全 文 ：收稿日期:2010-02-25;　修订日期:2010-08-12
基金项目:海南省重点科技项目(No.070205)
作者简介:赵映淑(1982-), 女(汉族), 甘肃靖远人 , 现为重庆医科大学
2007级药理学在读硕士研究生 ,学士学位 ,主要从事中药药理和新药研究
工作.
＊通讯作者简介:董　志(1962-), 男(汉族),四川合江人 , 现任重庆医科
大学教授 ,博士学位 ,主要从事心血管药理及新药研究工作.
大孔吸附树脂纯化水黄皮根总黄酮的工艺研究
赵映淑 1 ,董　志1＊ ,朱　毅 2 ,陈国彪2 ,储美娜 1
(1.重庆医科大学 ,重庆 400016;　2.海南省药品检验所 ,海南省药物质量研究重点实验室 ,海南 海口 570216)
摘要:目的 研究大孔吸附树脂纯化水黄皮根总黄酮的最佳工艺。 方法 选择 3种不同大孔吸附树脂对水黄皮根总黄酮
进行静态和动态的吸附与解吸;考察上柱原液总黄酮浓度 、流速 、pH和洗脱剂等对水黄皮根总黄酮优化的影响。结果
D101最适于水黄皮总黄酮的纯化 ,最佳工艺为:调节水黄皮根提取液总黄酮浓度为 0.607 1 mg· ml-1 ,调 pH=3, 以 2 ml
· min-1的流速上样 ,以相同速率用适量纯化水洗脱(molish反应阴性)后 , 再用 3BV20%乙醇溶液除杂洗脱 , 最后用 70
%乙醇作为洗脱剂进行洗脱。结论 经 D101大孔吸附树脂分离纯化后 ,水黄皮根总黄酮浓度可达 50 %以上。
关键词:大孔吸附树脂;　水黄皮;　总黄酮;　纯化
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2011.01.075
中图分类号:R284　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2011)01-0154-02
StudyonPurificationofTotalFlavonoidsinRootofPongamiapinnatabybyMacroporos
Resin
ZHAOYing-shu1 ,DONGZhi1＊ ,ZHUYi2 ,CHENGuo-biao2 ,CHUMei-na1
(1.ChongqingUnivercityofMedicalSciences, Chongqing400016, China;2.HainanProvincialInstituteforDrug
Control, HainanProvincialKeyLaboratoryforPharmaceuticalQualityResearch, Haikou, 570216, China)
Abstract:ObjectiveTodevelopamethodforthepurificationoftotalflavonoidsinrootofPongamiapinnatabymacroporous
resinwithmacroporousabsorbingresin.MethodsTheconcentrationoftotalflavonoids, flowrate, pHandelutingagentwerein-
vestigatedbythreekindsofmacroporousresin.ResultsD101 wasthemostsuitablemacroporousresinforthepurificationtechnolo-
gyoftotalflavonoidsinrootofPongamiapinnata.Theconcentrationofloadedsolutionwas0.607 1mg· ml-1(pH=3)witha
flowrateof2 ml· min-1.Theimpuritieswereremovedbyelutingwithpurifiedwater(Molishreactionnegative)and20 %
achohol(3 BV), successively.Thenthepartofelutingwith70 % alcoholwascolected.ConclusionThecontentoftotalfla-
vonoidsinrootofPongamiapinnatawasupto50% withtheoptimalpurificationprocess.
