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祖师麻止痛喷雾剂的制备工艺



全 文 :Chinese Journal of New Drugs 2012,21(21)
2562
中国新药杂志 2012 年第 21 卷第 21 期
[基金项目] 全军医药卫生科研基金(06MA088)
[作者简介] 赵兴红,男,主任药师,主要从事中药开发与中药标准
化研究。联系电话:(0931)8976012,E-mail:baiyi_yao@ 163. com。
[通讯作者] 张建春,女,主任药师,主要从事药物新剂型及中药制
剂研究。联系电话:(0931)8993383,E-mail:zjc1508@ 126. com。
·实验研究·
祖师麻止痛喷雾剂的制备工艺
赵兴红1,何家田1,涂宏海2,张建春3
(1 兰州军区药品仪器检验所,兰州 730050;2 新疆军区药品仪器检验所,乌鲁木齐 830063;
3 中国人民解放军第一医院,兰州 730030)
[摘要] 目的:研究祖师麻止痛喷雾剂的最佳制备工艺。方法:用家兔的皮肤刺激性试验来评价祖师
麻药材提取物的去毒效果;以祖师麻甲素为指标,用正交试验法优化祖师麻的提取工艺;用水蒸气蒸馏法确
定丁香、当归、肉桂挥发油的最佳提取时间;考察不同浓度乙醇的溶解效果来确定最佳的成型溶媒。结果:未
观察到祖师麻提取物有皮肤刺激性;祖师麻最佳提取工艺为:用 13 倍量的水提取 3 次,每次 1. 5 h;丁香、当
归、肉桂挥发油的最佳提取时间分别为:36,28,36 h;80%乙醇为最终成型溶媒。结论:该制备工艺稳定、可
行,为祖师麻止痛喷雾剂的制备提供了理论依据。
[关键词] 祖师麻止痛喷雾剂;祖师麻;制备工艺;正交试验;祖师麻甲素
[中图分类号] R943. 1 [文献标志码] A [文章编号] 1003 - 3734(2012)21 - 2562 - 04
Study on preparation of Zushimazhitong spray
ZHAO Xing-hong1,HE Jia-tian1,TU Hong-hai2,ZHANG Jian-chun3
(1 Institute for Drug Control of Lanzhou Military Region,Lanzhou 730050,China;2 Institute for Drug Control
of Xinjiang Military Region,Urumqi 830063,China;3 The First Hospital of PLA,Lanzhou 730030,China)
[Abstract] Objective:To study the best preparation technology of Zushimazhiton spray. Methods:The
skin-stimulating test on rabbits was used to evaluate the detoxicating effect of daphne giraldii nitsche extract. The
extracting technology for Zushimazhiton spray was optimized by orthogonal design with the contents of daphnetin.
Wet distillation was carried out to determine the best extracting time of volatile oil from caryophyllus,angelica root
and chinese cinnamon. The dissolved result from alcohol of different concentration was investigated to determine the
preparation solvent. Results:Skin stimulation was not observed. The optimum extraction conditions were as follows:
extracting daphne giraldii nitsche thrice (1. 5 h / time)by water decoction with 13 times amount of water. The best
extracting time of volatile oil from caryophyllus,angelica root and chinese cinnamon was 36,28 and 36 h respective-
ly. Alcohol (80%)was the preparation solvent. Conclusion:This optimized extracting technology of Zushimazhi-
ton spray is stable and feasible,and it provided theoretical basis for the production of Zushimazhiton spray.
