全 文 ：基金项目:北京市自然科学基金(5112010) ;北京市教委科技计划项目(KM200910020001)
作者简介:王树芳 女，硕士。研究方向为果品优质生态安全。E-mail:8246033@ 163． com
* 通讯作者。男，副教授。研究方向为果树生理与生态。Tel:010-80799136，E-mail:liuzhimin600@ sina． com
收稿日期:2012-11-27;修回日期:2013-01-21
抗桃根癌病菌的耐氰放线菌筛选及其抑菌作用研究
王树芳，季敬霖，薛红燕，马焕普，刘志民*
(北京农学院 植物科学技术学院，北京 102206)
摘 要 为了筛选耐氰并抗桃根癌病的微生物菌株，以不同浓度的 KCN培养基作为选择培养基，以根癌农杆
菌为靶标菌，通过平板对峙培养的方法，筛选出了耐氰放线菌 G-19，其发酵液代谢产物对根癌农杆菌有明显的
抑制作用，抑菌圈直径为 21． 66 mm。其抑菌作用主要表现在 3 个方面:使得病原菌的生长对数期缩短，菌体
浓度处于低水平状态;使病原菌的细胞壁弯曲、皱缩，继之结构发生破裂，细胞质向边缘凝聚，中心变得稀薄，
甚至形成空腔;使细胞膜的通透性增加，导致病原菌的细胞质液外泄;但未见到病原菌 DNA的损伤。因此，认
为 G-19 菌株抑菌的作用机理是使根癌病原菌的细胞壁结构破坏和膜透性增加。
关键词 桃树根癌病;耐氰放线菌;筛选;抑菌作用
中图分类号 S432． 4 + 3 文献标识码 A 文章编号 1005 － 7021( 2013) 03 － 0039 － 06
doi: 10． 3969 / j． issn． 1005 － 7021． 2013． 03． 009
Screening of Cyanide-Tolerance Antagonistic Actinomycetes against
Agrobacterium tumefaciens ＆ Its Antimicrobial Action
WANG Shu-fang，JI Jing-lin，XUE Hong-yan，MA Huan-pu，LIU Zhi-min
(Coll． of Plant Sci． ＆ Technol．，Beijing Uni． of Agric．，Beijing 102206)
Abstract In order to select a cyanide-resistant and anti peach crown gall biocontrol bacterium． Antagonistic Actino-
mycetes were isolated by the different concentrations of KCN in culture medium and screened by punching assay． Cya-
nide-resistant and antagonistic Actinomycetes strain G-19 was screened for the bioactivity using Agrobacterium tumefa-
ciens (At)as a target strain through the plating confrontation culture method． The fermentation broth of G-19 had a
high inhibitory effect on At with an inhibition ring at 21． 66 mm in diameter． The bacteriostatic action mainly shown in
follow aspects:the crude extract reduced the growth logarithmic phase of At，and maintained the mycelium density in
a low level． Moreover，the cell wall was curving，wizening，followed by the structure rupture，cytoplasm condensate to
