全 文 ：作者简介:周颖 , 本科 , 中药师;Tel:13877539779;E-mail:yingyoy.zy@163.com
祖师麻注射液指纹图谱的建立及质量相关性研究
周　颖 , 庞兴寿 (广西玉林食品药品检验所 , 玉林　537000)
摘要:　目的 建立祖师麻注射液中紫丁香苷 、祖师麻甲素的含量测定方法 。方法 使用 Agilent ZORBAX
SB-C18色谱柱 , 流动相:乙腈-0.05%磷酸溶液进行梯度洗脱 , 变化检测波长 223 、 327nm , 流速为
1.00mL·min-1 , 柱温为 30℃。结果 利用 2004年 A 版 《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》 计算软件生
成祖师麻注射液指纹图谱 , 共有 17 个特征峰 , 各峰分离度良好 , 符合指纹图谱检测要求。结论 采用
HPLC 指纹图谱技术可以有效地控制祖师麻注射液的质量。
关键词:　祖师麻注射液;HPLC;指纹图谱
中图分类号:R284.1　　文献标识码:A　　文章编号:1002-7777 (2010)03-0289-04
Study on Fingerprint Chromatogram and Quality Determination of Zushima Injection
Zhou Ying and Pang Xing shou(Guangx i Yulin Insti tute fo r Food and Drug Control , Yulin 537000)
ABSTRACT:　 Objective To study and establish the f ing erprint chromatog ram of Zushima Injecton.
Methods A gilent ZORBAX SB-C18 at 30℃.The mobile phase w as consisted of ace tonit ri le-0.05%
pho spho ric acid w ith a g radient o f the solvent minx tures , and w ith change o f detection w avelength at
223nm and 327nm.The f low rate w as 1.00mL · min-1 .Results The standard fingerprints o f Zushima
Injection w as o riginated f rom The Similarity Evaluation fo r Chromato graphic Finge rprint of TCM
(Version 2004 A), and 17 common peaks existed in the fingerprint.Each w as accuracy , stabili ty and
repeatability , and satisf ied to the requirements of fingerprint.Conclusion The HPLC fingerprint method
can be used in the quality cont rol of Zushima Injection.
KEYWORDS:　Zushima Injection;HPLC;fingerprint
　　祖师麻注射液为瑞香科植物黄瑞香的根皮和茎
皮经加工制成的灭菌水溶液。祛风除湿 , 活血止
痛 。用于肢体关节肿胀 、冷痛与刺痛 , 活动屈伸不
利 , 阴雨天加重 , 舌有瘀斑 , 脉沉弦者;风湿性关
节炎 、 类风湿性关节炎属上述症候者 。为确保临床
用药安全有效 , 本试验采用高效液相色谱法建立祖
师麻注射液的 HPLC 指纹图谱分析方法;利用色
谱指纹图谱相似度计算软件 , 对得到的 HPLC 指
纹图谱进行相似度计算;对其主要成分进行定量测
定 。为中成药质量控制提供合理 、可靠 、 简便的方
法模式 。
1　仪器与试药
1.1　仪器
高效液相色谱仪 (Agilent1200 、 DAD 检测
器 、 低压四元泵 、 在线脱气装置 、 自动进样器),