[Key words] zushimazhiton spray;daphne giraldii nitsche;preparation;orthogonal design;daphnetin
祖师麻为瑞香科(thym elaeaceae)瑞香属植物
黄瑞香的根皮和茎皮,在我国主要分布在陕西、甘
肃、四川、宁夏、青海等。祖师麻主要具有祛风除湿、
止痛散瘀之功效[1 - 2]。祖师麻止痛喷雾剂是对传统
中药材祖师麻采用现代比较成熟的透皮吸收促进剂
(肉桂油、樟脑、氮酮、丙二醇、薄荷脑等)研究开发
的新型透皮制剂,具有活血化瘀、蠲痹止痛、祛风除
湿功效,用于治疗血瘀气滞的跌打损伤,软组织挫
伤,肌肤筋骨肿胀疼痛等症。祖师麻主要活性成分
为祖师麻甲素(瑞香素)、祖师麻乙素(瑞香苷)、祖
师麻丙素(紫丁香苷) ,其中祖师麻甲素具有明显的
镇痛、抗炎、抑菌、中枢神经抑制作用等药理作
用[3 - 5],故本实验以祖师麻甲素含量为指标考察提
取工艺。由于祖师麻中含有瑞香毒素(daphnetox-
in) ,可引起皮肤过敏的不良反应,因此,本实验主要
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从祖师麻药材提取物去毒、祖师麻提取工艺优选、挥
发油提取时间考察、不同浓度乙醇的成型工艺等方
面进行研究。
材 料
岛津 Prominence 高效液相色谱仪(包括 LC
20AT泵、SIL 20A 自动进样器、SPD 20A UV
VIS检测器、CTO 10AS vp 柱温箱、FCV 11AL 溶
剂切换阀、DGU 20A3 脱气单元、LC Solution 化学
工作站,日本岛津公司) ;AB135 S 梅特勒电子分
析天平(瑞士梅特勒-托利多上海有限公司) ;
SK5200LH型超声波清洗器(上海科导超声仪器
厂) ;分析天平(北京 Sartorius BL121SS) ;UPT I
10 超纯水机(成都超纯科技有限公司) ;喷雾瓶(四
川金泰医药包装有限公司,规格:20 mL)。
祖师麻提取物(甘肃省药物研究所) ;不含祖师
麻的阴性提取物(按祖师麻止痛喷雾剂处方比例称
取除祖师麻之外的其余各味药材,按祖师麻提取物
的制备方法制得的提取物,甘肃省药物研究所) ;祖
师麻甲素(瑞香素 daphnetin,批号:110900-200405,
含量测定用,中国食品药品检定研究院)。
家兔(大耳白种白色) ,体重 2. 0 ~ 2. 5 kg,SPF
级,雌雄各半,由甘肃中医学院实验动物中心提供,
合格证号:SCXK(甘)2004-001。
方法与结果
1 祖师麻药材脱毒效果评价实验
1. 1 刺激性试验[6] 采用同体左右两侧自身对比
的方法。将 8 只家兔随机分为 2 组,每组 4 只。第 1
组为完整皮肤组、第 2 组为破损皮肤组。动物给药
前 24 h背部脊柱两侧去毛(手术剪刀剪毛后,用 8%
硫化钠脱毛)。去毛面积约为体表面积的 10%,去
毛后 24 h检查去毛皮肤是否因去毛而受伤,受伤的
皮肤不宜作完好皮肤的刺激实验。左侧去毛区涂祖
师麻提取物(祖师麻甲素含量 4. 28 mg·g -1)1 mL,
右侧涂赋形剂(70%乙醇、丙二醇 2. 4 ∶ 1的混合溶
液)作为对照,先覆以聚乙烯薄膜,防止液体挥发,
再用无刺激性纱布固定,每只动物分笼饲养。给受
试物 24 h后,用温水或无刺激性洗涤剂去除残留
受试物,去除受试物后 1,24,48,72 h 肉眼观察和
病理组织学检查并记录涂抹部位有无红斑和水肿
等反应。
结果表明,祖师麻提取物对完整皮肤和破损皮
肤家兔的活动、食欲、粪便、眼、鼻等分泌物均无任何
影响,局部皮肤颜色正常,未见刺激性反应。皮肤涂
药区域按皮肤刺激计分标准统计,结果为无刺激性。
2 样品中祖师麻甲素的含量测定[7 -10]
2. 1 色谱条件 色谱柱:Shim-pack VP-ODS(150
mm ×4. 6 mm,5 μm) ,以十八烷基硅烷键合硅胶为
填充剂;流动相:甲醇-0. 5%醋酸(30∶ 70) ;流速:1. 0
mL·min -1;检测波长:327 nm;柱温:室温;进样量:
10 mL。
2. 2 对照品溶液的制备 精密称取在 60 ℃真空干
燥至恒重的祖师麻甲素对照品 5. 45 mg,置 10 mL容
量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,制得每 1 mL
含 54. 5 μg的对照品溶液。
2. 3 供试品溶液的制备 精密称取祖师麻提取物
0. 5 g,置具塞锥形瓶中,精密加入 50 mL 上述流动
