀力越大，脉
冲释药效果越好;当控释层厚度一定时，释药时滞随
着溶胀层厚度的增加而缩短，释药速率反而加快;当
溶胀层厚度一定时，释药时滞随着控释层厚度的增
加明显延长，释药速率也明显下降，且释药不完全。
3. 4 本实验选择合适大小(10 ～ 15 mg)的舒胸滴
丸进行包衣，以 CCMC-Na 为溶胀层材料，Surelease
为控释层材料，制备舒胸脉冲控释滴丸。当溶胀层
包衣增重 15%，控释层包衣增重 7%时，脉冲滴丸体
外释药时滞达 4 h，时滞后 4 h 累积释药百分率达
80%以上，达到预期效果。该制剂的体内释药行为
还有待于进一步研究。
参 考 文 献
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收稿日期:2012-08-13
基金项目:国家林业公益性行业科研专项(201104044) ;中南林业科技大学青年科学研究基金项目(101-0686)
作者简介:陆俊(1978-) ，男，博士，讲师，研究方向:天然产物开发与利用;Tel:0731-85623074，E-mail:690056167@ qq. com。
* 通讯作者:李忠海，Tel:073185623072，E-mail:lizh11@ 163. com。
酶法辅助提取鸭儿芹总黄酮的工艺优化研究
陆 俊1，2，许妍妍1，容 欧1，李尚斌1，周 驰1，李忠海1，2*
(1．中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004;2．稻谷及副产物深加工国家工程实验室，湖
南 长沙 410004)
摘要 目的:优化酶法辅助提取鸭儿芹总黄酮的工艺条件。方法:以鸭儿芹总黄酮提取率为主要指标，通过单
因素试验和正交试验，确定最佳工艺条件。结果:酶法辅助提取鸭儿芹总黄酮的最佳工艺条件为:酶用量为 1 U /
mL，酶解 pH值 5. 5，酶解温度为 60℃，酶解时间为 1 h，料液比 1 ∶ 30，提取温度为 70℃，浸提时间为 1 h，总黄酮提取
率可达 4. 76%。结论:酶法辅助提取鸭儿芹总黄酮具有较高的提取率，是一种安全可靠的提取方法。
关键词 鸭儿芹;总黄酮;纤维素酶
中图分类号:R284. 2 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2013)07-1158-05
Study on Enzyme Extraction Technology of Total Flavonoids from Cryptotaenia japonica
LU Jun1，2，XU Yan-yan1，RONG Ou1，LI Shang-bin1，ZHOU Chi1，LI Zhong-hai1，2
(1． College of Food Science and Engineering，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004，China;2． Nation-
·8511· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 7 期 2013 年 7 月
DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2013.07.002
al Engineering Laboratory of Rice and By-products Deep Processing，Changsha 410004，China)
Abstract Objective:To study the optimum enzyme extraction process of total flavonoids from Cryptotaenia japonica． Methods:The
process was optimized by single factor experiments and orthogonal，the yield of total flavonoids was used as index． Results:The optimum