ChemStation工作站 (Agi lent 科技有限公司 , 美
国);电子分析天平 (Mett ler s , 瑞士);超声波清
洗器 (昆山市超声仪器有限公司)。
1.2　试药
紫丁香苷对照品 、祖师麻甲素对照品 (中国药
品生物制品检定所 , 批号:111574-200207 、 0900-
200102)。
乙腈 、磷酸为色谱纯 , 水为娃哈哈纯净水 , 其
他试剂为分析纯 。祖师麻药材 (玉林食品药品检验
所中药室鉴定为正品)。
2　方法与结果
2.1　色谱条件
色谱柱:Ag ilent (4.6mm ×250mm , 5μm ,
289中国药事 2010年第 24卷第 3期
DOI :10.16153/j.1002-7777.2010.03.006
ZORBAX SB-C18);流动相:乙腈 (A)-0.05%磷
酸溶液 (B)梯度洗脱[ 1] , 见表 1;检测波长:见
表 2;流速:1.00mL · min-1 ;柱温:30℃[ 7] ;理
论板数按祖师麻甲素峰计为 8000 , 各主要特征峰
分离度均大于 1.5。
表 1　流动相比例
时间(min) 0 50.00 60.00 120.00 125.00
A(%) 5 7 12 30 40
B(%) 95 93 88 70 60
表 2　检测波长 nm
时间(min) 0 40.00 45.01 125.00
波长 223 223 327 327
2.2　对照品溶液的制备
精密称取祖师麻甲素对照品 12.94mg , 置
25mL 容量瓶中 , 加甲醇适量使溶解并稀释至刻
度 , 摇匀 , 即得。精密称取紫丁香苷对照品
12.37mg , 置 50mL 容量瓶中 , 加甲醇适量使溶解
并稀释至刻度 , 精密量取 2mL 至 25mL 容量瓶中 ,
加甲醇至刻度 , 摇匀 , 即得 。
2.3　供试品溶液的制备
精密量取祖师麻注射液 5mL , 置 10mL 容量
瓶中 , 加水适量 , 超声处理 (功率:160W , 频率:
50kHz)1h , 放冷 , 加水至刻度 , 摇匀 , 滤过 , 滤
液作为供试品溶液 。
2.4　方法学研究
为考察分析方法的可行性 , 以批号为 0701142
的祖师麻注射液为供试品溶液 , 对仪器精密度 、方
法重现性和稳定性作了相应考察 。
2.4.1　精密度试验
取批号 0701142 的祖师麻注射液溶液 , 照
“2.3” 项下方法制备供试品溶液 , 按上述色谱条件
连续进样 6次 , 每次 10μL , 分别考察各共有峰的
保留时间及峰面积 , 结果共有峰的峰面积 RSD 在
0.21%～ 1.03%, 保留时间 RSD 在 0.06% ～
0.87%, 说明仪器精密度良好 。
2.4.2　重现性试验
取批号 0701142 的祖师麻注射液溶液 , 照
“2.3” 项下方法制备供试品溶液 6份 , 按上述色谱
条件分别进样 , 每次 10μL , 分别考察各共有峰的
保留时间及峰面积 , 结果共有峰的峰面积 RSD 在
0.36%～ 1.82%, 保留时间在 0.13%～ 1.25%,
说明重现性良好 。
2.4.3　稳定性试验
取批号 0701142 的祖师麻注射液溶液 , 照
“2.3” 项下方法制备供试品溶液 , 分别在 0 、 3 、
6 、 9 、 12 、 24h 按上述色谱条件分别进样 , 每次
10μL , 分别考察各共有峰的保留时间及峰面积 ,
结果共有峰的峰面积 RSD在 0.56%～ 1.16%, 保
留时间 RSD在 0.21%～ 1.07%, 说明该方法在常
温下 24h内稳定性良好 。
2.5　指纹图谱及技术参数
分别精密吸取供试品溶液 20μL 注入液相色谱
仪 , 记录 125min的色谱图 。将试验数据从安捷伦
工作站导出 , 采用 2004年 A 版 《中药色谱指纹图
谱相似度评价系统》[ 4] (国家药典委员会编)软件
进行数据处理 , 将有代表性的 13批注射液谱图进
行匹配生成对照图谱见图 1 。其中共有 17 个峰 ,
峰 7为紫丁香苷对照品峰 , 峰 8为祖师麻甲素对照
品峰 。紫丁香苷 、祖师麻甲素对照品和样品色图谱
见图 1。
a.紫丁香苷对照品;b.祖师麻甲素对照品;c.样品。