相溶解,称定重量,超声提取 30 min,放冷,再称定重
量,用流动相补足减失的重量,摇匀,用 0. 45 mm 微
孔滤膜滤过,即得。
2. 4 阴性样品溶液的制备 取不含祖师麻的阴性
提取物,按“2. 3”项下方法操作,即得。
2. 5 系统适用性 精密吸取供试品溶液、阴性样品
溶液及对照品溶液各 10 mL,按“2. 1”项下色谱条件
进样,得 HPLC 图谱见图 1。图谱表明样品中其他
成分对祖师麻甲素的测定无干扰。理论塔板数按祖
师麻甲素峰计算 > 2 000,色谱分离度 > 1. 5。
1 祖师麻甲素
图 1 阴性样品溶液(A)、对照品溶液(B)和供试品溶液(C)的 HPLC图谱
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2. 6 线性关系考察 精密吸取对照品溶液 1. 0,
2. 0,3. 0,4. 0,5. 0,6. 0,7. 0,8. 0,9. 0,10. 0 mL,置
10 mL量瓶中加流动相稀释至刻度,摇匀,用 0. 45
mm的滤膜过滤,各进样 10 μL,按上述色谱条件测
定峰面积,以峰面积(A)为纵坐标,对照品浓度
(C,μg·mL -1)为横坐标,得回归方程为:A =
43 948C - 12 853 . 02,r = 0. 999 9。表明祖师麻甲
素在 5. 45 ~ 54. 50 μg·mL -1范围内具有良好线性
关系。
2. 7 稳定性 取供试品溶液在 0,2,4,6,8,10,12 h
分别进样 10 μL,记录峰面积并计算出 RSD 为
1. 34%,可见供试品溶液在 12 h内稳定。
2. 8 精密度 取对照品溶液,每次进样 10 μL,重
复进样 6 次,测得峰面积,并计算出 RSD为 0. 95%。
2. 9 重复性 按“供试品溶液的制备”方法,对同
一批样品分别制备 5 份供试品溶液,各进样 10 μL,
测定峰面积,峰面积的 RSD为 1. 0%,结果证明重现
性良好。
2. 10 加样回收率 取已测知含量的祖师麻提取
物 6 份,每份 0. 25 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,
分别加入适量的对照品溶液,按“2 . 3”项下方法操
作,制得供试品溶液,各取 10 μL,HPLC 进样测定,
计算回收率,得其平均值为 101. 60%,RSD 为
2. 66%。
2. 11 样品含量测定 按处方比例称取祖师麻等药
材 9 份,以 L9(3
4)正交表进行试验。提取物按
“2. 3”项下方法制备供试品溶液,同上述色谱条件
测定。结果见表 2。
3 祖师麻提取工艺优选[11]
3. 1 正交试验 以提取次数、水的用量、提取时间
3 个主要因素作为正交试验的考察因素,并以祖师
麻甲素的含量作为评价指标,按 L9(3
4)正交表安排
试验,见表 1。正交试验结果见表 2,方差分析见
表 3。
表 1 正交试验因素水平表
水平
因 素
提取次数(A)/次 水的用量(B)/倍 提取时间(C)/h
1 1 10 1. 0
2 2 13 1. 5
3 3 16 2. 0
表 2 正交试验设计及结果分析
试验号
因 素
A B C D(空白)
祖师麻甲素
/mg·g - 1
1 1 1 1 1 3. 67
2 1 2 2 2 4. 27
3 1 3 3 3 3. 60
4 2 1 2 3 2. 87
5 2 2 3 1 2. 77
6 2 3 1 2 2. 60
7 3 1 3 2 3. 73
8 3 2 1 3 4. 23
9 3 3 2 1 4. 00
K1 11. 54 10. 27 10. 50 10. 44
K2 8. 24 11. 27 11. 14 10. 60
K3 11. 96 10. 20 10. 10 10. 70
珋k1 3. 85 3. 42 3. 50 3. 48
珋k2 2. 75 3. 76 3. 71 3. 57
珋k3 3. 99 3. 40 3. 37 3. 57
R 1. 24 0. 36 0. 34 0. 09
表 3 祖师麻甲素含量方差分析
方差来源 离差平方和 自由度 方差 P值
A 2. 767 2 2 1. 383 6 < 0. 01
B 0. 238 9 2 0. 119 5 < 0. 05
C 0. 183 5 2 0. 091 8 > 0. 05
误差 0. 011 5 2 0. 005 8
从表 2的正交试验结果可以确定祖师麻提取工
艺的最佳方案为:A3B2C2,即用 13 倍量的水提取 3
次,每次 1. 5 h,从 R值直观分析可知,A,B,C这 3 个
