全 文 ：第 44 卷 第 4 期
2 0 0 8年 4 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol.44 , No.4
Apr., 2 0 0 8
香樟胚性愈伤组织遗传转化体系建立＊
杜　丽1　庞振凌1　周　索1　曾晓慧1　包满珠2
(1.南阳师范学院生命科学与技术学院　南阳 473000;　2.华中农业大学园艺林学学院教育部园艺植物生物学重点实验室　武汉 430070)
摘　要:　通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法 ,建立香樟胚性愈伤组织遗传转化体系。结果表明:以胚性愈伤组
织为受体 ,能取得比较理想的转化效果;50 mg·L-1的潮霉素对胚性愈伤组织有很好的筛选效果;根癌农杆菌 0D600
为0.6时 , 能获得较高的转化率;侵染时间提高为 40 min 时 ,对提高转化效率有显著的效果;共培养 3 d 能够得到
较好的转化效率。对转基因香樟愈伤组织进行 PCR检测 , 结果表明GUS 基因已整合到香樟胚性愈伤组织的基因组
中。
关键词:　香樟;根癌农杆菌;遗传转化;PCR
中图分类号:S718.46;Q943.2　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-7488(2008)04-0054-06
收稿日期:2007-09-19。
基金项目:河南省自然科学基金(0611033300);南阳师范学院高层次人才科研启动费资助。
＊包满珠为通讯作者。
Establishment of Agrobacterium-Mediated Transformation System
of Embryogenic Calli of Cinnamomum camphora
Du Li1　Pang Zhenling1　Zhou Suo1　Zeng Xiaohui1 　Bao Manzhu2
(1.Shool of Life Science and Technology , Nanyang Normal University 　Nanyang 473000;　2.Key Laboratory of Horticultural
Plant Biology of Ministry of Education　College of Horticulture and Forestry Sciences , Huazhong Agricultural University　Wuhan 430070)
Abstract:　A genetic transformation system of embryogenic calli (Cinnamomum camphora)mediated by Agrobacterium
tumefaciens was established.Experimental result indicated that efficient transformation was obtained with embryogenic calli as
acceptor.Hygromycin of 50 mg·L-1 was efficient in screening embryogenic calli.When the OD600 value of Agrobacterium was
0.6 , a high transformation rate was gained.The infection time of 40 min , combined with co-culture time of 3 d , remarkably
enhanced transformation rate.Results of PCR proved that the GUS gene had integrated into embryogenic calli of C.camphora
genome.
Key words:　Cinnamomum camphora ;Agrobacterium tumefaciens;genetic transformation;PCR
香樟(Cinnamomum camphora),樟科(Lauraceae),常绿乔木 ,是贵重家具 、高级建筑 、造船和雕刻等理想的