the margin，the center etherealized，even formed a cavity;the membrane permeability increased and cause cellular in-
ner substance of At to release;no damage however on DNA of pathogenic bacteria was seen． Therefore，it can be ad-
judged that the inhibitory effect mechanism of G-19 against At was to destroy the structure of cell wall and to increase
the permeability of cell membrane．
Keywords peach crown gall;cyanide-tolerance actinomycetes;screening;inhibition
桃树根癌病(亦称冠瘿病)是由根癌土壤杆
菌(Agrobacterium tumefaciens)引起的一种世界范
围的植物细菌肿瘤病害［1-3］，我国各地桃树栽培区
均有发生，发病率有的高达 100%［4］。植株一旦
染病，很难治愈，轻则衰弱黄叶，重则死树。生物
防治是一种对果树根癌病有效的防治方法，利用
微生物进行根癌病的生物防治已有不少报道［5］，
但实际应用的并不多。因为桃树根系会分泌一种
93微生物学杂志 2013 年 6 月第 33 卷 第 3 期 JOURNAL OF MICROBIOLOGY Jun． 2013 Vol． 33 No． 3
物质即扁桃甙(氰的配糖体) ，在微生物的作用下
分解为苯甲醛和氢氰酸(HCN)。HCN 对桃树根
系的毒害已被许多研究证明［6-8］，它不仅抑制桃树
根系的呼吸，而且对桃根际微生物的体系产生不
良影响，使有益微生物减少，根系生长不良，容易
遭受涝害、冻害等不利环境的伤害，从而引起根癌
病等根部病害的发生。保持根际微生物的生态平
衡，增加有益微生物的数量是减少根癌病发生的
重要手段。所以筛选适应桃根际土壤有氰环境的
生物菌，在生产中有重要意义。通过多年的研究
从罹根癌病树的根部土壤中筛选出了具有耐氰作
用的放线菌 G-19。经生理生化特性、形态特征及
16S rDNA 分子鉴定表明，此菌属于链霉菌属［9］，
对桃根癌菌具有很好的抑制作用。分析鉴定其抑
菌物质为含糖基的多肽［5］，本文主要报告的是该
菌株的筛选方法及抑菌作用。
1 材料与方法
1． 1 材料
受试菌株 桃根癌农杆菌(Agrobacterium tu-
mefaciens)由中国农业大学提供。
1． 2 方法
1． 2． 1 抗氰放线菌筛选 取桃病根土 10 g，置于
100 mL磷酸缓冲液中(NaCl 8 g，Na2HPO4 1． 44 g，
KH2PO4 0． 24 g，H2O 1 000 mL，pH 7． 2) ，轻微震
荡使土壤充分分散。将上清液分别逐级稀释至
10 －8、10 －4和 10 －2倍。取上述系列土壤悬液，在无
菌条件下，均匀地涂于加有不同浓度氰化钾溶液
的高氏培养基平板上，氰化钾浓度为 10、20 和 40
mg /L，每一个浓度都重复 3 皿，在 28 ℃恒温下培
养。待平板上出现单菌落时，在无菌条件下从平
板上挑取菌落颜色、形态等培养性状不同的放线
菌单菌落，移入加有 0． 3 g /L K2Cr2O7 的改良高氏
培养基平板上，重复筛选，直至所筛菌株在培养基
中的外部形态、菌落颜色等完全一致。
1． 2． 2 根癌菌拮抗放线菌筛选及其生理生化指
标的测定 取上述筛选好的 21 株放线菌菌株各 1
环，置于 150 mL高氏液体培养基中，28 ℃、180 r /
min震荡培养 7 d。挑取 1 环供试菌株根癌农杆
菌于 100 mL 的 LB 液体培养基中，31 ℃、200 r /
min 震荡培养 24 h。取 150 μL供试菌株菌悬液置
于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，涂布均匀，待
干。用灭过菌的打孔器围绕平皿周围打孔，再注
入 100 μL 发酵好的放线菌发酵液，31 ℃恒温培
养 24 h，观察抑菌圈的形成，筛选出抑菌效果最好