Keywords:Macroporousabsorbingresin;　Pongamiapinnata;　Totalflavones;　Purification
　　水黄皮 Pongamiapinnata(L.)Merr.为豆科水黄皮属的半红
树植物 , 别名水流豆 [ 1] 。目前 ,国内外学者对水黄皮进行了广泛
的研究 , 但主要集中在化学成分和药理研究方面。黄欣碧等 [ 2]
从水黄皮树皮中分离到黄酮 、二氢黄酮 、查耳酮 、二氢查耳酮 、三
萜 、生物碱及氨基酸等 ,其中黄酮类化合物占绝大多数。因此 ,黄
酮类含量的高低就成为考察水黄皮提取物质量的主要指标。查
阅文献资料可知 , 未见对水黄皮提取物进行纯化研究的报道。本
研究选用 D101、AB-8和 X-5等 3种大孔吸附树脂对水黄皮根
提取物进行纯化研究 ,旨在提高提取物中黄酮类的含量 , 确定其
最优纯化工艺。
1　仪器与试药
BS210S型电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司);
ZHWY-200B恒温培养振荡器(上海器械分析仪器制造有限公
司);UV-2010型紫外分光光度计(SHIMADZU);R-502旋转蒸
发器(上海申胜生物技术有限公司);HH-6数显恒温水浴锅(常
州澳华仪器有限公司)。
2　方法与结果
2.1　水黄皮根总黄酮的测定 以水黄皮素为对照 , 采用紫外分光
光度法测定。
2.1.1　测定波长的选择 取水黄皮素对照品溶液 , 以溶剂为空
白 , 于 200 ～ 400nm波长范围内紫外扫描 ,由光谱图表明 ,水黄皮
素在波长 260 nm和 304 nm处有最大吸收。另取水黄皮根总黄
酮提取液 , 在相同条件下经紫外扫描 , 发现在 303 nm处有最大吸
收峰 , 故确定检测波长为 303nm。
2.1.2　标准曲线的绘制 精密称取干燥至恒重的水黄皮素对照
品 6.4 mg于 100 ml容量瓶中 ,用 95 %乙醇溶解并定容至刻度 ,
摇匀 , 即得浓度为 0.064mg· ml-1的水黄皮素储备液。精密量取
该储备液 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0 ml分别于 25 ml容量瓶 , 用
95 %乙醇稀释并定容至刻度 , 摇匀。分别于 303 nm波长处测定
吸光度 , 绘制吸光度 -浓度标准曲线 , 得回归方程 Y=48.616 97
X+0.044 88, r=0.999 9, n=6。结果表明 , 浓度在 5.120 ～
17.920 μg· ml-1范围内线性关系良好。
2.2　纯化工艺研究
2.2.1　树脂预处理 [ 3] 用 95 %乙醇浸泡数小时 , 用大量纯化水
洗净。以湿法在搅拌下将树脂加入到层析柱中 ,等树脂沉降后再
将水放出 ,用 95 %乙醇 3 BV/h通过树脂层 ,至流出液加适量纯
化水无白色浑浊现象 ,再用纯化水以同样的流速洗至中性 , 备用。
2.2.2　水黄皮根提取物的制备 取水黄皮根粗粉 1 kg, 加 60 %
乙醇溶液 15 L回流提取 3次 , 0.5 h/次;合并提取液 , 滤过 ,减压
回收乙醇后静置 ,取上清 , 备用。
2.2.3　静态吸附 称取预处理好的 D101、AB-8和 X-5大孔吸
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时珍国医国药 2011年第 22卷第 1期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VOL.22NO.1
附树脂各 2.0 g, 分别置于具塞三角瓶中 , 加入水黄皮根提取液
25 ml(总黄酮浓度为 1.016 8 mg· ml-1);将三角瓶置于旋转摇
床上震荡 24h,转速为 180 r· min-1 , 充分吸附后滤过 , 测定滤液
中总黄酮浓度 , 计算各种树脂的吸附率。结果见表 1。
2.2.4　静态解吸 将静态吸附后的树脂过滤抽干 , 置于具塞三角
瓶中 , 加入 25 ml90 %乙醇 ,将 3角瓶置于旋转摇床上震荡 24h,
转速为 180 r· min-1 ,待充分解吸后过滤 , 测定滤液中总黄酮浓
