全 文 ：江苏农业学报(Jiangsu J． of Agr． Sci．) ，2012，28(3) :688 ～ 690
郑开斌，李爱萍，曹奕鸯，等． 蚕豆花左旋多巴液相色谱检测方法的建立［J］．江苏农业学报，2012，28(3) :688-690．
蚕豆花左旋多巴液相色谱检测方法的建立
郑开斌1，2， 李爱萍2， 曹奕鸯3， 郑金贵1
(1．福建农林大学，福建 福州 350002;2．福建省农业科学院作物研究所，福建 福州 350013;3．三明市农业科学研究所，福
建 沙县 365509)
收稿日期:2011-03-28
基金项目:福建省属公益类科研专项(2011R1028-4)
作者简介:郑开斌(1966-) ，男，福建仙游人，博士研究生，研究员。研
究方向:作物品质育种与农产品天然产物。
通讯作者:郑金贵，(E-mail)jgzheng@ fjau． edu． cn
关键词: 蚕豆花;左旋多巴;高效液相色谱
中图分类号: O657． 7 + 2 文献标识码: A 文章编号: 1000-4440(2012)03-0688-03
Development of high performance liquid chromatography for determina-
tion of L-Dopa from Vicia faba flower
ZHENG Kai-bin1，2， LI Ai-ping2， CAO Yi-yang3， ZHENG Jin-gui1
(1． Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China;2． Institute of Crop Sciences，Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou
350013，China;3． Sanming Institute of Agricultural Sciences，Shaxian 365509，China)
Key words: Vicia faba flower;L-Dopa;highperformance liquid chromatography (HPLC)
蚕豆(Vicia faba L．)是豆科一年生草本植物。蚕豆中含
有左旋多巴(L-Dopa)成分［1-3］，它是人和动物体内合成去甲
肾上腺素和多巴胺的前体之一，是经典的抗震颤麻痹药，临
床上用于帕金森氏病的治疗［4-6］。Rocco 等［7］研究认为，蚕
豆不同器官 L-Dopa 含量不同，开花前整株 L-Dopa 含量
0. 24%，叶片 L-Dopa含量 0. 36%，茎中 L-Dopa含量 0. 17%，
根中 L-Dopa含量 0. 35%。蚕豆花的 L-Dopa含量未见报道。
为了更准确地测定蚕豆花左旋多巴的含量，通过比较不同色
谱柱、不同流动相对蚕豆花样品中左旋多巴的分离效果，建
立测定蚕豆花左旋多巴含量的高效液相色谱法(HPLC)。
1 材料与方法
1． 1 仪器及试剂
主要仪器有 Agilent1200 系列液相色谱仪、SHZ-D(Ⅲ)
循环水式真空泵、电热恒温鼓风干燥箱、TP-214 电子天平和
SB-5200DTDN数控超声波清洗器。0. 45 μm 微孔滤膜为上
海兴亚净化材料厂产品。乙腈、甲醇为 HPLC 级，乙酸
(HAc)、甲酸为 GR级，盐酸、磷酸为 AR级，试剂均由国药集
团化学试剂有限公司生产;L-Dopa 标准品购自中国药品生
物制品检定所;蚕豆花采自福建省农业科学院作物研究所福
州试验基地。
1． 2 HPLC色谱条件的确立
1． 2． 1 标准品的制备 精密称取 L-Dopa 标准品 10 mg 置
于 10 ml容量瓶中，用 0. 1 mol /L HAc 溶液溶解，定容至刻
度，摇匀，使之成为浓度为1 000 mg /L的标准贮备液，备用。
1． 2． 2 供试品溶液的制备 蚕豆(品种陵西一寸)样品经
40 ℃干燥 48 h后，用粉碎机粉碎成细粉，过 200 目筛。精密
称取粉末 0. 01 g，置于 10 ml 刻度试管中，加入 0. 1 mol /L
HAc溶液 5 ml，超声波处理 30 min，过滤。取滤液 1. 0 ml加
至 10 ml容量瓶中，用 0. 1 mol /L HAc溶液定容至刻度，即得
供试品溶液。
1． 2． 3 检测波长的确定 对 L-Dopa 进行全波长扫描，根据
L-Dopa的最大吸收峰确定检测波长。
1． 2． 4 色谱柱的选择 在波长 280 nm、流速 1 ml /min、柱温
30 ℃、进样量 20 μl条件下，采用十八烷基硅烷键合硅胶柱，
即 ODS柱(4． 6 mm × 150. 0 mm，5 μm) ，设置 6 种不同的流
动相组合，观察标准品和蚕豆花样品中 L-Dopa 出峰时间和
峰型。6 种流动相组合分别为 CH3 OH∶ 0. 1 mol /L HAc =