的放线菌菌株。①形态特征观察:采用插片法［10］
观察菌株的形态特征。具体方法是在无菌条件
下，将菌株 G19 接种到高氏一号固体培养基上，插
片，在 28 ℃下培养 6 d。然后在电子显微镜下观
察菌株的形态;②培养性状观察:采用国际链霉菌
计划(ISP)和 Waksman 推荐的培养基，在无菌条
件下，分别将菌株 G19 接种在高氏一号培养基、改
良 HV培养基、察氏琼脂、葡萄糖酵母膏培养基、
葡萄糖天冬酰胺琼脂、ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、ISP6
等培养基上，28 ℃培养，7 d 后观察菌株在各种培
养基上的特征;③生理生化特性观察:依据《放线
菌的分类和鉴定》［11］、《链霉菌鉴定手册》［12］对放
线菌菌株 G19 进行各种生理生化特性测定;④分
子手段鉴定:采用 16S rDNA序列分析方法［13］，确
定菌株所在种属。
1． 2． 3 耐氰放线菌有效抑菌物质的粗提 将耐
氰放线菌菌株置于高氏液体培养基中，28 ℃、180
r /min震荡培养 7 d，将发酵液离心(10 000 r /min，
15 min)后得上清液，用无菌滤膜过滤，然后加入
(NH4)2SO4 至 60%饱和度，静置 2 h，10 000 r /min
离心 10 min，取沉淀物置于截流分子量为 8 000 ～
14 000 u的透析袋，在 0． 1 mol /L磷酸缓冲液(pH
7． 0)中透析过夜，然后10 000 r /min 低温离心 10
min，弃不溶物，将上清液冷冻干燥后得粗提物。
利用高效液相色谱仪、中压制备色谱仪、MALDI-
TOFMS等方法，初步确定粗提物中的抑菌物质为
小分子糖基多肽，分子量范围 900 ～ 1 300 u［5］。
1． 2． 4 有效抑菌活性检测 在涂好根癌农杆菌
的平板中，用灭过菌的打孔器围绕平皿周围打孔，
分别 注 入 放 线 菌 原 发 酵 液、放 线 菌 上 清、
(NH4)2SO4 沉淀上清、粗提物、无菌水各 100 μL，
同时以磷酸缓冲液和无菌水做对照，28 ℃恒温培
养 12 h，观察抑菌圈大小。
1． 2． 5 粗提物对根癌农杆菌生长影响的测定
取 1 mL培养 24 h 的根癌农杆菌液体和 8 mL 无
菌水置于 20 mL离心管中，分成 2 组，每组 3 次重
复，其中 1 组每个离心管内加 1 mL 粗提物，另 1
组加 1 mL无菌水为对照。2 组离心管在 28 ℃、
180 r /min 震荡培养 24 h，分光光度计 OD600检测
04 微 生 物 学 杂 志 33 卷
菌体含量变化。
1． 2． 6 粗提物对根癌农杆菌细胞壁形态的测定
分别取上述 1 mL 2 组根癌农杆菌于 1． 5 mL离
心管中，按照付洪兰［14］的方法进行前处理，并电
镜观察菌体细胞壁的形态变化。
1． 2． 7 粗提物对根癌农杆菌细胞膜通透性的测
定 取 6 个 10 mL离心管分别加入 30 μL培养 24
d的根癌农杆菌培养液及 6 mL 无菌水，分成 2
组，1 组加粗提物，1 组加无菌水为对照，28 ℃、
180 r /min震荡培养，分别于 0、6、12、24、48 h测量
电导率，观察对细胞膜通透性的影响。
1． 2． 8 粗提物对对根癌农杆菌 DNA损伤检测
采用单细胞凝胶电泳法(SCGE)检测粗提物对根
癌农杆菌 DNA受损伤情况。实验按照 Kruszewski
等(1998)的方法进行［15］，荧光显微镜观察，如果
DNA有损伤则会有拖尾现象出现。
2 结果与分析
2． 1 耐氰放线菌筛选与抑菌活性检测的结果
从病树根土中经过耐氰筛选得到较纯的放线
菌菌株共 21 株，通过对桃根癌病原菌抑菌活性筛
选，发现序号为 G19 的菌株抑菌作用最明显，抑菌
圈直径为 21． 66 mm，故命名为放线菌 G-19
(图 1)。
图 1 根癌病拮抗放线菌筛选图
Fig． 1 Screening of Actinomycetes against Agrobacterium tumefaciens
粗提物对桃根癌农杆菌的抑菌效果如图 2 所
示，原发酵液和粗提物有较高的抑菌活性;去除菌
体后的上清液和硫酸铵沉淀后的上清液也有一定
的抑菌效果。
图 2 有效活性成分的抑菌活性