extraction technology was as follows:enzyme dosage:1U /mL，pH value:6. 0，enzymatic hydrolysis temperature:60℃，enzymatic
hydrolysis time:1 h，the rate of material to liquid:1 ∶ 30，extraction temperature:70℃，extraction time:1 h，the average extraction rate of
total flavonoids from Cryptotaenia japonica was 4. 76% ． Conclusion:The method is an effective way to extract total flavonoids from
Cryptotaenia japonica with high extract rate．
Key words Cryptotaenia japonica Hassk.;Total flavonoids;Cellulose enzyme
鸭儿芹 Cryptotaenia japonica Hassk. ，又名三叶
芹、水芹菜、鸭脚板草，属伞形科鸭儿芹属多年生草
本植物，其性味辛、苦，平，具有消炎、解毒、活血、消
肿，治肺病、淋病、风火牙痛及抗感染、抗病毒等功
效〔1，2〕。本实验以鸭儿芹总黄酮提取率为考察指
标，采用正交试验法优化酶法辅助提取鸭儿芹总黄
酮的工艺，为鸭儿芹总黄酮的进一步开发利用提供
技术参考和支持。
1 仪器与材料
1. 1 仪器 722s 型可见分光光度计(上海精密科
学仪器有限公司生产) ;电子分析天平(日本岛津公
司) ;精密 pH计(梅特勒-托利多) ;TGL-20M高速台
式冷冻离心机(湘仪生产) ;SHY-2S 旋转水浴恒温
振荡器(江苏大地自动化仪器厂环保仪器厂) ;电子
恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司) ;微型植
物试样粉碎机(湖南中诚制药机械厂)。
1. 2 材料 氢氧化钠、硝酸铝、石油醚、亚硝酸钠、
无水乙醇、冰醋酸、醋酸钠均为国产分析纯;芦丁对
照品(质量分数≥92. 5%，批号:100080-200707，中
国食品药品检定研究院) ;果胶酶(30 U /mg，批号:
31529，阿拉丁) ;纤维素酶(10 U /mg，批号:31530，
阿拉丁) ，实验室自制蒸馏水。实验用鸭儿芹于 2011
年 5月采自湘西，经中南林业科技大学张美群教授鉴
定为伞形科鸭儿芹属植物鸭儿芹 Cryptotaenia japonica
Hassk. 的茎叶。除去灰尘、泥土、死叶，放在阴凉通风
处冷却，然后放入鼓风烘箱中在 60℃条件下烘干至手
捏成粉末状后用粉碎机粉碎，贮存于干燥暗处备用。
2 方法与结果
2. 1 黄酮的测定
2. 1. 1 检测波长的确定〔3〕:精确称取芦丁对照品
20 mg，用 70%乙醇溶解并定容于 100 mL 容量瓶中
作为芦丁对照品溶液备用。分别取 2 mL 芦丁对照
品溶液和待测样液置于 10 mL 刻度的具塞试管，加
入 5%亚硝酸钠 0. 6 mL 后放置 6 min，加入 10%硝
酸铝 0. 5 mL，再放置 6 min，加入 4% 氢氧化钠 4
mL，70%乙醇定容至 10 mL，静置 10 min，以试剂溶
液为参比液，在 400 ～ 800 nm范围内进行光谱扫描，
扫描结果显示两者在 507 nm处均有最大吸收峰，因
此确定 507 nm为测定鸭儿芹黄酮的检测波长。
2. 1. 2 回归方程的建立〔4〕:采用亚硝酸钠-硝酸铝
比色法，分别精确吸取 0、0. 5、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5
mL芦丁对照品溶液于 10 mL的刻度具塞试管中，加
入 5%亚硝酸钠 0. 6 mL 后放置 6 min，加入 10%硝
酸铝 0. 5 mL，再放置 6 min，加入 4% 氢氧化钠 4
mL，70%乙醇定容至 10 mL，静置 10 min，以试剂溶
液为参比液，在 507 nm波长下测定吸光度。得芦丁