度 , 计算各种树脂的解吸率。结果见表 1。
表 1　不同大孔吸附树脂静态吸附与解吸结果
树脂
类型
剩余液中总黄酮
浓度 C/mg· ml-1
吸附率
(%)
解吸液中总黄酮
浓度 C/mg· ml-1
解吸率
(%)
D101 0.621 9 40.61 0.295 74.36
AB-8 0.609 4 38.95 0.295 74.36
X-5 0.631 0 38.05 0.270 68.06
　　n=3
结果表明 , 3种树脂中 D101和 AB-8树脂对水黄皮根总黄
酮的吸附率相近 , 解析率相同 ,为进一步确定最适纯化树脂 ,故同
时选择 D101和 AB-8树脂进行动态吸附与解吸试验 。
2.2.5　动态吸附 取静态吸附优选的处理好的 D101和 AB-8
大孔吸附树脂各 5ml于 1cm×20cm的层析柱内 ,加水黄皮根提
取液(总黄酮浓度为 1.2141 mg· ml-1)于柱顶 , 以 2 ml· min-1
的流速进行动态吸附 , 流出液每 5 ml收集一管 , 于 303 nm处测
定吸光度 , 计算总黄酮含量 , 绘制各树脂的泄露曲线。 结果见
图 1。
图 1　D101和 AB-8动态吸附泄露曲线
结果表明 , 两种树脂中 D101的泄露时间点较 AB-8前 , 但
达到饱和吸附时 , D101的吸附量较 AB-8大。
2.2.6　动态解吸 取处理好的 D101和 AB-8大孔吸附树脂各 5
ml, 装于 1cm×20cm的柱内 , 加水黄皮根提取液 20 ml(总黄酮
浓度为 1.214 1 mg· ml-1)于柱顶 , 以 2ml· min-1的流速进行动
态吸附。吸附后平衡 1 h,同等流速下先用适量水洗脱(Molish反
应阴性),再用 5 BV10 %乙醇洗脱除杂 ,最后用 70 %乙醇洗脱 ,
流出液每 5 ml收集一管 , 于 303 nm处测吸光度 , 计算总黄酮含
量。
图 2　D101和 AB-8动态解吸曲线
由动态解吸曲线可知 , D101大孔吸附树脂动态解吸量明显
大于 AB-8, 可减少洗脱溶剂的用量。结合动态吸附试验 , 选择
D101大孔吸附树脂树脂作为水黄皮根总黄酮的纯化树脂。
2.2.7　上样液 pH对吸附率的影响 精密量取 25ml水黄皮提取
液(总黄酮浓度为 0.566 3 mg· ml-1)6份 , 置于具塞三角瓶中 ,
分别调 pH为 2, 3, 4, 5, 6, 7, 按 “ 2.4”项下用 D101大孔吸附树脂
进行静态吸附试验 ,计算吸附率。结果见表 2。
表 2　pH对吸附率的影响结果
pH值 剩余液中总黄酮浓度 /mg· ml-1
吸附量
/mg· (2g)-1树脂
吸附率
(%)
2 0.207 0 5.772 5 40.77
3 0.207 0 5.782 1 40.84
4 0.230 4 5.629 1 39.76
5 0.246 8 5.536 9 39.11
6 0.275 0 5.360 2 37.86
7 0.2816 5.319 4 35.09
　　n=3
2.2.8　上样液浓度对吸附率的影响 取预处理好的 D101大孔吸
附树脂 3份 , 每份 5ml, 分别装于 1cm×20 cm的层析柱内;取上
样原液 20ml(总黄酮浓度 1.214 1 mg· ml-1)3份 ,分别加水 0,
20, 40ml稀释后调 pH=3,加于柱顶 ,以 2 ml· min-1的流速通过
层析柱吸附。流出液每 5 ml收集一管 , 测吸光度 , 计算吸附率。
结果见表 3。
表 3　上样液总黄酮浓度对吸附率的影响结果
上样液总黄酮浓度 C/
mg· ml-1
黄酮吸附量 C/
mg· (5ml)-1
吸附率
(%)
1.2141 15.327 63.12
0.6071 15.257 63.83
0.3035 14.642 60.30
　　n=3
结果表明 ,当上样液总黄酮浓度为 0.607 1 mg· ml-1时 , 总
黄酮吸附率较大。可能原因是当总黄酮浓度过高时 ,树脂对总黄
酮不能及时吸附而提前泄露 ,使吸附率降低。
2.2.9　上样流速对吸附率的影响 取预处理好的 D101的大孔吸