用材 , 近年来 ,香樟在园林绿化中的应用越来越多 ,成为城市中重要的园林绿化树种。作者利用未成熟的香
樟合子胚诱导获得胚性愈伤组织 ,历经 3年继代保存 ,胚性愈伤组织仍具有发育成体胚 、体胚再形成植株的
能力 。香樟的植株再生通常是经过体细胞胚胎发生途径来完成的(杜丽等 ,2006;Du et al., 2007),但国内外
迄今为止尚无关于香樟的胚性愈伤组织遗传转化体系的报道。本文利用现有保存的香樟胚性愈伤组织细胞
系 ,对影响香樟遗传转化的几个因素进行了研究 ,建立了高效的农杆菌遗传转化体系 ,为香樟的基因工程育
种奠定了基础。
1　材料与方法
1.1　植物材料
香樟可通过体细胞胚发生途径获得再生植株 ,本文利用这个再生系统进行遗传转化的研究。以香樟继
代保持3年的胚性愈伤组织(胚性系 L9)(杜丽等 ,2006;Du et al., 2007)为试验材料和转化受体。
1.2　胚性愈伤组织对潮霉素的敏感性试验
将胚性愈伤组织接种于附加不同浓度潮霉素的保持增殖培养基上(MS+1.0 mg·L-1 BA +0.1 mg·L-1
2 ,4-D +700 mg·L-1 CH ,蔗糖30 g·L-1 , 琼脂粉为7.5 g·L-1)(CH:水解酪蛋白),1个月后比较不同浓度抗生
素对外植体增殖的抑制作用 ,以确定合适的选择压力。试验的潮霉素浓度梯度为 10 、30 、50 、70 、100 mg·L-1 。
试验外植体数不少于 30团(直径约5 mm)。
1.3　根癌农杆菌菌株及质粒
试验中所用根癌农杆菌菌株为 EHA105 ,它含有 pCAMBIA1301质粒 ,该质粒携带GUS报告基因和HPT选
择基因 ,其中GUS基因含有一个内含子 ,以确保GUS 基因只在植物细胞中表达 ,而不在农杆菌中表达 。含有
该质粒的农杆菌对潮霉素有抗性。质粒中T-DNA区域的结构简图如图 1所示。
图 1　质粒 pCAMBIA1301 的 T-DNA 区结构简图
Fig.1　Const ruction of T-DNA region of plasmid pCAMBIA1301
1.4　农杆菌介导的转化
收集培养好的农杆菌菌体用共培养介质(AB + 100 μmol·L-1 AS ,表 1)(AS:乙酰丁香酮)重新悬浮至
OD600 0.2 ～ 1.2左右 ,将愈伤组织置于悬浮液中侵染 10 ～ 60 min ,用灭菌滤纸吸干表面液体 ,一段时间后取出
并用无菌滤纸吸去表面多余的菌液 ,并在超净工作台上将浸泡后的材料吹至半干(20 ～ 30 min),后接入胚性
愈伤组织共培养培养基(MS +1.0mg·L-1 NAA +1 000 mg·L-1 ME +100μmol·L-1 AS)(ME:麦芽提取物)
中 ,将上述接种物置于黑暗条件下培养 1 ～ 6 d。
对于胚性愈伤组织的转化条件优化 ,本研究试验了根癌农杆菌 EHA105 pCAMBIA1301 的菌液浓度
(OD600=0.2 、0.4 、0.6 、0.8 、1.0 、1.2),共培养天数(1 、2 、3 、4 、5 、6 d),侵染时间(10 、20 、30 、40 、50 、60 min),对遗
传转化的影响 。检测其中的某个因素时 ,其他因素的水平采用OD600为0.6 ,共培养天数为3 d ,侵染时间为 40
min ,共培养结束后用外植体GUS 的瞬间表达量的多少确定转化条件的适宜程度。
表 1　AB液体培养基的组成
Tab.1　Composition of
liquid AB medium
组成
Composition
浓度
Concentration
K2HPO 4 3 g·L-1
NaH2PO4 1 g·L-1
NH4Cl 1 g·L-1
MgSO4·7H2O 0.3 g·L-1
KCl 0.15 g·L -1
CaCl2 0.01 g·L -1
FeSO 4·7H2O 2.5 mg·L -1
葡萄糖Glucose 0.5%
1.5　脱菌和选择培养
试验中测试了不同浓度的潮霉素(50 mg·L-1和 70 mg·L-1)和 300 mg·L-1头
孢霉素组成的选择培养基(MS +1.0 mg·L-1 NAA +1 000 mg·L-1 ME)对诱导
GUS基因转化的抗性愈伤组织的影响 ,该试验设计 2次重复 ,每次重复采用至少
50个外植体(5个培养皿 , 10团外植体 皿),25 ℃黑暗条件下选择培养 ,6周后进