Fig． 2 Result of antibacterial experiment
A:发酵液;B:上清液;C:粗提物;D:缓冲液;E:硫酸铵沉淀
后的上清液;F:无菌水
A:The original fermentation liquor;B:Supernatant;C:Crude
extract;D:PBS;E:Supernatant after (NH4)2 SO4 precipitati-
on;F:ddH2O
2． 2 菌株 G-19 的培养特征及生理生化特性
G-19 在高氏一号培养基上，菌落最初为白
色，之后逐渐变为浅灰色，生长良好。气生菌丝有
分支、不断裂、无横隔，孢子椭圆形表面光滑(图
3)。基内菌丝在不同的培养条件下呈现的颜色也
不同。不利用纤维素、甘露醇和甘露糖，不能使牛
奶胨化。将 G-19 的 16S rDNA 序列进行校对，在
GenBank中进行比对，确定 G-19 为链霉菌属，由
于没有与之相似度较高的链霉菌，初步认定 G-19
为一个新菌［9］。
图 3 放线菌 G-19 的生长状态
Fig． 3 Characters of G-19
1:培养状态;2:孢子形态;3:孢子丝形态
1:The colony morphology;2:The spore morphology;
3:The spore chain morphology
2． 3 耐氰放线菌 G-19 代谢产物的抑菌作用
2． 3． 1 对根癌农杆菌生长周期的影响 图 4 显
示，对照组的根癌农杆菌首先出现一个快速生长的
143 期 王树芳等:抗桃根癌病菌的耐氰放线菌筛选及其抑菌作用研究
对数期，其次出现一段时间的稳定期，是一个典型
的 S型生长曲线;而加了粗提物的处理组，根癌农
杆菌也有一个快速增长的过程，但周期明显缩短，随
着时间延长，根癌农杆菌保持较低的生长水平。可
见，粗提物的确抑制了桃根癌农杆菌的菌体生长。
图 4 粗提物对根癌农杆菌生长的影响
Fig． 4 Inhibitory effect of crude extract on growth
of Agrobacterium tumefaciens
2． 3． 2 对根癌农杆菌细胞壁形态及菌体的影响
图 5 显示，对照组菌体细胞表面光滑、饱满，两
端钝圆，细胞壁结构完整，细胞质均一(图 5A、
B) ;而加粗提物 12 h 后，菌体细胞壁明显发生弯
曲、皱缩，有的部位甚至突起(图 5C)。加粗提物
24 h后，细胞体积明显变小而萎缩，细胞受损，细
胞壁发生破裂，在破裂处有细胞质液泄出，细胞质
向边缘凝聚，中心变得稀薄，甚至形成空腔(图
5D)。由此可知，随着时间的延长，根癌杆菌的细
胞壁形态变化加剧。
2． 3． 3 对根癌农杆菌细胞膜通透性的影响 图
6 显示，对照组中，随着根癌农杆菌的生长，电导
率只有小幅度的增加，说明细胞膜的通透性没有
明显改变;而处理组中，从加粗提物后 6 h 开始电
导率明显增加，24 h 后增加幅度更大。说明粗提
物改变了桃根癌农杆菌细胞膜的通透性，甚至可
能使细胞质液外泄，导致电导率大幅增加。
图 5 透射电镜下根癌农杆菌的细胞壁形态及菌体的变化
Fig． 5 Structure of Agrobacterium tumefaciens． Cell wall under transmission electron microscope
A:对照 1，培养 12 h(40 000 ×) ;B:对照 2，培养 24 h(80 000 ×) ;C:粗提物处理 12 h(80 000 ×) ;D:粗提物处理 24 h(80 000 ×)
A:Normal for 12 hours(40 000 ×) ;B:Normal for 24 hours(80 000 ×) ;C:After exposure to crude extract for 12 hours (80 000 ×) ;
D:After exposure to crude extract for 24 hours (80 000 ×)
2． 3． 4 对根癌农杆菌 DNA的影响 单细胞凝胶
电泳后，通过荧光显微镜观察显示(图 7) ，无论在
对照组还是处理组中，根癌农杆菌的 DNA均呈现
规则的圆形，分布均匀，未出现拖尾现象。可见，
粗提物未能损伤到根癌农杆菌的 DNA。