5∶ 95、CH3 OH ∶ 0. 1 mol /L HAc = 10∶ 90、CH3 OH ∶ 0. 1
886
mol /L HAc = 20∶ 80、CH3OH∶ 0. 05 mol /L HAc = 5∶ 95、CH3
OH∶ 0. 01 mol /L K2 HPO4 = 5∶ 95 和 CH3 OH∶ 0. 01 mol /L
K2HPO4 = 15∶ 85。
采用 CAPCELL PAK CR 柱(阳离子交换填料 SCX 与
C18 包被型填料按一定比例混合制成的色谱柱) ，在波长
280 nm、流速 1 ml /min、柱温 30 ℃、进样量 20 μl 条件下，以
CH3CN和 0. 1% HCOOH 不同比例(分别为5∶ 95、10∶ 90、
15∶ 85、20∶ 80)为流动相，检测标准品溶液和样品溶液，观
察出峰时间和峰型。
1． 3 HPLC色谱条件的方法学验证
1． 3． 1 线性关系考察 精密移取 4 ml、2 ml、1 ml、500 μl、
250 μl、125 μl、25 μl 的标准储备液分别置于 10 ml 容量瓶
中，用 0. 1 mol /L 乙酸定容至刻度，摇匀，配制成浓度为 160
μg /ml、80 μg /ml、40 μg /ml、20 μg /ml、10 μg /ml、5 μg /ml、1
μg /ml的标准溶液。在方法 1． 2 确立的 HPLC 色谱条件下，
分别测定以上各标准浓度系列样品。以 L-Dopa 浓度(x)为
横坐标，峰面积(Y)为纵坐标作标准曲线，进行线性回归，计
算相关系数。
1． 3． 2 精密度试验 在确立的 HPLC 色谱条件下，进样分
析 80 mg /L标准溶液峰面积，重复进样 6 次，计算峰面积和
相对标准偏差(RSD)。
1． 3． 3 稳定性试验 蚕豆花样品按照方法1． 2． 2制成供试
品溶液，在常温下分别放置 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h 和 24
h，按照上述确立的 HPLC 色谱条件，分别进样分析 L-Dopa
峰面积，计算峰面积平均值和相对标准偏差。
1． 3． 4 重现性试验 取同一批采集的蚕豆花样品，分别制
成供试品溶液 6 份，在上述色谱条件下，分别测定其 L-Dopa
的含量，计算相对标准偏差。
1． 3． 5 加样回收率试验 精密称取已知 L-Dopa 含量的蚕
豆花样品 0. 01 g共 6 份，置于 10 ml 刻度试管中，再分别用
移液管精确移入标准品储备液，分别加入提取液并定容至
10 ml，按方法 1． 2． 2 中的方法提取，按确立的 HPLC 色谱条
件进样分析，计算平均加样回收率和相对标准偏差。
2 结果与分析
2． 1 色谱条件的确定
2． 1． 1 检测波长的确定 对 L-Dopa 进行全波长扫描，扫描
结果显示 L-Dopa 在 280 nm 处有最大紫外吸收，因此确定
280 nm作为 HPLC测定 L-Dopa的检测波长。
2． 1． 2 ODS 色谱柱使用效果 已有的文献［8-10］报道显示，
利用 HPLC法测定植物样品中 L-Dopa含量常采用 ODS色谱
柱(十八烷基硅烷键合硅胶填料)。本试验采用 ODS色谱柱
在波长为 280 nm、流速为 1 ml /min、柱温 30 ℃、进样量 20 μl
条件下，以不同组成和比例的流动相分析标准品溶液和蚕豆
花样品溶液，试验结果见表 1。由表 1 可以看出，在 CH3OH
和 0. 1 mol /L HAc的组合中，两者的比值越低，保留时间越
长;当比值为5∶ 95 时标准品峰型和样品峰型均较好，而当
比值为10∶ 90 和20∶ 80 时，标准品峰型和样品峰型均不理
想。降低 HAc浓度，在比值为 5∶ 95 条件下，保留时间变化
不大，标准品峰型较好，样品峰型较差。在 CH3 OH 和 0. 01
mol /L K2HPO4的组合中，两者比值越低，保留时间越长;在
比值为 5∶ 95 时标准品峰型和样品峰型均较好。虽然在流
动相为 CH3 OH∶ 0. 1 mol /L HAc = 5∶ 95 和 CH3 OH∶ 0. 01
mol /L K2HPO4 = 5∶ 95 条件下，样品和标准品的峰型均较
好，但由于保留时间均在 2 min 左右，样品的目标峰与杂质
峰可能不能有效分离，进而影响测定结果的准确性。
表 1 不同流动相条件下 ODS柱对 L-Dopa的分离效果
Table 1 Effects of different eluents on the separation of L-Dopa using ODS column
流动相组成 比值 保留时间 (min) 标准品峰型 样品峰型
CH3OH∶ 0． 1 mol /L HAc 5∶ 95 1． 952 较好 较好
CH3OH∶ 0． 1 mol /L HAc 10∶ 90 1． 697 一般 差