行抗性愈伤组织诱导率(产生新鲜愈伤组织的外植体数 每个重复的外植体总数
×100%)统计。此后 ,诱导出的新鲜抗性愈伤组织在含有 50 mg·L-1潮霉素和
300 mg·L-1头孢霉素的选择培养基上每 3周继代 1次进行抗性愈伤组织的增殖
培养 ,25 ℃暗培养 。
1.6　抗性愈伤组织的 GUS基因瞬间表达及 PCR检测
转化共培养后对转化受体进行 GUS 染色 ,检测转化瞬时表达率 ,可初步判
断农杆菌对受体组织的侵染效率。检测GUS基因在转基因愈伤组织中的表达 ,取未转化的同步材料为阴性
对照 。胚性愈伤组织反应后可直接观察 ,GUS 基因瞬间表达呈阳性者可在肉眼下观察到蓝色反应 ,然后统计
GUS基因瞬间表达率(有蓝色反应的外植体数 外植体总数)。试验重复 3次 ,每次外植体总数不少于 30粒。
香樟胚性愈伤组织DNA的提取采用CTAB少量提取法。根据HPT 基因序列 ,设计一对特异引物为:5′-
CGT , CTG , TCG , AGA , AGT , TTC-3′和 5′-TAC , TTC , TAC , ACA , GCC , ATC-3′,琼脂糖凝胶电泳检测扩
增片段范围如图 5所示。
2　结果与分析
2.1　胚性愈伤组织对潮霉素的敏感性分析
研究了10 ～ 100 mg·L-1不同潮霉素浓度对胚性愈伤组织增殖的影响。将继代培养的胚性愈伤组织接种
到含潮霉素的保持培养基上 ,观察和记录在不同选择压力下培养 4周后的生长结果。随着培养基中潮霉素
浓度的增加 ,具有新生长的愈伤组织的比例显著降低 , 10 ～ 30 mg·L-1压力下 , 4周后虽然有部分愈伤组织逐
渐死亡 ,但仍有部分愈伤组织存活下来并能继续生存下去 。当潮霉素浓度达到 70 mg·L-1或更高时 ,从接种
55　第 4期 杜　丽等:香樟胚性愈伤组织遗传转化体系建立
10 d后立即抑制了胚性愈伤组织生长 ,生长缓慢。这个结果表明潮霉素在选择压力低时 ,即使长时间选择亦
有部分愈伤组织存活 ,当压力提高达到一定值时 ,经短时间的选择即可达到抑制生长的效果。可见潮霉素对
于香樟胚性愈伤组织的生长抑制是速效的。在观察中发现 ,当潮霉素浓度为 50 mg·L-1时 ,虽然能够观察到
新的愈伤组织以很低的频率发生(<15%),但大多数愈伤组织颜色发暗 ,呈现黄褐色 ,表面干涩 ,缺乏活力;
潮霉素浓度为 70 mg·L-1时 ,愈伤组织呈褐色 ,有极少量新的愈伤组织发生 ,愈伤组织体积增大不明显;当潮
霉素浓度为100 mg·L-1 ,愈伤组织呈黑褐色 ,体积无增大 ,生长完全受到抑制。因此认为 50 mg·L-1潮霉素已
表现出对香樟胚性愈伤组织生长的明显抑制 ,故将潮霉素浓度 50 mg·L-1作为选择压力。
2.2　侵染时间对胚性愈伤组织遗传转化的影响
农杆菌侵染植物外植体首先进行农杆菌细胞与植物细胞间的相互作用 ,足够的侵染时间有利于农杆菌
通过趋化作用或其他作用充分吸附到植物外植体伤口或愈伤组织表面 ,一般农杆菌的侵染时间为 5 min到
1 h之间 。本文研究了 10 ～ 60 min 这 6个水平(10 、20 、30 、40 、50 、60 min),其中每个处理的共培养时间均为
3 d , 侵染用农杆菌的OD600值都调整为0.6 ,GUS数据是 3次独立重复试验的平均结果。结果显示:当侵染时
间为 10 min时 ,胚性愈伤组织的 GUS基因瞬间表达率为 0(图 2A),而侵染时间延长至20 min时 ,GUS基因瞬
间表达率突增至 40%以上;最高的表达率出现在侵染时间为 40 min的处理中 , GUS基因瞬间表达率可达
76.67%;侵染时间超过 40 min表达率开始下降 ,可能是过长的侵染时间使农杆菌对外植体的生长造成了伤
害 ,所以 40 min的侵染时间适于香樟胚性愈伤组织的遗传转化。
2.3　菌液浓度对胚性愈伤组织遗传转化的影响
菌液浓度在农杆菌介导的遗传转化中是影响转化效率的重要因素之一 ,因此试验在 40 min的侵染时
间 、共培养 3 d的同样条件下 ,测试了在 0.2 ～ 1.2的 6个水平 OD600值(OD600=0.2 、0.4 、0.6 、0.8 、1.0 、1.2)对
转化效率的影响(图 2B)。结果显示 ,不同浓度的菌液对香樟胚性愈伤组织的转化效率不同 。OD600值为 0.2
时 ,结束共培养后的 GUS瞬间表达率只有 20%左右 ,随着菌液浓度的增加 ,表达率逐渐增加 ,当浓度达到 0.6
