全 文 ：祖师麻药材 HPLC指纹图谱的建立
任燕冬 1 , 　杨武亮 1 , 　李越峰1 , 　宋宏杉 1 , 　杨世林 2
(1. 江西中医学院 ,江西 南昌 330004;2. 中药固体制剂制造技术国家工程研究中心 ,江西 南昌 330006)
收稿日期:2006-02-12
作者简介:任燕冬(1979～ ),女 ,硕士生 ,主要从事中药质量标准研究工作。
关键词:祖师麻;高效液相色谱法;指纹图谱;质量控制
摘要:目的:建立祖师麻药材的高效液相指纹图谱 ,为祖师麻的鉴别及品质控制提供依据。方法:用 RP-HPLC法对不同
来源的祖师麻药材进行指纹图谱研究;色谱柱为 Dikm a D iam onsil C18 4. 6 mm ×200 mm , 5 μm, 柱温为 35°C, 流速为 1. 0
mL /m in, 检测波长为 326 nm , 以乙腈和 0. 05 的磷酸水溶液进行梯度洗脱。结果:H PLC指纹图谱中祖师麻主要有效成
分均得到很好分离 , 根据相似度分析处理结果 , 18种不同来源的祖师麻药材有 17个共有峰 , 且相似度较好。结论:本方
法可用于建立祖师麻药材的指纹图谱 ,且简便 、可靠 、重现性好。
中图分类号:R944. 2+7　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-1528(2007)05-0727-04
　　由于受产地 、气候和生态环境等的影响 ,中药材
中主要成分差异较大 ,仅针对其中某一个成分进行
定性定量分析 ,并不能有效地控制中药材或中成药
的质量 。指纹图谱是指某种 (或某产地 )中药材或
中成药中所共有的 、具有特异性的某类或数类成分
的色谱或光谱的图谱 。其特点在于:①通过指纹图
谱的特异性 ,能有效鉴别样品的真伪或产地;②通
过指纹图谱主要特征峰的含量或比例的制定 ,能有
效控制样品的质量 ,确保样品质量的稳定性 [ 1] 。祖
师麻是瑞香科植物黄瑞香 Daphne g iraldii N itsche、
陕甘瑞香 Daphne tangutica Max im或凹叶瑞香 Daph-
ne retusa Hem sl的干燥茎皮及根皮 [ 2] 。春秋二季采
收剥取 、干燥。为民间常用中草药。其主要有效成
分为祖师麻甲素 (即瑞香素 , Daphnetin),具有镇痛 、
镇静 、消炎等作用 ,主要用于风湿痹痛 ,关节炎 ,类风
湿性关节炎痛。本实验利用 HPLC研究了祖师麻中
香豆素类成分 , 制定了祖师麻香豆素类成分的
HPLC指纹图谱 ,为祖师麻的真伪鉴别和质量监控
提供依据 。
1　仪器与试剂
　　Ag illen t1100高效液相色谱仪:四元泵 、柱温箱 、
MVD(和 DAD)检测器 、Agillen t1100色谱工作站;电
子分析天平 AE240(十万分之一 ,瑞士 , METTLER-
TOLEDO Co. );CQ250超声波清洗器 (上海超声波
仪器厂);UV-3000(日本日立公司 )。
祖师麻甲素 (瑞香素 Daphne tin, 编号:0900-
200102,含量测定用);祖师麻对照药材(批号:1243-
0301),均购于中国药品生物制品检定所 。乙腈为
色谱纯(Merk Co. ),水为双蒸水 ,其它试剂均为分
析纯 。
祖师麻药材经江西中医学院药用植物学科组鉴
定为合格药材;样品来源见表 1。
表 1　 供试品来源
编号 中文名称及学名 商品名称 样品来源
S1 芫花瑞香 Daphne genkwa S ieb. etZucc. 2004 /5 /甘肃文县高楼山采集
S2 凹叶瑞香 Daphne retu sa H em sl 2004 /5 /甘肃文县高楼山采集
S3 甘肃瑞香 Daphne tanguticaM ax im. 2004 /5 /甘肃文县高楼山采集
S4 黄花瑞香 Daphne gira ld ii N itsche 2004 /5 /甘肃文县高楼山采集
S5 尖瓣瑞香 Daphne acuti loba Rehd 2004 /5 /甘肃文县武都南山采集
S6 祖师麻 2004 /4山西万荣三九药业提供
S7 祖师麻 2003 /7山西万荣三九药业提供
S8 祖师麻 2003 /7山西太原购买
S9 祖师麻 2004 /9甘肃天水医院药房购买
S10 祖师麻 2003 /10安徽亳州购买
S11 凹叶瑞香 Daphne retu sa H em sl 2003 /10甘肃文县武都南山采集
S12 甘肃瑞香 Daphne tanguticaM ax im. 2003 /10甘肃文县武都南山采集
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续表 1