图 1　祖师麻甲素对照品与样品 HPLC 色谱图
2.6　专属性试验
精密称取祖师麻药材粉末 1.03g , 置 10mL 容
量瓶中 , 加水适量 , 超声处理 (功率:160W , 频
率:50kHz)1h , 放冷 , 加水至刻度 , 摇匀 , 滤
过 , 滤液作为祖师麻药材提取溶液 , 按上述色谱条
件进样 , 得祖师麻药材色谱图 。见图 2。
290 中国药事 2010年第 24卷第 3期
图 2　祖师麻药材 HPLC 色谱图
2.7　含量测定结果
2.7.1　线性关系考察
精密吸取紫丁香苷对照品溶液 (0.01979mg ·
mL
-1)1 、 4 、 8 、 16 、 30μL 、 祖师麻甲素对照品溶
液 (0.1035mg · mL-1)1 、 4 、 8 、 16 、 30μL 注入
液相色谱仪 , 记录峰面积 , 以进样量为横坐标 , 峰
面积为纵坐标 , 绘制标准曲线。紫丁香苷对照品回
归方程:
Y =2.9695×103 X-4.2259×10　r=0.9997
线性范围:0.01979 ～ 0.59376μg 。
祖师麻甲素对照品回归方程:
Y =2.9110×103 X-8.6121×102 　r=0.9999
线性范围:0.1035 ～ 3.1050μg 。
2.7.2　精密度试验
分别取紫丁香苷 、 祖师麻甲素对照品溶液 , 各
连续进样 6 次 , 每次 10μL , 测得紫丁香苷含量
RSD为 0.31%, 祖师麻甲素含量 RSD为 0.18%,
表明该方法精密度良好 。
2.7.3　重复性试验
取同一批 (批号:0701142)样品 , 按 “2.3”
项下供试品溶液制备方法分别制备 6 份供试品溶
液 , 按上述色谱条件分别进样 , 每次 10μL , 测得
紫丁香苷含量 RSD 为 0.54%, 祖师麻甲素含量
RSD为 0.23%, 表明该方法重现性良好。
2.7.4　稳定性试验
取同一批 (批号:0701142)样品 , 按 “2.3”
项下供试品溶液制备方法制备 , 分别于 1 、 3 、 6 、
12 、 24h按上述色谱条件分别进样 , 每次 10μL ,
测得紫丁香苷含量 RSD为 0.69%, 祖师麻甲素含
量 RSD为 0.44%, 表明该方法在常温下 24h内稳
定性良好。
2.7.5　回收率试验
精密量取同一批 (批号:0701142)样品
2.00 、 2.50 、 3.00mL 各 2份 , 分别精密加入浓度
为 0.5176mg · mL-1的祖师麻甲素对照品溶液
2.00 、 2.50 、 3.00mL ;加入浓度为 0.2474mg ·
mL-1 的 紫 丁 香 苷 对 照 品 溶 液 0.40 、 0.50 、
0.60mL ;按 “2.3” 项下供试品溶液制备方法制备
并进样 20μL 测定 , 计算 , 祖师麻甲素回收率为
96.53%, RSD 为 0.85%;紫丁香苷回收率为
95.83%, RSD为 0.65%。
2.7.6　样品测定
取本品样品 13批 , 按 “2.3” 项下供试品溶液
制备方法制备并进样 20μL 测定含量 , 见表 3 。
表 3　样品含量测定结果 (n=2)
厂家 批号 祖师麻甲素(mg·mL-1)
紫丁香苷
(mg·mL-1)
山西康意制药有限公司 080327 0.4556 0.0338
山西康意制药有限公司 080111 0.5285 0.0381
山西康意制药有限公司 071014 0.4762 0.0334
山西康意制药有限公司 071215 0.5068 0.0363
山西康意制药有限公司 080124 0.4560 0.0323
万荣三九药业有限公司 0712011 0.4834 0.0368
万荣三九药业有限公司 0712222 0.4583 0.0377
万荣三九药业有限公司 0801071 0.5027 0.0362
万荣三九药业有限公司 0701012 0.4813 0.0331
万荣三九药业有限公司 0801008 0.4578 0.0335
万荣三九药业有限公司 0710311 0.4327 0.0324
万荣三九药业有限公司 0701142 0.5074 0.0386
万荣三九药业有限公司 0801013 0.4798 0.0369