时 ,表达率最高 ,随后开始降低 。同时发现 ,在浓度高的菌液处理中 ,结束共培养时 ,细菌过度生长 ,几乎包裹
了整个外植体 ,转入选择培养后 ,有的细菌竟然继续生长 ,不容易被清除干净 ,影响外植体的生长 ,因此认为
OD600值大于0.8的菌液浓度处理的外植体 GUS基因表达率下降 ,可能是过度生长细菌的毒害作用造成的。
所以在对香樟胚性愈伤组织侵染中 ,农杆菌最适宜的浓度为 OD600值0.6。
图 2　侵染时间 、农杆菌侵染浓度对香樟胚性愈伤组织遗传转化的影响
Fig.2　Effect of infection time and OD value on gene transformation in embryogenic calli of C.camphora
2.4　共培养时间对胚性愈伤组织遗传转化的影响
理论上说 ,农杆菌与植物共培养时间越长 ,农杆菌侵入的机会越多 、基因转化的频率越高 。然而 ,实际操
作中如果共培养的时间越长 ,植物的外植体会因过度感染而中毒死亡 , 达不到转化效果 。因此确定合适的
共培养时间是提高转化率的重要因素之一。本试验使用农杆菌 OD600值为 0.2和 0.6 、侵染时间为 40 min的
转化条件 ,在共培养 1 ～ 6 d后(1 、2 、3 、4 、5 、6 d),检查 GUS基因在外植体中的瞬间表达情况 ,结果如图 3 。从
图3可见 ,共培养 1 d后 ,使用较高浓度的菌液(OD600=0.6)GUS 基因在外植体内即有表达 ,随着培养时间的
延长 ,GUS基因的表达率增高 ,在共培养 3 d时表达率达到最高(76.67%),然而随着时间的延长 ,GUS 基因的
表达开始下降 ,原因是植物的外植体过度感染死亡 。OD600值为 0.2的所有处理中 ,GUS表达率均明显低于高
浓度(OD600=0.6)的菌液侵染效果。可见 ,低浓度菌液 、长时间共培养不能达到和高浓度菌液侵染的同样效
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图 3　共培养时间对胚性愈伤组织遗传转化的影响
Fig.3　Effect of co-cultivation time on gene
t ransformation in embryogenic calli of C.camphora
果。所以 , 适宜的菌液浓度为OD600=0.6 , 共培养时间为
3 d。
2.5　抗性愈伤组织的获得及继代增殖
本试验根据GUS 基因瞬间表达结果(图4a ～ c),确立了
农杆菌介导香樟胚性愈伤组织遗传转化的合适条件 , 即菌
液浓度为OD600 =0.6 , 侵染时间为 40 min , 共培养时间为
3 d。按照这一条件进行侵染 ,共培养 3 d后直接转入各自
的选择培养基上进行选择培养 ,6周后获得抗性愈伤组织。
诱导获得的抗性愈伤组织继续转接到选择培养基上 ,
每隔 3周继代1 次 ,进行抗性愈伤组织的增殖和假阳性转
化的剔除 。从转入 GUS 基因的抗性愈伤组织(图 4d)上可
以看出 ,抗性愈伤组织生长较快 ,呈新鲜的淡黄色 ,而其他
愈伤组织色彩黯淡 ,呈褐色 ,无生活力。选择培养基中 300 mg·L-1头孢霉素能有效抑制农杆菌的生长 ,并对
愈伤组织的增殖无影响。到目前为止 ,这些抗性愈伤组织正在进行再生植株的诱导试验 。
图 4　香樟胚性愈伤组织 GUS 基因表达染色反应
Fig.4　Histological assay of GUS gene expression
in embryogenic calli of C.camphora
a.共培养 3 d后胚性愈伤组织的GUS基因瞬间表达;b.GUS
阳性反应愈伤组织(左)和对照愈伤组织(右);c.GUS基因的
不同表达量(左为对照);d.抗性愈伤组织。 a.GUS gene
transient expression after 3-day co-culture GUS spots;b.GUS spots
(left)and control calli(right);c.Different expression of GUS gene
(cont rol on the left);d.Hygromycin resistant calli after 6-week
selection culture.
