全 文 ：收稿日期:1999　06　30
基金项目:国家自然科学基金资助项目(39760007)
作者简介:李红艳(1973—),女(回族),广西桂林人 ,广西师范大学硕士研究生
第 17卷　第 4 期 广西师范大学学报(自然科学版)　　　　　　　　Vol.17　No.4
　1999年 12 月 JOURNAL OF GUANGXI NORMAL UNIVERSITY December　1999
沙田柚花柱三种同工酶分析
李红艳　杨继华　薛妙男
(广西师范大学生物学系 ,广西 桂林 541004)
摘　要:分析了沙田柚在发育过程中三种酶(即过氧化物酶 、酯酶 、淀粉酶)的同工酶类型的变化.
结果表明:沙田柚花柱中过氧化物酶活力随着发育的日趋成熟 , 种类逐渐减少 , 活性也相对减弱;
酯酶同工酶种类在授粉以前呈不规则变化 , 但授粉以后较授粉以前种类明显减少;淀粉酶同工酶
种类及活性呈现出强弱交替的变化曲线 , 即四分体时期酶种类最少 、活性最低 , 单核期有所增加 ,
双核期达最大值 ,成熟期有所回落 , 授粉以后又有所增加.
关键词:沙田柚;花柱;同工酶;过氧化物酶;酯酶;淀粉酶
分类号:Q946.5　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001—6600(1999)04—0080—05
沙田柚属于配子体高度自交不亲和品系 ,自交座果率极低 ,严重影响了丰产丰收.80年代
以来 ,国外在配子体自交不亲和机理研究方面已取得了很大进展.目前已从花烟草 、矮牵牛 、
马铃薯 、秘鲁番茄等多种茄科植物中分离出近 20种 S基因[ 6 , 7].大量的实验证据表明 ,控制自
交不亲和性的 S基因在花柱中的表达产物是一种核酸酶(S_RNase),但仅从这一方面还不能全
面科学地阐明自交不亲和机理 ,于是我们设想通过另外一种方法 ,即研究沙田柚花柱同工酶谱
的变化规律 ,以期能对其自交不亲和机理有更全面的了解 ,为最终寻找到一些切实可行的克服
途径奠定理论基础;同时也可以探讨发育过程中特异性基因表达的调控机制.
1　材料和方法
1.1　材料
实验的材料采自广西柑桔研究所(桂林市)10 ～ 12年生酸砧沙田柚结果树.根据花粉发
育的4个时期:四分体 、单核 、双核 、成熟期以及自交和异交授粉后 ,分别采集花柱 ,贮藏于
-80℃冰箱中 ,备用.
1.2　方法
分别取花柱上 1/2部 300 mg 样品加提取液(Tris_柠檬酸 ,pH 8.0)1 mL ,少许 PVP ,冰浴研
磨 ,离心(12 000 r/min ,10 min),取上清液加样电泳.
电泳采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板装置 ,不连续系统.凝胶大小 13 cm×11 cm×0.1 cm.分
DOI :10.16088/j.issn.1001-6600.1999.04.017
离胶浓度 T =7.5%,稳流 15 mA ,直至电泳结束.
过氧化物酶染色:取醋酸联苯胺溶液(2 g 联苯胺溶于18 mL 冰醋酸 ,加水 72 mL)1 mL ,3%
过氧化氢 0.4 mL ,加水至 20 mL(临用现配),将胶板置于上述染色液中 ,在 37℃下保温 10
min[ 3].
酯酶染色:0.06 g α_醋酸萘酯 , 0.06 g β_醋酸萘酯 , 0.06 g 固蓝盐 B , 少许丙酮溶解 ,加
0.067 mol/L(pH 6.5)磷酸缓冲液至 40 mL ,即得酯酶染色液(临用现配).将胶板置于上述染色
液中 37℃保温 10 min[ 5].