S13 黄花瑞香 Daphne gira ld ii N itsche 2003 /10甘肃文县武都南山采集
S14 甘肃瑞香 Daphne tanguticaM ax im. 2003 /10甘肃天水采集
S15 祖师麻 2004 /3山西万荣三九药业提供
S16 祖师麻 2003 /4山西万荣三九药业提供
S17 祖师麻 2004 /11山西万荣三九药业提供
S18 祖师麻 2003 /8西安药店购买
伪品 2003 /7山西万荣三九药业提供(伪品)
2　方法与结果
2. 1　色谱条件　色谱柱:D ikma D iamonsil C18 4. 6
mm ×200 mm , 5 μm;流动相:A:乙腈 , B:磷酸水 (pH
=3. 0),线性梯度见表 1;梯度滞后时间:0. 38 m in;
柱温:35℃。
表 2　 梯度洗脱表
时间 /m in 流动相 A / 流动相 B /
0 5 95
60 40 60
2. 2　溶液制备
2. 2. 1　对照药材和供试品溶液的制备　精密称取
对照药材和样品干燥粉末各 0. 25 g,分置 50 mL量
瓶中 ,精密加入 50 甲醇 50 mL,称定重量 ,超声提
取 30m in,冷却 ,再称定重量 ,用 50 甲醇补足减失
的重量 ,摇匀 ,过 0. 45 μm滤膜 ,各取续滤液作为对
照药材溶液和供试品溶液 。
2. 2. 2　对照品(参照物 )溶液制备　精密称取祖师
麻甲素对照品适量 ,加甲醇制成每 1mL含 40μg的
溶液 ,进样前用 0. 45μm滤膜过滤。
2. 3　精密度 、稳定性与重现性实验
2. 3. 1　精密度试验
取一份按 2. 2. 1项下方法制备祖师麻药材供试
品溶液 ,连续 6次进样 ,进样量 10 μL,以祖师麻甲
素的保留时间和峰面积为参照 ,换算出各共有峰的
相对保留时间和相对峰面积 ,结果表明 ,各共有峰的
相对保留时间基本一致 ,相对峰面积亦变化不大 。
相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差均小于
1. 5 ,结果表明:仪器等整个检测系统精密度良好 。
2. 3. 2　稳定性试验
取 18号样品 ,按 2. 2. 1项下方法制备供试品溶
液 , 1 d内连续进样 7次 ,进样量 10 μL,记录各共有
色谱峰保留时间和峰面积。以祖师麻甲素的保留时
间和峰面积为参照 ,换算出各共有峰的相对保留时
间和相对峰面积 ,结果显示 ,祖师麻药材制备的供试
品溶液在 1 d内通过 HPLC分析结果稳定 ,共有峰
相对保留时间和相对峰面积相当一致 ,相对标准偏
差均小于 1. 5 。结果表明:低温 (10 °C左右 )下保
存的祖师麻药材制备的样品稳定性较好 ,常温 (20
～ 30 °C)下一天之内也能保持较好的稳定性 。
2. 3. 3　重复性实验
取 18号样品 6份 ,按 2. 2. 1项下方法制备供试
品溶液 ,进样分析 ,进样量 20 μL,以祖师麻甲素的
保留时间和峰面积为参照 ,换算出各共有峰的相对
保留时间和相对峰面积 ,计算相对标准偏差 ,结果均
小于 1. 5 ,表明本实验方法具有较好的重现性 。
2. 4　祖师麻药材 HPLC指纹图谱的建立
　　取不同产地的祖师麻药材 ,按 2. 2. 1项方法制
备供试品溶液 ,进样并记录色谱图 。实验中记录了
2 h的色谱图 ,发现 60 m in后不再有色谱峰出现。
所以只记录 60m in的色谱图 。色谱图见图 1。
图 1　色谱图 祖师麻甲素(A), 样品(B)
　　用国家药典委员会推荐的 “中药色谱指纹图谱
相似度评价系统的操作规范”软件(版本 2004 A)处
理数据 ,相似度计算结果见表 3;色谱峰匹配图见图
2。
　　运用上述软件处理 ,计算机自动得出共有峰匹
配结果表 , 18批药材中共有17个共有峰 ,匹配结果
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表 3　 祖师麻 HPLC-FP相似度计算结果
样品号 与对照指纹图谱的相似度 样品号
与对照指纹图谱
的相似度
S1 0. 975 S10 0. 983
S2 0. 973 S11 0. 948
S3 0. 975 S12 0. 979
S4 0. 990 S13 0. 942
S5 0. 987 S14 0. 805
S6 0. 977 S15 0. 958
S7 0. 977 S16 0. 983
S8 0. 725 S17 0. 974
S9 0. 815 S18 0. 871
图 2　18批药材色谱峰匹配图
表中所示的共有峰的保留时间分别为 15. 780(1)、
18. 436(2)、19. 753(3)、20. 180(4)、24. 013(5)、24.