综上所述，粗提物的抑菌机理主要作用在病
原菌的细胞壁和细胞膜上，通过改变其细胞膜的
通透性而抑制其生长，对 DNA没有影响。 图
6 粗提物对根癌农杆菌细胞膜通透性的影响
Fig． 6 Effect of crude extract on cell membrane of A． tumefaciens
24 微 生 物 学 杂 志 33 卷
图 7 根癌农杆菌荧光 SCGE图片
Fig． 7 SCGE of Agrobacterium tumefaciens under fluorescence microscope
A:对照组根癌农杆菌 DNA(4 ×) ;B:处理组根癌农杆菌 DNA(4 ×) ;C:对照组根癌农杆菌 DNA(40 ×) ;D:处理组根癌农杆菌
DNA(40 ×)
A:Normal(4 ×) ;B:After exposure to crude extract (4 ×) ;C:Normal (40 ×) ;D:After exposure to crude extract (40 ×)
3 讨 论
目前对根癌病最有效防治的措施是以农业和
生物防治为主，筛选出高效、适用生产的生防菌是
根癌病生物防治的基础和必要条件。前人在生防
菌的筛选方面做了大量的工作，利用微生物进行
根癌病生物防治也有不少报道，已先后用不同方
法获得了拮抗菌株 K84、MI15、HLB-2、J73、
K1026、E26、H6、WJK84-1 等，对根癌土壤杆菌都
有拮抗作用［5］。但多数生防菌与根癌菌属于同
一个属，在新的分类体系中有的还是同一个种，它
们之间有很多相似或相同的特性。并且，此类生
防菌能否耐受桃树根际的有氰环境尚未见报道。
放线菌 G-19 是从桃根癌病树根土中，以高浓度氰
化钾为筛选条件，筛选出的具有抗氰作用的放线
菌，该菌属于链霉菌属，与根癌菌没有相似的形态
特征，在实验室条件下有明显的抑制效果。因此，
本研究为根癌病生防菌的筛选和田间防治提供了
新的途径。
关于根癌病生物防治的抑菌机理有不少报
道，研究表明 K84 菌株产生的抑制根癌病病原菌
的重要物质是土壤杆菌素 Agrocin84，它主要抑制
病原菌体细胞的 DNA 复制，从而实现防治作
用［16］。此类抑菌素均为一种核苷类似物，通过干
扰核酸的合成而起到抑菌的作用。能防治根癌病
的还有一类物质即细菌素，是在细菌代谢过程中
合成并分泌到环境中的一类对同种或亲缘关系较
近的有抑(杀)作用的蛋白或多肽类物质［17］。它
们通过影响蛋白质的合成而抑制樱桃冠瘿瘤病原
菌 C58［18］。
本研究筛选的拮抗放线菌对病原菌的抑菌作
用机制与上述有所不同，主要是使病原菌生长的
对数期缩短，病原菌细胞膜的通透性增加，细胞受
损萎缩而死亡，而对菌体内的核酸含量变化未产
生影响。
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
23-28．
·写作常识·
英文摘要
GB7713 － 87 规定，为了国际交流，科学技术报告、学位论文和学术论文应附有外文( 多用英文) 题名和摘要。
英文题名以短语为主要形式，尤以名词短语( noun phrase) 最常见，即题名基本上由 1 个或几个名词加上其前置和
(或) 后置定语构成。实词首字母大写，虚词小写( 也有 4 个或 5 个字母以上的虚词首字母大写) 。一般而言，英文摘要
应是中文摘要的转译，所以只要简洁、准确地将中文意译出即可，字数不宜超过 250 个实词为宜。英文摘要时态的运用
也以简练为佳，常用一般现在时、一般过去时，少用现在完成时、过去完成时，进行时态和其他复合时态基本不用。采用
何种语态，既要考虑摘要的特点，又要满足表达的需要。一篇摘要很短，尽量不要混用，更不要在一个句子里混用，应采
用更简洁的被动语态或原形动词开头。
编写时应避免一些常见的错误:①冠词。主要是定冠词 the 易被漏用。The 用于表示整个群体、分类、时间、地名以
外的独一无二的事物、形容词最高级等较易掌握，用于特指时常被漏用。这里有个原则，即当我们用 the 时，听者或读者
确知我们所指的是什么;②数词。避免用阿拉伯数字作首词;③单复数。一些名词单复数形式不易辨认，从而造成谓语
形式出错;④尽量使用短句，因为长句容易造成语义不清;但要避免单调和重复。
44 微 生 物 学 杂 志 33 卷