CH3OH∶ 0． 1 mol /L HAc 20∶ 80 1． 547 一般 差
CH3OH∶ 0． 05 mol /L HAc 5∶ 95 2． 005 较好 较差
CH3OH∶ 0． 01 mol /L K2HPO4 5∶ 95 2． 328 较好 较好
CH3OH∶ 0． 01 mol /L K2HPO4 15∶ 85 1． 682 较好 －
“ －”:未观察到样品中的目标峰。
2． 1． 3 CAPCELL PAK CR 色谱柱使用效果 在波长 280
nm、流速 1 ml /min、柱温 30 ℃、进样量 20 μl条件下，以不同
比例 CH3CN和 0. 1% HCOOH 为流动相分析标准品溶液和
样品溶液。结果显示，当流动相组成 CH3 CN ∶ 0. 1%
HCOOH =5∶ 95 时，保留时间为 7. 18 min，标准品和样品峰
型均较好，蚕豆花样品目标峰与杂质峰分离良好;当两者比
值为10∶ 90、15∶ 85 和20∶ 80 时，保留时间分别为 7. 092
min、7. 398 min和 7. 988 min，标准品峰型较好，但样品峰型
一般。
2． 1． 4 蚕豆花左旋多巴 HPLC检测的色谱条件的建立 根
986郑开斌等:蚕豆花左旋多巴液相色谱检测方法的建立
据上述试验结果，确定蚕豆花左旋多巴 HPLC检测的色谱条
件为:色谱柱为 CAPCELL PAK CR 柱(150． 0 mm × 4. 6 mm，
5 μm) ，流动相为 CH3CN∶ 0. 1% HCOOH = 5∶ 95，流速 1. 0
ml /min，检测波长 280 nm，柱温 30 ℃，进样量 20 μl。流动相
使用前经 0. 45 μm滤膜过滤。
2． 2 蚕豆花左旋多巴 HPLC检测方法的验证结果
2． 2． 1 线性关系 按照建立的 HPLC 色谱方法对浓度分别
为 160 μg /ml、80 μg /ml、40 μg /ml、20 μg /ml、10 μg /ml、5
μg /ml、1 μg /ml的标准溶液进行检测，以 L-Dopa 浓度(x)为
横坐标，峰面积(Y)为纵坐标作标准曲线，进行线性回归，得
到 L-Dopa浓度-峰面积方程如下:Y = 9 205． 3x － 4 506． 7，r2
= 0． 999 9。说明 L-Dopa 标准品在浓度 1 μg /ml至 160
μg /ml范围内具有良好的线性关系。
2． 2． 2 精密度 在建立的 HPLC 色谱条件下，重复进样分
析 80 mg /L标准溶液 6 次，结果显示，6 次平均峰面积为
895. 4，相对标准偏差(RSD) = 0. 65%，表明精密度良好。
2． 2． 3 稳定性 在建立的 HPLC 色谱条件下，蚕豆花样品
溶液分别于制成后 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24h进样分析，
结果表明，L-Dopa平均峰面积 446． 8，溶液稳定性相对标准
偏差(RSD)= 1. 25%，表明样品溶液在 24 h内稳定性良好。
2． 2． 4 重现性 按照上述色谱条件，对同一批采集的陵西
一寸蚕豆花样品分 6 次进行 L-Dopa 含量测定，结果表明，6
份蚕豆花样品 L-Dopa 含量均值为 8. 11%，RSD = 1. 9%，表
明该色谱方法重复性较好。
2． 2． 5 加样回收率 按上述色谱条件进行加样回收率试
验，结果显示，平均加样回收率为 98. 99%，RSD 为 1. 01%，
满足该方法对加样回收率的要求。
3 讨 论
与前人的研究结果不同，本试验在以 CH3 OH 和 0. 1
mol /L HAc为流动相、以 ODS柱为色谱柱进行蚕豆花 L-Do-
pa含量检测时，未能获得理想的分离效果，出峰时间短，目
标峰与杂质峰无法分离，原因可能是蚕豆花的组分与前人分
析的植物样品组分不同。利用 CAPCELL PAK CR 色谱柱，
结合 CH3CN和 0. 1%HCOOH作为流动相，蚕豆花中 L-Dopa
分离良好，峰型良好，目标峰与杂质峰明显分开。
本试验建立的 HPLC色谱方法中，L-Dopa标准曲线的相
关系数 r2 = 0． 999 9，精密度相对标准偏差(RSD)= 0. 65%，
稳定性试验 RSD = 1. 25%，重现性试验 RSD = 1. 9%，加样回
收率试验 RSD = 1. 01%。说明 L-Dopa 在进样浓度为 1
μg /ml至 160 μg /ml范围内线性关系良好，精密度、稳定性良
好，试验方法重现性较好，加样回收率满足 HPLC 分析方法
的要求。表明本试验建立的色谱方法适合作为蚕豆花 L-Do-
pa含量的定量分析方法。
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(责任编辑:张震林)
096 江 苏 农 业 学 报 2012 年 第 28 卷 第 3 期