826(6)、25. 529(7)、26. 369(rxs)、31. 100(9)、38.
693(11)、39. 396(12)、41. 658(13)、43. 774(14)、
45. 036(15)、45. 978(16)、48. 977(17)。说明不同
产地及不同采收时期祖师麻药材的基本特征比较接
近 ,从表 3可以看出 18批药材之间的相似度良好 ,
除了 S8(0. 725)、S9(0. 815)、S14(0. 805)外 ,其余
药材的指纹图谱与系统生成的对照指纹图谱之间的
相似度均很高。通过对药材图谱的直观比较即可以
看出 , S8和 S9虽然与对照指纹图谱之间存在 17个
共有峰 ,但其各成分含量都普遍偏低 ,所以相似度比
较低;而 S14是由于其祖师麻甲素峰含量远远高于
其他药材而使其与其他药材差异较大 ,结果造成相
似度也偏低 。从表 3还可以看出大部分自己采集的
药材和药厂提供的药材相似度较高 ,而购买的药材
较低。根据药用植物学科组的鉴定结果 ,购买的药
材质量普遍差一些 ,而采集的药材和药厂提供的药
材质量较好 ,这也充分说明了利用此相似度软件进
行数据处理的结果与实际的鉴定结果相吻合。因此
在祖师麻实际医疗应用中一定要规范其市场来源 ,
在固定来源的基础上采用科学的手段扩大可能的药
源 ,以提高药用植物资源的利用率。
　　取祖师麻伪品药材 ,按与上述供试品相同的方
法对其测定 ,并与祖师麻药材色谱图进行比较 ,结果
对照药材与伪品之间的相似度只有 0. 131,可见此
法完全可以区别真伪;色谱图见图 3。
图 3　伪品与祖师麻药材的色谱峰匹配图
　　用对不同来源的祖师麻进行聚类分析 ,以祖师
麻甲素峰为参照峰 ,其他峰与之相比较 ,把得出的相
对峰面积值作为 SPSS的数据来源 ,采用组间均连
法 ,以欧氏距离为测度进行分类处理 ,聚类谱系图见
图 4。从聚类结果可知 S1、S2、S3、S4、S5、S7、S10、
S11、S12、 S13归为第一类 , S6、 S9、 S14、 S15、 S16、
S17、S18归为第二类 ,而 S8归为第三类 。与相似度
软件处理的结果进行比较 , S8在此被单独归为一
类 ,而其相似度 (0. 725)也最低 ,两种方法处理结果
一致 。 SPSS软件归为第一类的相似度全部大于
0. 942,而第二类中 S6、S15、S16、S17虽然相似度也
大于 0. 942,却被归为另一类 。笔者认为两种方法
处理数据虽然有相同点 ,但也存在一定的差异。通
过比较 ,相似度软件处理的结果与实际鉴定结果更
为吻合 ,属于首选的处理方法 ,但聚类分析也可以作
为其辅助分析手段以供参考 。
3　讨论
3. 1　提取方法和提取溶剂的选择　以最大限度地
保留祖师麻中的化学成分为原则 ,根据祖师麻所含
成分的性质 ,选择了不同浓度乙醇 、甲醇为提取溶
剂 ,提取方法考察了热回流 、冷浸 、超声提取 ,发现冷
浸法提取效率最低 ,其中 50 的甲醇超声提取较完
全 ,故采用此法作为供试品溶液的制备方法 。
3. 2　色谱条件的选择　本实验采用 HPLC法作为
测定祖师麻药材指纹图谱的方法 ,重现性 、稳定性 、
精密度均较高;曾对流动相及色谱柱等实验条件进
行了严格的考察 ,比较了 Hypersil ODS色谱柱 (规
格:4. 6 mm ×200 mm , 5μm)、 Lichro sper C18色谱柱
(规格:4. 6 mm ×200 mm , 5μm)、D ikma D iamonsil