附树脂 3份 , 每份 5ml, 分别装于 1cm×20 cm的层析柱内;取上
样原液 20 ml(总黄酮含量 1.214 1 mg· ml-1)3份 , 分别以 1, 2, 3
ml· min-1的流速通过 3个层析柱吸附 , 收集流出残液 , 每 5 ml
收集一管 ,测吸光度 , 计算吸附率。结果见表 4。
表 4　上样流速对吸附率的影响结果
上样流速 V/
ml· min-1
黄酮吸附量 C/
mg· (5ml)-1
吸附率
(%)
1 15.128 62.30
2 14.848 61.15
3 14.632 60.26
　　n=3
结果表明 ,上样流速越小 , 总黄酮吸附率越大。但上样流速
为 1 ml· min-1和 2 ml· min-1时 ,结果相差不大 , 为了提高工作
效率 , 选择 2 ml· min-1作为上样流速。
2.2.10　洗脱溶剂的选择 取预处理好的 D101的大孔吸附树脂
4份 , 每份 5 ml, 分别装于 1cm×20 cm的层析柱内;取上样原液
20 ml(总黄酮含量 0.6071 mg· ml-1)4份 , 调 pH=3, 以 2 ml·
min-1的流速通过 4个层析柱吸附 , 以相同速率用适量纯化水洗
脱(molish反应阴性)后 , 各层析柱分别用 30%, 50%, 70%, 90 %
乙醇进行洗脱 ,收集洗脱液 , 用旋转蒸发仪回收乙醇后浓缩 ,浓缩
物干燥至恒重后测含量 ,并计算产物纯度。结果见表 5。
表 5　洗脱溶剂对产物纯度的影响结果 %
洗脱溶剂 纯度
30%乙醇 26.9
50%乙醇 38.6
70%乙醇 58.2
90%乙醇 45.1
　　n=3
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VOL.22NO.1 时珍国医国药 2011年第 22卷第 1期
结果表明 , 随着乙醇浓度的升高 , 产物纯度也随之升高 ,但用
90 %乙醇洗脱时产物纯度反而降低 , 说明 90 %乙醇洗脱能力最
强 , 但杂质随之增多 ,故选择 70%乙醇作为洗脱溶剂。
2.3　放大验证实验 采用优化选择的方法进行了放大验证实验。
结果见表 6。
表 6　验证试验结果
实验
批次
投药量 m/
kg
收膏率
(%)
转移率
(%)
提取物总黄酮
含量(%)
1 10 1.5 81.5 57.6
2 10 1.4 76.9 58.2
3 10 1.4 77.2 58.5
平均值 10 1.4 78.5 58.1
3批中试放大研究结果表明:水黄皮根总黄酮转移率达
78.5 %,提取物中总黄酮含量以水黄皮素计为 58.1 %。表明本
研究的工艺参数可行 ,工艺条件稳定 , 可望过渡到产业化生产。
3　讨论
本研究采用大孔吸附树脂对水黄皮根总黄酮进行了纯化研
究 , 采用静态和动态的吸附与解吸试验确定了 D101大孔吸附树
脂为纯化水黄皮根总黄酮的最适树脂 ,并考察了上柱原液总黄酮
浓度 、流速 、pH和洗脱剂等影响因素 , 最终得出了水黄皮根总黄
酮纯化的优良工艺 , 即:采用 D101大孔吸附树脂 , 调节水黄皮根
提取液总黄酮浓度为 0.607 1 mg· ml-1 , 调 pH=3, 以 2 ml·
min-1的流速上样 ,以相同速率用适量纯化水洗脱(molish反应阴
性)后 ,再用 3 BV20 %乙醇溶液除杂洗脱 ,最后用 70 %乙醇作
为洗脱剂进行洗脱。
本实验均在同一实验室 , 同一温湿度下进行 , 可避免环境因
素引起的误差。通过预实验采用纯化水和低浓度乙醇溶液对糖
类 、蛋白质和多肽等水溶性物质进行除杂 , 洗脱终点采用薄层鉴
别法确认 ,可确保黄酮类物质洗脱完全。
水黄皮根乙醇提取物回收乙醇后会产生不溶物 ,影响纯化效
果 , 但对不溶物进行含量分析后发现含有黄酮类物质 , 故本研究
对水黄皮根提取物适量回收乙醇后进行上样。 乙醇含量高也会
影响树脂的吸附能力 , 所以对上样液的处理需进行进一步的研
究。
参考文献:
[ 1 ] 　江苏新医学院.中药大辞典 [ M].上海:上海人民出版社 , 1977:
538.
[ 2 ] 　黄欣碧 ,龙盛京.半红树植物水黄皮的化学成分和药理作用研究进
展 [ J] .中草药 , 2004, 35(9):1073.