因素对祖师麻甲素的提取率影响大小为 A > B > C。
从表 3方差分析表中可以得出提取次数对提取效果
影响最显著,其次是水的用量,提取时间的影响最小。
3. 2 最佳工艺放大验证 取 10 倍处方量的药材,
按照上述最佳工艺进行提取,结果见表 4,可见祖师
麻甲素含量均处于较高水平,说明该提取工艺合理、
稳定、可行。
表 4 验证试验结果
样品 药材量 / g 祖师麻甲素 /mg·g - 1
1 714 4. 12
2 714 4. 40
3 714 4. 28
4 挥发油提取时间的确定
4. 1 丁香油提取时间的确定 称取丁香适量,加入
2 000 mL水,水蒸汽蒸馏,每隔 4 h 记录挥发油蒸出
量。结果显示提取 36 h 为最适宜时间,得到约
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26 mL 挥发油,延长蒸馏时间并不会继续增加丁香
油的馏出量。
4. 2 肉桂油提取时间的确定 称取肉桂适量,加入
2 000 mL水,水蒸汽蒸馏,每隔 4 h 记录挥发油蒸出
量。结果显示提取 36 h为最适宜时间,得到约 3 mL挥
发油,延长蒸馏时间并不会继续增加肉桂油的馏出量。
4. 3 当归挥发油提取时间的确定 称取当归适量,
加水 5 000 mL,水蒸汽蒸馏法提取挥发油,每隔 4 h
记录挥发油蒸出量。结果显示提取 28 h 为最适宜
时间,得到约 2 mL 挥发油,延长蒸馏时间并不会继
续增加当归挥发油的馏出量。
5 成型工艺研究
称取祖师麻提取物适量溶于 20 mL 溶媒中,溶
解,过滤,得滤液;量取 20 mL溶媒,依次加入丁香油、
肉桂油、当归油、樟脑 3 g,薄荷脑 2. 5 g,边加边搅拌,
待全部溶解后,与祖师麻提取物滤液合并,混匀,再加
入氮酮 2. 5 mL,丙二醇 15 mL,边加边搅拌,最后加入
溶媒至 100 mL,搅匀,即得。结果表明,以 60%乙醇
作为溶媒时,薄荷脑溶解不完全,且放置易出现分层
现象;而以 80%乙醇作溶媒,溶解完全,且放置未出现
分层现象,因此,选择 80%乙醇作为成型溶媒。
6 祖师麻止痛喷雾剂制备工艺[12 -13]
按处方量称取各味药材,将丁香、肉桂及当归分
别用水蒸汽蒸馏法提取挥发油;将祖师麻、生姜、甘
草加 13 倍量水煎煮 3 次,每次 1. 5 h,过滤,合并滤
液,浓缩至相对密度为 1. 2 ~ 1. 3 的清膏,加 95%乙
醇使含醇量达到 60%,充分搅拌,放置过夜,弃去沉
淀,取上清液,回收乙醇,浓缩至相对密度为 1. 3 的
稠膏,将稠膏溶于 80%乙醇 200 mL 中,过滤,得滤
液;量取 80%乙醇 200 mL,依次加入丁香油、肉桂
油、当归油、樟脑、薄荷脑,边加边搅拌,待全部溶解,
与以上滤液合并,混匀,再加入氮酮,丙二醇,边加边
搅拌,最后加入 80%乙醇至 1 000 mL,搅匀,过滤,分
装,灌装入喷雾剂瓶中,即得。
7 质量控制[14]
按《中华人民共和国药典》2010 年版一部附录喷
雾剂项下的规定进行喷射试验,测得每瓶每揿平均喷
射量为 0. 08 ~0. 15 g。使用时,每次 3 ~6喷,一日2 ~
3 次。其他项目也均符合《中华人民共和国药典》
2010年版一部附录喷雾剂项下有关的各项规定。
讨 论
祖师麻药材脱毒研究中也考察过用二氯甲烷萃
取代替 95%乙醇沉淀的方法,所得稠膏的皮肤刺激
性试验结果表明,两种方法无明显区别;但小鼠镇痛
试验结果表明,95%乙醇沉淀法所得稠膏的镇痛效
果更好,所以,确定本研究“1. 1”项下提取方法为去
毒提取方法。
本实验考察了 70%乙醇与水两种提取溶媒对提取
工艺的影响,以浸膏收率和祖师麻甲素含量作为评价
指标。其结果,两种溶媒提取的药液,主要有效成分祖
师麻甲素的含量差异不大,而 70%乙醇提取的浸膏
收率低于水提取,为了降低生产成本,选择水提工艺。
以祖师麻为主要成分研制及上市的药物剂型主
要有祖师麻风湿膏、祖师麻醑剂、祖师麻缓释微丸、
祖师麻片剂、祖师麻注射剂及复方祖师麻长效止痛
剂等,而有关祖师麻喷雾剂型作者尚未见报道。由
于中药喷雾剂具有制备简单、起效快、剂量小、使用
安全、携带方便等特点,并具有靶向定位作用[15],合
理开发和应用喷雾剂,可以满足治疗急症的要求,因
此研制开发祖师麻止痛喷雾剂,可以达到局部用药、
起效迅速、避免药物的首过效应和减少不良反应的
效果,为祖师麻的临床使用提供新剂型。
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编辑:周卓 /接受日期:2012 - 05 - 21