质量分数(C，mg /mL)与吸光度(A)之间的回归方程
为:C = 1. 0286A － 0. 0161(r = 0. 9996)。
2. 1. 3 样品含量的测定:精确吸取提取待检的样
液 1 mL于 10 mL的具塞试管中，以下操作同标准曲
线的制作。根据吸光度和回归方程计算黄酮含量并
依据以下公式求得总黄酮提取率。
黄酮提取率 /% =浸提液中黄酮质量 /鸭儿芹干粉质
量 × 100%
2. 2 单因素试验
2. 2. 1 酶的种类对总黄酮提取率的影响:精确称
取 3. 00 g鸭儿芹粉末 5 份置于 5 个锥形瓶中，分别
加入 30 mL pH值为 4. 5 醋酸-醋酸钠缓冲溶液，再
按表 1 加入不同的酶，在 50℃的温度下水浴振荡酶
解处理 1 h后分别加入 60 mL 70%的乙醇，在 70℃
水浴浸提 1 h 后抽滤，离心，取 1 mL 上清液测定吸
光度并计算总黄酮提取率，结果见表 1。
表 1 酶的种类对总黄酮提取率的影响
试验号 Ⅰ Ⅱ Ⅰ +Ⅱ Ⅰ +Ⅱ Ⅰ +Ⅱ Ⅲ
酶用量(U) 60 60 30 + 30 40 + 20 20 + 40 0
总黄酮提取率 /% 2. 3118 2. 2331 2. 0572 1. 9878 2. 1483 1. 9882
注:Ⅰ为纤维素酶，Ⅱ为果胶酶，Ⅲ为不添加任何酶
·9511·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 7 期 2013 年 7 月
由表1可知，除第 4组试验黄酮提取率(1. 9878%)
较低外，其他加酶试验组的总黄酮提取率均高于不
加酶的，加酶实验组中，以单独加纤维素酶的总黄酮
提取率最高，明显高于单独加果胶酶和加两种酶的
实验组，由此可知，纤维素酶和果胶酶没有协同作
用，单独用纤维生素酶的黄酮提取效果最好，因此以
下实验选择单独用纤维素酶进行酶解。
2. 2. 2 酶用量对总黄酮提取率的影响:精确称取
3. 00 g鸭儿芹粉末 5 份分别置于 5 个锥形瓶中，分
别加入 30 mL pH值为 4. 5，酶浓度为 1、1. 5、2、2. 5、
3、3. 5 U / mL的醋酸-醋酸钠缓冲液，在 50℃的温度
下水浴振荡酶解处理 1 h 后加入 60 mL 70%乙醇，
在 70 ℃下水浴浸提 1 h后抽滤、离心，取 1 mL上清
液测定吸光度并计算总黄酮提取率，结果见图 1。
图 1 纤维素酶用量对总黄酮提取率的影响
由图 1 可知，随着酶用量的增加，总黄酮的提取
率也逐渐增大，但酶浓度对酶反应速度也有饱和现
象，当纤维素酶用量为 2 U /mL时，总黄酮提取率达
到最大值，随后总黄酮提取率随酶用量增大不再增
大，反而稍微减小。因此最佳酶用量应在 2 U /mL。
2. 2. 3 酶解 pH值对总黄酮提取率的影响:精密称
取 3. 00 g鸭儿芹粉末 5 份置于 5 个锥形瓶中，分别
加入 30 mL纤维酶浓度为 2 U /mL，pH 值为 4、4. 5、
5、5. 5、6 醋酸-醋酸钠缓冲液，在 50 ℃的温度下水浴
酶解处理 1 h后加入 60 mL 70%乙醇，在 70 ℃下浸
提 1 h 后超滤，离心，取 1 mL 上清液测定吸光度并
计算总黄酮提取率，结果见图 2。
图 2 缓冲液 pH值对总黄酮提取率的影响
由图 2 可知，当酶溶液 pH 为 4. 5 时，总黄酮提
取率达到最大值，随着 pH 值的增大，总黄酮的提取
率呈下降趋势，结果表明纤维素酶在微酸环境下酶
活力较高，因此选择 pH值为 4. 5 进行下一步实验。
2. 2. 4 酶解温度对总黄酮提取率的影响:精密称
取 3. 00 g鸭儿芹粉末 5 份分别置于 5 个锥形瓶中，
分别加 30 mL pH值为 4. 5，酶浓度为 2 U /mL 的醋
酸-醋酸钠缓冲液，分别置于温度为 40、45、50、55、60
℃水浴酶解处理 1 h 后加入 60 mL 70% 的乙醇，在
70℃下浸提 1 h 后抽滤、离心，取 1 mL 上清液测定
吸光度并计算总黄酮提取率，结果见图 3。
图 3 酶解温度对总黄酮提取率的影响
由图 3 可知，随着温度的升高，酶促反应也加
快，总黄酮提取率也随之增加，当酶解温度达到