淀粉酶染色(负染):胶板在1%淀粉溶液(用 0.04 mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液配制)中于
25℃保温 30min ,用0.04mol/L pH 7.0磷酸缓冲液洗涤10 min ,再浸入 0.005mol/L I2-KI试剂
中 ,轻微振荡数分钟[ 3].
以上染色后的胶板用双蒸水冲洗 ,置于 5%醋酸中保存 ,拍照或描模式图谱.
2　结　果
2.1　过氧化物酶同工酶的比较
花粉各发育时期花柱过氧化物酶同工酶谱的变化结果见图 1.由图 1可见 ,共分出 8条比
较明显的同工酶谱带 ,由负极向正极端编号 ,依次为P1 ～ P8.其中 P2和 P4为各发育时期所共
有的酶带 ,且 P2的表达在四分体 、单核及双核期明显高于成熟期和授粉以后 ,单核期 P4的表
达最强 ,其他各期无明显差异;P5为四分体 、单核 、双核及成熟期共有的酶带 ,且随着发育的日
趋成熟 ,表达逐渐减弱;P1在四分体 、单核期存在 ,双核期以后未观察到;而 P3与 P1恰相反 ,
双核期以后出现 ,四分体和单核期未观察到;P6 , P7 , P8是四分体时期特有的酶带 ,其中 P7 ,P8
染色明显深于 P6 ,说明 P7和 P8是这时期的主要特征酶带.由上述比较 ,我们可以看出 ,随着
发育的日趋成熟 ,同工酶的种类逐渐减少 ,活性也相对减弱.自 、异交花柱酶带数虽然相同 ,但
异交花柱酶带染色较浅 ,属弱带.
图 1　过氧化物酶同工酶 PAGE 电泳模式图谱
表 1　过氧化物酶同工酶活性
时期 酶　带　编　号
P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8
四分体期 +++ +++ ++ +++ + +++ +++
单核期 +++ +++ ++++ ++
双核期 +++ ++ ++ +
成熟期 ++ ++ ++ +
自　交 ++ ++ ++
异　交 + + +
++++最强带+++次强带++强带+弱带
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2.2　酯酶同工酶的比较
花粉各发育时期花柱酯酶同工酶谱的变化结果见图 2.由图2可见 ,可分出 8条比较明显
的同工酶谱带 ,由负极向正极端编号 ,依次为 E1 ～ E8.其中 E1 , E2 ,E3为各发育时期所共有的
酶带 , E1和 E2在双核期之前的表达高于双核期之后 , E3在四分体时期和单核期的表达最强 ,
其它各期无明显差异;E4为四分体 、单核 、双核 、成熟期所共有酶带 ,四分体时期 E4的表达最
弱 ,其余各期表达增强;E6除双核期之外 ,其它各期均有表达 ,但在四分体时期 E6的表达最
强 ,成熟期稍高于单核期 ,授粉以后最弱;E7在四分体 、单核 、成熟期存在 ,但表达都相对很
弱;E8在单核 、成熟期存在 ,表达也相对很弱;E5仅在双核期 、成熟期存在 ,双核期 E5的表达
尤为强烈 ,可作为此时期的特征酶带.从上述的比较中 ,我们可以看出 ,授粉以前各期酯酶同
工酶种类呈不规则变化 ,但授粉以后较授粉以前种类明显减少.