2.6　胚性愈伤组织 GUS基因瞬间表达及稳定表达检测
共培养结束后 ,将无菌水清洗过的胚性愈伤组织放
入GUS反应缓冲液 ,37 ℃水浴保温过夜。反应结果可以
直接用肉眼观察 。从图 4a～ c 可以看出 , 香樟胚性愈伤
组织的 GUS基因表达比较强 ,被检测的抗性愈伤组织上
呈现出不同程度的蓝色 ,说明 GUS在不同的愈伤组织中
的表达强弱不同;有的愈伤组织只是局部出现蓝斑 ,可
能是外植体局部被转化的结果 。虽然一些研究表明 ,
GUS基因瞬间表达主要是由未整合的 T-DNA引起的 ,与
稳定的转化事件并无严格的相关关系 ,但是差异较大的
GUS瞬间反应对于遗传转化条件的确定还是具有一定的
指导意义。在本试验中 ,使用 GUS基因瞬间表达的结果
进行转化条件优化 ,以优化的条件进行转化 ,最终得到了
抗性愈伤组织(图 4d),目前 ,导入GUS 基因的抗性胚性
愈伤组织正在进行体胚诱导 ,然后进行再生植株的诱导 。
2.7　含有 GUS基因的抗性愈伤组织的 PCR检测
进行选择培养 6周后 ,经含有GUS 基因的农杆菌菌
液侵染过的胚性愈伤组织上 ,可以观察到有黄色新鲜的
胚性愈伤组织出现 。含有潮霉素 50 mg·L-1的选择培养
基上的抗性愈伤组织诱导率为 17.5%;抗生素提高至70
mg·L-1抗性愈伤组织诱导率降至 12%,而且这些新诱导
的愈伤组织个体都比较细小 ,直径不足 2 mm(表 2)。抗
性愈伤组织在选择培养基上生长较正常的胚性愈伤组织
在不添加抗生素的培养基上缓慢 ,可见高浓度的潮霉素
对于抗性愈伤组织的生长仍然具有抑制作用 。
　　将多次选择继代(4个月)的抗性愈伤组织按照外植体来源编号 ,提取 DNA ,进行 PCR检测 ,检测结果如
图5所示 ,4团测试的潮霉素的抗性愈伤组织中编号为 1 、2 、3 、4的愈伤组织使用 HPT 基因设计的引物均扩
增出约 500 bp的片段 ,与质粒 DNA扩增的片段大小相同 ,而以未转化愈伤组织 DNA为阴性对照的扩增产物
中无目标片段 ,说明外源基因已稳定整合到这些被检测抗性愈伤组织细胞的核基因组中 。PCR检测选用的
DNA取自在选择培养基(潮霉素:50 mg·L-1)上多次(4个月)继代的抗性愈伤组织 ,4团抗性愈伤组织在 PCR
检测中均呈现阳性反应 ,阳性比率为 100%,可见长期使用高浓度潮霉素处理抗性愈伤组织能够有效剔除假
57　第 4期 杜　丽等:香樟胚性愈伤组织遗传转化体系建立
表 2　GUS基因转化香樟胚性愈伤组织的潮霉素抗性愈伤组织诱导情况①
Tab.2　Hygromycin-resistant calli induction from embryogenic calli of C.camphora after GUS gene transformation
潮霉素浓度
Concentrat ion of hygromycin (mg·L -1)
外植体数
Number of explants
抗性愈伤组织诱导率
Frequency of resistant calli induction %
平均生长量(直径)
Mean growth(diameter) mm
50 50 17.5 <2
70 50 12 <1
　　①结果统计于选择培养 6周后;试验重复 2次(每次外植体数不少于 50个)。Data were collected after 6 weeks in selection culture;Means are
calculated in two replications including 5 petri disheswith 10 explants each.
阳性的愈伤组织 ,这可能与香樟的胚性愈伤组织的生长对潮霉素的作用比较敏感有一定的关系。
图 5　GUS 基因遗传转化的潮
霉素抗性愈伤组织的 PCR检测
Fig.5　PCR amplificat ion results of
hygromycin resistant embryogenic calli
af ter GUS gene transformation
M.Marker(DL200);N.未转化愈伤
组织 DNA 阴性对照 Non-t ransgenic
embrogenic calli negative control;P.
质粒 DNA 阳性对照 Plasmid DNA
positive control;1～ 4.抗性愈伤组织
DNA hygromycin-resistant embryogenic
calli.