[ 3 ] 　邱如意 ,许　军 ,徐　伟 ,等.大孔树脂分离纯化杏香兔耳风总黄酮
的工艺研究 [ J] .时珍国医国药 , 2009, 20(9):2272.
收稿日期:2010-02-24;　修订日期:2010-08-13
基金项目:云南省教育厅科学研究基金(No.07Y41419);
云南民族大学青年基金科研项目(No.09QN08)
作者简介:杜　刚(1973-),男(汉族),云南个旧人 ,现任云南民族大学化
学与生物技术学院副教授 ,硕士学位 ,主要从事天然产物生物催化研究工
作.
＊通讯作者简介:杨海英(1975-), 女(汉族),云南保山人 , 现任云南民族
大学化学与生物技术学院副教授 ,硕士学位 ,主要从事天然产物化学及仪
器分析研究工作.
几种前处理方法提取丹参中丹参素的比较研究
杜　刚 ,曾　程 ,王倩倩 ,杨海英＊
(云南民族大学化学与生物技术学院 ,民族药资源化学重点实验室 ,云南 昆明　650031)
摘要:目的 提高丹参中丹参素的提取率。方法 在研究常规直接提取法提取丹参素的基础上 , 进行了生物酯酶法 、酸法 、
碱法提取丹参中丹参素的研究 ,采用高效液相色谱(HPLC)方法对样品中的丹参素进行检测。结果 与常规直接提取法
相比 , 3种方法的丹参素提取率均有较大提高 ,其中以碱提取法提高程度最大。结论 实验结果为丹参素的提取制备研究
及工业生产提供了科学依据。
关键词:丹参素;　提取;　酯酶;　酸;　碱
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2011.01.076
中图分类号:R284.2　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2011)01-0156-02
　　丹参为唇形科植物丹参 SalviamiltiorrhizaBge的干燥根及根
茎 , 具有祛瘀止痛 , 活血通经的功效。其水溶性有效成分主要是
以丹参素为代表的丹酚酸类衍生物。丹参素在临床上主要作为
活血化瘀药用于心 、脑 、肝病的治疗 [ 1] 。采用不同处理方法提取
丹参药材中丹参素已屡见报道 [ 2, 3] ,然而结果表明采用常规方法
提取得到的药材提取液中丹参素含量较低 ,不能满足丹参类中药
制剂及开发丹参类新药的需要。 根据丹参药材中酚酸类化合物
相对含量较高 , 其结构中都含有丹参素的结构单元 [ 4] ,本实验在
研究常规直接提取法的基础上 , 分别采用生物酯酶提取法 、酸提
取法 、碱提取法对丹参中丹参素进行提取 , 并用高效液相色谱
(HPLC)法对丹参素进行含量测定 , 以期提高丹参素的提取率 ,
为更好地开发利用丹参药材资源提供科学依据。
1　材料与仪器
1.1　试剂 丹参粉药材(云南鸿翔中草药有限公司);丹参素钠
(购自昆明科翔有限公司 ,纯度≥98%);实验用酯酶液 (由本院
微生物实验室经微生物发酵得到的粗酶液);试剂均为分析纯 ,
水为蒸馏水。用于高效液相色谱法测定的试剂均为色谱纯 ,水为
超纯水 。
1.2　仪器 安捷伦 1100高效液相色谱仪;旋转蒸发仪(R-200,
瑞士 Buchi);超纯水器(arium 611UF, Sartorius);超声波清洗器
(AS3120A,天津瑞森特);电子天平(AdventurerTM, AR2140,上海
奥豪斯公司);离心机(TDL-40B, 上海安亭科学仪器厂);恒温
培养震荡器(ZHWY2102, 上海智城分析仪器制造有限公司)。
2　方法
2.1　酯酶法提取丹参中丹参素 精密称取丹参粉 1.5 g, 加入 5
ml酯酶液 ,于 30℃在仪上振荡 3 h后加入 10 ml甲醇 -水溶液
(50%),超声 30min,离心过滤 , 滤液调 pH值近中性 , 用旋转蒸
发仪浓缩近干 ,将浓缩液转移至 10 ml容量瓶中 , 用甲醇定容 , 备
用。
2.2　碱法提取丹参中丹参素 精密称取丹参粉 1.5 g, 加入 2.0
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时珍国医国药 2011年第 22卷第 1期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VOL.22NO.1