图 2　酯酶同工酶PAGE 电泳模式图谱
表 2　酯酶同工酶活性
时期 酶　带　编　号
E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8
四分体期 ++ ++ ++++ + ++++ +
单核期 ++ ++ ++++ +++ ++ + +
双核期 + + +++ +++ ++++
成熟期 + + +++ +++ +++ +++ + +
授粉后 + + +++ +
++++最强带+++次强带++强带+弱带
2.3　淀粉酶同工酶的比较
花粉各发育时期花柱淀粉酶同工酶谱的变化结果见图 3.由图 3可见 ,可分出 8条比较明
显的同工酶谱带.由负极向正极端编号 ,依次为 A1 ～ A8.其中A2 ,A5 ,A7为各发育时期所共
有的酶带 ,在这 3条共有的酶带中 ,A2在各时期的表达都较其他两带强 , A7的表达在四分体
相对最弱 ,其他各期表达有所增强 , A5的表达表现出强弱交替的现象 ,即四分体 、单核期弱表
达 ,双核期有所增强 ,成熟期弱表达 ,授粉以后有所增强 ,但与A2 ,A7相比 ,A5的表达在各期都
比较弱;除四分体以外 ,A1和 A6在其他各期都有表达 , A1的表达表现出由弱变强的趋势 ,即
单核期最弱 ,以后各期逐渐增强;A6的表达和A5非常相似 ,也表现出强弱交替的现象;A3 ,
A4为单核期和双核期共有的酶带 ,且 A3的表达高于 A4;A8是双核期及成熟期新出现的酶
带 ,表达相对较弱.从上述的比较中 ,我们可以看出 ,淀粉酶同工酶种类及活性呈现出强弱交
替的变化曲线 ,即四分体时期酶种类最少 、活性最低 ,单核期有所增加 ,双核期达最大值 ,成熟
期有所回落 ,授粉以后又有所增加.
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图 3　淀粉酶同工酶 PAGE电泳模式图谱
表 3　淀粉酶同工酶活性
时期 酶　带　编　号
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8
四分体期 ++++ + +++
单核期 + ++++ +++ + + + ++++
双核期 ++ ++++ +++ ++ ++ ++ ++++ +
成熟期 ++ ++++ + + ++++ +
授粉后 ++ ++++ ++ ++ ++++
++++最强带+++次强带++强带+弱带
3　讨　论
3.1　过氧化物酶作为一种重要的细胞壁酶 ,它参与了细胞壁中许多结构成分的聚合作用 ,细
胞壁内的结构蛋白 、半纤维素和果胶等在过氧化物酶催化下发生的交联反应可能在很大程度
上降低了细胞壁的延伸性 ,使得细胞壁硬化 ,从而也就控制了细胞的生长速度.本实验考察了
花柱在发育过程中过氧化物酶种类的变化情况.总的来说 ,随着发育的日趋成熟 ,同工酶的种
类逐渐减少 ,我们认为这与花柱的生长发育是相吻合的.因为从四分体时期一直到成熟期 ,是
花柱生长发育 ,细胞逐渐伸长的过程 ,在这过程中 ,过氧化物酶活性逐渐减弱 ,才能促进花柱细
胞的伸长 ,这与 Nicolas等人[ 2]的结论是一致的.
有资料表明[ 2] ,牵牛花柱中的过氧化物酶参与了自交不亲和反应 ,即未授粉或自花授粉的
花柱中存在着过氧化物酶活力 ,而亲和的异花授粉以后 ,发现花柱的引导组织中过氧化物酶活
力消失.由此看来 ,授粉过程内花柱中过氧化物酶活力的消失应是亲和反应的一个重要步
骤.本实验结果可见 ,花柱授粉以后 ,自 、异交谱带数目是一致的 ,但异交酶带染色较自交为
浅 ,这可定性地说明异交花柱中过氧化物酶活力比自交花柱低 ,这一发现与前面所提到的过氧
化物酶参与了自交不亲和反应的结论是基本吻合的.
3.2　酯酶同工酶存在于植物各部位和不同发育时期的细胞中 ,酯酶一般被作为研究发育时期
基因表达调控的一种标志酶.本实验结果表明:在沙田柚发育过程中 ,花柱酯酶同工酶种类在
授粉以前呈不规则变化 ,但授粉以后较授粉以前种类明显减少 ,且在发育的某些时期出现了特
征酶带 ,如四分体的 E3 ,E6和双核期的 E5.这些结果启示 ,酯酶同工酶可作为区分花柱发育
过程中某个特定时期的生理生化指标.