3　结论与讨论
3.1　影响香樟胚性愈伤组织遗传转化的因素
根据试验研究 ,香樟胚性愈伤组织是比较适宜的遗传转化材料 。在试验
中 ,使用子叶期的体胚来侵染 ,其效果差于胚性愈伤组织(数据未显示)。通常
当体胚经过侵染后 ,在选择培养时 ,外植体材料非常容易褐化死亡 ,这可能是
因为基因成功转化部分占整个体胚体积比例太小 ,产生的对抗生素的抵抗力
不足以保证整个外植体的存活 ,所以香樟体胚的转化效率较差。在许多物种
农杆菌介导的遗传转化中 , 胚性愈伤组织是较多使用的转化材料 ,如 柑
(Citrus reticulata)(Li et al., 2002)、棉花(Gossypium hirsutum)(谢德意等 ,2007)、
杂交月季(Rosa hybrid)(Gao et al., 2004;Kim et al., 2004)、匍匐剪股颖
(Agrostis tenuis)(Chai et al., 2004)等都是使用胚性愈伤组织进行遗传转化的 ,
香樟在进行农杆菌介导的遗传转化中 ,胚性愈伤组织同样是比较适宜的转化
试材 。
本文研究了在农杆菌菌液侵染胚性愈伤组织时 ,菌液浓度 、侵染时间和共
培养时间对T-DNA转化的影响。许多研究表明菌液浓度在农杆菌介导的遗
传转化中是影响转化效率的重要因素之一(Dohm et al., 2001;Gao et al.,
2004;苏晓华等 , 2003),单位体积中的细菌含量增加 ,使得农杆菌和胚性愈伤
组织相遇的机会增加 ,T-DNA转入外植体的机会也大大增加;但并不是菌液浓度越高 ,转化效果越好 ,因为
外植体对于农杆菌的忍耐也是有限度的 ,过高的细菌浓度如果毒害外植体 ,显然会降低T-DNA的转化效率。
就香樟胚性愈伤组织的转化而言 ,OD600为 0.6的菌液浓度是最佳的转化菌液浓度 ,这与王爱菊等(2006)的研
究结果也是一致的。足够的侵染时间有利于农杆菌通过趋化作用或其他作用充分吸附到植物外植体伤口或
愈伤组织表面 ,10 ～ 60 min是农杆菌转化中经常被使用的时间范围 ,不过侵染时间过长同样会造成转化效率
降低 ,所以香樟胚性愈伤组织的最佳侵染时间是 40 min。农杆菌与植物共培养时间越长 ,农杆菌侵入的机会
越多 、基因转化的频率越高 ,通常可能会认为较低浓度的菌液侵染后 ,适当延长共培养时间就能够获得较好
的转化效率。实际上在本研究中发现 ,此种设想不能成立 ,OD600为 0.2的侵染 ,即使共培养时间延长至 6 d ,
所得转化效果仍大大低于高浓度在较短共培养时间的结果 ,显然农杆菌的转化效果在侵染结束后 ,就已经基
本确定。可见在香樟的农杆菌介导的遗传转化中 ,侵染浓度跟共培养时间相比较而言 ,侵染浓度对转化效果
的影响更显著。
3.2　胚性愈伤组织的植株再生
在进行植株再生的过程中 ,抗生素是选择再生植株的关键 。它虽然是得到阳性转化材料再生植株的保
证 ,但也可能是植株再生困难的根源。在本试验中观察到 ,同样进行体胚诱导(附加不同抗生素的诱导培养
基),卡那霉素抗性愈伤组织诱导获得体胚后(转化含有 NPTⅡ的质粒 ,数据未列出),而潮霉素抗性愈伤组织
没有体胚的形成 。试验中观察到香樟胚性愈伤组织对于这 2种抗生素刺激的反应不同 ,对潮霉素刺激的敏
感很有可能就是使之发育迟缓的原因。转化细胞是因为含有抗性基因来抵抗抗生素的刺激 ,抗生素对这些
材料生长的抑制作用是一直存在的 ,这种抑制作用就可能是导致抗性愈伤组织再生困难的原因之一。所以 ,
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在使用抗生素进行选择和再生培养时 ,应该将抗生素浓度设定为先低后高再低或无 ,这样既保证了转化的有
效性 ,又能使植株再生不再受阻。目前本试验的香樟潮霉素抗性愈伤组织正在进行植株再生的诱导。
参 考 文 献
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苏晓华 , 张冰玉 , 黄秦军 , 等.2003.我国林木基因工程研究进展及关键领域.林业科学 , 39(5):111-118.
王爱菊 , 张凤美 , 鹿金颖 , 等.2006.农杆菌介导的百合遗传转化体系的建立.园艺学报 , 33(3):664-666.
谢德意 , 金双侠 , 郭小平 , 等.2007.棉花胚性愈伤组织的转化及转基因胚状体的有效萌发与成苗技术研究.作物学报 , 33(5):751-756.
Chai M L , Senthil K K , Kim D H.2004.Transgenic plants of colonial bentgrass from embryogenic callus via Agrobacterium-mediated transformation.Plant Cell ,
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Du Li , Zhou Suo , Bao Manzhu.2007.Effect of plant growth regulators on direct somatic embryogenesi s in camphor t ree (Cinnamomum camphora L.)f rom
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(责任编辑　徐　红)
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