C18色谱柱 (规格:4. 6mm ×200mm , 5μm)的洗脱效
果 ,结果 D ikma D iamonsi lC18色谱柱 (规格:4. 6 mm
×200mm , 5μm)分离效果好 、基线平稳 、色谱峰对
称性好 ,故确定为此色谱柱 。流动相考察了甲醇-
水 、乙腈-水 、甲醇-乙腈-水 、乙腈-磷酸水 、乙腈-醋酸
水 ,结果表明以乙腈-磷酸水系统梯度洗脱较适宜。
3. 3　本试验所建立的祖师麻 HPLC指纹图谱研究
方法操作简单 、重现性好且稳定 、可靠。根据分析结
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图 4　祖师麻样品聚类谱系图
果 ,得出 18批药材的相似度较高 ,并依此建立了 18
批药材的共有模式 ,确立了 17个共有峰 ,并通过药
材之间相似度的大小可以寻找它们的亲源关系 。从
而为药材植物资源的进一步开发利用提供参考数
据 。
3. 4　本试验采用了两种不同的方法分别处理试验
数据 , SPSS软件对不同的药材进行了大致的归类;
而国家药典委员会推荐的 “中药色谱指纹图谱相似
度评价系统的操作规范”软件(版本 2004A)更为系
统地进行了色谱峰的匹配和相似度计算;两种方法
分别从不同的侧面反应了指纹图谱的整体概貌 ,但
又有其相交汇的地方 ,例如 S8样品在相似度计算中
其相似度最低 ,在聚类分析中同样被单独归为一类 ,
可见相对而言此样品确实与其他样品存在较大的差
异。并且从上述分析结果可知 , “中药色谱指纹图
谱相似度评价系统的操作规范”软件(版本 2004 A)
作为指纹图谱的专用处理软件在此次试验数据的处
理中方便 、快捷 、准确率高 、结果可靠 ,因而适于此药
材指纹图谱相似度分析 。
参考文献:
[ 1] 　王　睿 ,徐　伟 ,方　翼.中药指纹图谱研究进展 [ J] . 药学进
展 , 2004, 7(10):765-765.
[ 2] 　王明时 ,于　明 ,张文君.祖师麻化学成分的研究 [ J] . 中草药
通讯 , 1976, 7(10):13.
不同产地穿心莲药材 HPLC指纹图谱初步研究
林蔚兰 1 , 　曾令杰 2 , 　梁惠瑜1 , 　陈松光 1
(1.广州白云山和记黄埔中药有限公司 ,广东 广州 510515;福建农林大学博士后工作站福建 福州 350002)
收稿日期:2006-03-17
作者简介:林蔚兰(1970～ ),工程师 ,研究方向:中药分析与制剂 ,电话:020-87200263。
关键词:穿心莲;HPLC;指纹;图谱
摘要:目的:建立穿心莲药材 H PLC指纹图谱分析方法 ,评价药材质量。方法:Ag ilen t1100高效液相色谱仪 , 流动相甲醇-
水(30∶70)～ 60 m in(60∶40)梯度洗脱 ,流速 1. 0 m L /m in,检测波长 226 nm。结果:H PLC指纹图谱中穿心莲内酯类成分
均有较好分离 , 能比较或区别不同产地药材的质量状况。结论:该方法简便 、准确 、重现性好 , 可突出穿心莲药材的内在
质量特征。
中图分类号:R284. 1　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-1528(2007)05-0730-03
730
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第 29卷　第 5期
中 成 药
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