50℃时，总黄酮提取率达到最大值，温度再增加，酶
活性可能下降，提取率反而降低。考虑到酶的活性
受温度的影响较大，因此选择最佳酶解温度为 50℃。
2. 2. 5 酶解时间对总黄酮提取率的影响:精密称
取 3. 00 g鸭儿芹粉末 5 份置于 5 个锥形瓶中，分别
加 30 mL pH值为 4. 5，酶浓度为 2 U /mL的醋酸-醋
酸钠缓冲液，分别置于温度为 50 ℃的水浴酶解处理
30、60、90、120、150 min，再加入 60 mL 70%乙醇，在
70 ℃水浴浸提 1 h后抽滤、离心，取 1 mL 上清液测
定吸光度并计算总黄酮提取率，结果见图 4。
图 4 酶解时间对总黄酮提取率的影响
由图 4 可知，总黄酮提取率在酶解时间为 30 ～
60 min的范围内呈上升趋势，当酶解时间为 60 min
时，总黄酮提取率达到最大值，随着酶解时间的延
长，提取率反而呈下降趋势，可能是酶解产物的浓度
的增加，抑制了水解过程。故选择 60 min 作为最佳
·0611· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 7 期 2013 年 7 月
酶解时间进行下一步试验。
2. 2. 6 料液比对总黄酮提取率的影响:精确称取
3. 00 g鸭儿芹粉末 5 份置于 5 个锥形瓶中，分别加
30 mL pH值为 4. 5，酶浓度为 2 U /mL 的醋酸-醋酸
钠缓冲液，分别置于温度为 50 ℃的水浴酶解处理
30 min，再分别加入料液比为 1 ∶ 15、1 ∶ 20、1 ∶ 25、
1 ∶ 30、1 ∶ 35 的 70%乙醇，在 70℃水浴中浸提 1 h 后
抽滤、离心，取 1 mL上清液测定吸光度并计算总黄
酮提取率，结果见图 5。
图 5 料液比对总黄酮提取率的影响
由图 5 可知，随着提取溶剂的增加，提取溶剂与
有效成分接触机会增多，浸出率相应增加，总黄酮提
取率也随之增加，当料液比为 1 ∶ 30 时，总黄酮提取
率达到最大值，再增加料液比，提取率也不会相应增
加，达到饱和状态，考虑到经济成本，因此将1 ∶ 30作
为最佳的料液比。
2. 2. 7 提取温度对总黄酮提取率的影响:精密称
取 3. 00 g鸭儿芹粉末 5 份置于 5 个锥形瓶中，分别
加 30 mL pH值为 4. 5，酶浓度为 2 U /mL的醋酸-醋
酸钠缓冲液，分别置于温度为 50 ℃的水浴中酶解处
理 30 min，再加入 90 mL 70%乙醇，分别在 55、60、
65、70、75 ℃水浴浸提 1 h 后抽滤、离心，取 1 mL 上
清液测定吸光度并计算总黄酮提取率，结果见图 6。
图 6 提取温度对总黄酮提取率的影响
由图 6 可知，总黄酮提取率与提取温度在 55 ～
70℃范围内呈正比例关系，增加提取温度能提高黄
酮的浸出率，当提取温度为 70℃时，总黄酮提取率
达到最大值，当提取温度超过 70℃，总黄酮提取率
稍微减小，因此将 70℃作为最佳提取温度。
2. 2. 8 提取时间对总黄酮提取率的影响:精密称
取 3. 00 g鸭儿芹粉末 5 份分别置于 5 个锥形瓶中，
分别加 30 mL pH值为 4. 5，酶浓度为 2 U /mL 的醋
酸-醋酸钠缓冲液，分别置于温度为 50 ℃的水浴酶
解处理 30 min，再加入 90 mL 70% 乙醇，分别在
70℃水浴中浸提 30、60、90、120、150 min 后抽滤、离
心，取 1 mL 上清液测定吸光度并计算总黄酮提取
率，结果见图 7。
图 7 提取时间对总黄酮提取率的影响
由图 7 可知，总黄酮提取率在提取时间为 60
min时达到最大值，再延长提取时间，总黄酮提取率
反而呈下降趋势，这可能是在 70℃的提取温度下，
受热破坏的黄酮增加有关。从节约能源、快速高效
的角度考虑，将 60 min作为最佳提取时间。
2. 3 提取工艺的正交试验优化 在单因素试验
中，酶解时间、提取温度、提取温度都有了明显的最
佳点，因此正交试验选取酶用量、缓冲液 pH 值、酶
解时间、料液比四个因素，每个因素 3 个水平(表 2)
考察对总黄酮提取率的影响，选用 L9(3
4)正交试验
表(表 3)设计正交试验，并对结果进行直观分析、方
差分析(表 4)。
表 2 因素与水平