3.3　α-淀粉酶在植物体内主要参与淀粉的水解.植物的组织 、器官以至整体的生长 ,是以细
胞的生长为基础的 ,即通过细胞分裂和细胞伸长以增加细胞的数目和体积来实现的.又因为
细胞壁各种成分的含量 ,在分生组织细胞中是较低的 ,以后随着细胞的伸长 ,细胞壁各种成分
如果胶质 、纤维素和半纤维素等含量剧烈上升 ,可见细胞的伸长与细胞壁的伸长加大有极为密
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切的关系.据张仲鸣等人[ 4]研究报道 ,淀粉酶同工酶活性的变化与白皮松形成层的活动周期
有相关关系 ,即形成层休眠期其活性高 、酶带多 ,活动期其活性低 、酶带少.我们认为这与沙田
柚花柱 α_淀粉酶的变化趋势极为相似.本实验发现 ,在发育过程中 ,沙田柚花柱淀粉酶同工
酶种类及活性表现出强弱交替的变化曲线 ,即四分体时期酶种类最少 、活性最低 ,单核期有所
增加 ,双核期达最大值 ,成熟期有所回落 ,授粉以后又有所增加.沙田柚四分体时期 ,花柱细胞
以分裂为主 ,所以此时的酶种类最少 ,活性最低;单核期花柱细胞开始伸长 ,此时酶种类开始增
多 ,活性开始增大;双核期是生长的旺盛期 ,此时酶活性达到最大值;单核期和双核期为花柱细
胞伸长阶段 ,淀粉水解产生的糖类正好提供了细胞壁伸长所需的原料 ,所以这两个时期淀粉酶
种类多 ,活性大;到成熟期花柱生长基本停止 ,酶活性也随之下降;但授粉以后 ,由于花粉管的
生长 ,刺激了花柱淀粉酶活性的再一次升高 ,以提供合成花粉管壁所需的原料.
参 考 文 献
1　C C 赖　德等著.同工酶[ M].范培昌译.北京:科学出版社 , 1987.35～ 38
2　李雄彪 ,吴　琦.植物细胞壁[ M].北京:北京大学出版社 , 1993.87
3　胡能书 ,万贤国编.同工酶技术及其应用[ M].湖南:湖南科学技术出版社 , 1985.104 ～ 112
4　张仲鸣 ,崔克明等.白皮松形成层的活动周期及其多糖贮量和淀粉酶同工酶的变化[ J].植物学报 , 1997 ,
39(10):926 ～ 932
5　刘东旭 ,李子先等.不同染色剂对水稻酯酶同工酶电泳显色相对强度差异的影响[ J].北京农业大学学报 ,
1992 , 18(3):251～ 255
6　Ai Y , et al.Self_incompatibility in Petunia inflata:Isolation and characterization of cDNAs encoding three S_allele_associ-
ated proteins[ J] .Sex Plant Reprod , 1990 , 3:130
7　Broothaerts W J , et al.Purification and N_terminal sequencing of style glycoproteins associated with self_incompatibility in
Petunia hybrida[ J] .Plant Molecular Biology , 1989 , 14:93
THE ANALYSIS OF THREE ISOZYMES IN THE STYLE OF
CITRUS GRANDIS VAR.SHATINYU
LI Hong-yan　YANG Ji-hua　XUE Miao-nan
(Department of Biology , Guangxi Normal University , Guilin 541004 China)
Abstract:This article analyzes the types of three isozymes of shatinyu style during the process of the
pollen development.The result shows the types and activities of peroxide of shatinyu style gradually de-
crease during the process of development.The types of esterase have an irregular changing pattern before
pollination , but clearly decrease after pollination.The types and activity of Amylase change between
strong and week , that means the types and activity of it are the weekest at the tetrad stage , a little im-
provement at the mononuclear stage , reach maximum during di_nuclear stage , a little decrease during the
mature stage , a little improvement again after pollination.
Key words:Citrus grandis var.shatinyu;style;isozymes;peroxide;esterase;Amylase
(责任编辑　马殷华)
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