2.8　样品相似度计算
对 13批祖师麻注射液的指纹图谱测定结果分
别导入 《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》 2004
年版[ 4] 计算软件 , 经过数据匹配 , 以平均数法建立
对照指纹图谱 , 并计算得 13 批祖师麻注射液指纹
图谱与对照指纹图谱的整体相似度在 0.842 ～ 1.000
之间。从数据看出 13批祖师麻注射液 HPLC指纹图
谱的相似度良好。结果见表 4和图 3。
表 4　13 批祖师麻注射液图谱
与对照药材图谱的相似度计算结果
厂家 批号 相似度
山西康意制药有限公司 080327 0.898
山西康意制药有限公司 080111 0.842
山西康意制药有限公司 071014 0.910
万荣三九药业有限公司 0712222 0.913
万荣三九药业有限公司 0801071 0.939
万荣三九药业有限公司 0701012 0.883
万荣三九药业有限公司 0801008 0.871
山西康意制药有限公司 071215 0.925
山西康意制药有限公司 080124 0.917
万荣三九药业有限公司 0712011 1.000
万荣三九药业有限公司 0710311 0.932
万荣三九药业有限公司 0701142 0.954
万荣三九药业有限公司 0801013 0.907
对照药材　　　　　　 　 0.753
291中国药事 2010年第 24卷第 3期
图 3　13 批祖师麻注射液图谱与对照药材图谱色谱峰匹配图
3　讨论
批号为 080111的祖师麻注射液与对照指纹图
谱的相似度小于 0.85 , 可能是因为峰面积过高 ,
紫丁香苷 、祖师麻甲素含量比其他批次高的原因。
祖师麻注射液的指纹图谱与祖师麻药材图谱的
相似度为 0.753 , 共有峰 2 、 5 、 6 、 7 、 8 、 9 、 10 、
11 、 12 、 14 、 15 、 16 、 17 一致 , 但其他组分有一
定差异 , 可能是因为注射液在制备过程中除去了药
材部分成分 , 且加入了一些基质所致 。
比较水 、 50%甲醇 、 50%乙醇不同溶剂提取 ,
结果水提取充分;比较不同提取方式和时间 , 结果
超声处理杂质少;且提取 1h 更充分;比较甲醇-
0.5%醋酸水溶液[ 3 , 5] 、乙腈-0.05%磷酸水溶液和
乙腈-0.4%磷酸水溶液[ 6]不同流动相和不同波长检
测对结果的影响 , 结果用乙睛-0.05%磷酸水溶液
梯度洗脱所得分离度最好;同时运用二极管阵列检
测器进行多波长分析 , 经过反复比较紫丁香苷在
223nm、祖师麻甲素在 327nm处色谱峰间分离度 、稳
定性较好 , 综合多种因素最后采用变换波长的方法。
　　曾用不 同型 号色 谱柱 (Hype rsilODS2 、
Eclipse XDB-C18)进行考察 , 结果在不同型号色
谱柱上的保留时间差异比较大 , 但都相对稳定;并
采用 Agi lent1100同法实验 , 结果重现性良好。
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(上接第 288页)三乙胺 (90∶10∶0.2), 此比例
对乙酰氨基酚与杂质峰分离度为 1.64 , 盐酸二氧
丙嗪与对乙酰氨基酚的分离度为 6.77 , 理论塔板
数按盐酸二氧丙嗪计大于 6000。
3.2　提取方法的选择
对供试品进行 3 种不同溶剂提取 , 发现 50%
乙腈溶液只需振摇 15min 即可达到很好的提取效
果 , 此方法操作简便 、 可行 。
3.3　检测波长的选择
分别配制对乙酰氨基酚 、盐酸二氧丙嗪对照品
溶液 , 做 UV 光谱扫描 , 结果对乙酰氨基酚的最
大吸收波长为 246nm , 盐酸二氧丙嗪的最大吸收
波长为 226 、 265nm 。经过试验 , 226nm 波长处分
离效果好 , 最后确定检测波长为 226nm 。
RP-HPLC 法操作简便 , 灵敏度高 , 专属性强 ,
结果准确 , 适用于复方氨酚葡锌片制剂的质量控制。
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292 中国药事 2010年第 24卷第 3期