水平
A 酶用量 /
(U/mL)
B 缓冲液
pH值
C 酶解
温度 /℃
D料液比
/(g /mL)
1 1 4. 5 50 1 ∶ 20
2 2 5. 0 55 1 ∶ 25
3 3 5. 5 60 1 ∶ 30
由分析结果可知，各因素的影响主次为 C ＞ D
＞ B ＞ A，即酶解温度 ＞料液比 ＞缓冲液 pH 值 ＞酶
用量，其中酶解温度达到极显著水平(P ＜ 0. 01) ，缓
冲液 pH值和料液比达到显著水平(P ＜ 0. 05)。最
佳工艺组合为 C3D3B3A1，即酶解温度 60 ℃，酶解
pH值 5. 5，料液比 1 ∶ 30，酶用量为 1 U /mL。
2. 4 验证试验 精密称取 3 份 3. 00 g 鸭儿芹置入
锥形瓶中，分别加入 3. 00 mg纤维素酶和 30 mL pH
为 5. 5 的缓冲液，在 60℃水浴锅中酶解 1 h 后，按 1
∶ 30 的料液比加入 70%的乙醇 90 mL，在 70℃的温
·1611·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 7 期 2013 年 7 月
度下浸提 1 h，再经过抽滤、离心后测量黄酮含量，在
此工艺条件下鸭儿芹总黄酮平均提取率为 4. 76%，
RSD =1. 23%。
2. 5 酶法辅助和溶剂法提取效果的比较 参考文
献〔5〕方法，在料液比 1 ∶ 20，提取温度 70℃的条件
下，用 70%的乙醇浸提 1. 5 h，提取 1 次，总黄酮平
均提取率为 2. 169%(n = 3)。由此可知，纤维素酶
能显著提高提高总黄酮的溶出，从而提高得率。
表 3 L9(3
4)正交试验的设计及结果(n =2)
序号 A B C D 黄酮提取率 /%
1 1 1 1 1 3. 0560 2. 9820
2 1 2 2 2 2. 7373 2. 7337
3 1 3 3 3 3. 6879 3. 6303
4 2 1 2 3 2. 7087 2. 3919
5 2 2 3 1 3. 3276 3. 3430
6 2 3 1 2 3. 1801 3. 2557
7 3 1 3 2 3. 2665 3. 3277
8 3 2 1 3 3. 1654 3. 3588
9 3 3 2 1 2. 4605 2. 5962
K1 18. 8273 17. 7329 18. 9980 17. 7652
K2 18. 2070 18. 6658 15. 6283 18. 5012
K3 18. 1752 18. 8108 20. 5831 18. 9431
R 0. 6521 1. 0779 4. 9548 1. 1779
表 4 正交试验结果的方差分析
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 显著性
A 0. 0451 2 0. 0225 2. 3210
B 0. 1141 2 0. 0570 5. 8766 * P ＜ 0. 05
C 2. 1343 2 1. 0671 109. 9436 ＊＊P ＜ 0. 01
D 0. 1180 2 0. 0590 6. 0792 * P ＜ 0. 05
误差 0. 0874 9 0. 0097
注:F0. 01(2，9)= 8. 02;F0. 05(2，9)= 4. 26
3 讨论
陈丛瑾等〔6〕在香椿叶总黄酮酶法提取工艺研
究中发现，加入纤维素酶和果胶酶后总黄酮提取量
都提高，但加入果胶酶的效果不如加纤维素酶，另
外，加入复合酶后总黄酮提取量都低于相同用量的
纤维素酶，表明两种酶没明显协同作用。本实验结
果同样表明单用纤维素酶黄酮提取率要高于其他复
合酶，因此，单一纤维素酶是较优的选择。本实验工
艺分为酶解和浸提两部分，在全面研究各因素对黄
酮提取率影响的单因素试验的基础上，通过正交试
验优化鸭儿芹总黄酮提取的最佳工艺条件，取得了
较好效果，虽然工艺稍为繁琐，但操作简单，又能较
好的提高总黄酮的提取率，使总黄酮提取率达到
4. 76%，是传统溶剂提取方法的 2. 2 倍，是一种较高
效的提取方法。
参 考 文 献
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