全 文 ：文章编号:1005-0930(2007)01-0017-06　　中图分类号:TQ446.2　　文献标识码:A
　收稿日期:2006-09-12;修订日期:2007-03-28
基金项目:北京市自然科学基金(项目编号 6032013)和北京市科委资助项目 (H 01201038011)
作者简介:贾小红(1967— ),男 ,推广研究员 ,博士研究生.
通讯作者:刘西莉(1969— ), E-m ail:seed ling@ cau. edu. cn.
北京地区紫花苜蓿根瘤菌接种剂的研制
贾小红 1, 2 , 　周顺桂 3 , 　李旭军 2 , 　黄中乔 4 , 　刘西莉 4*
(1.中国农业大学资源与环境学院 ,北京 100094;2.北京市土肥工作站 , 北京 100029;3.广东省生态环境与土
壤研究所 ,广东省农业环境综合治理重点实验室 ,广东广州 510650;4.中国农业大学农学与生物技术学院 , 北
京 100094)
摘要:紫花苜蓿(Medicago sativa Linn. )是营养价值很高的饲用作物 ,也是北京地
区大力发展的牧草品种之一 ,筛选与之共生固氮的根瘤菌 ,用于微生物肥料的生
产 ,具有重要意义. X J83073和 XJ83097为两株具有高效固氮活性的根瘤菌菌
株 ,根盘试验表明:接种 XJ83073和 X J83097的紫花苜蓿植株鲜重 (产量)较未
接种空白对照分别增加 12. 7%— 65. 2%和 25. 0%— 81. 0%. 摇瓶试验结果表
明 ,两株根瘤菌在 YMA培养基中适宜放罐时间分别为 30h和 36h,发酵液中根
瘤菌活菌数分别达 8. 9×109CFU /mL和 5. 1×109CFU /mL.本试验制备了种衣剂
与草炭剂两种剂型的根瘤菌接种剂. 盆栽试验表明 ,种衣剂处理苜蓿种子后其
产量较草炭剂型与未接种对照分别提高 17. 6%和 27. 9%. 进一步田间试验表
明 , X J83073和 X J83097两菌株包衣处理可使苜蓿地上部干重较对照分别增加
85. 9%和 69. 6%,增产效果显著.
关键词:紫花苜蓿;根瘤菌接种剂;固氮;根盘试验;田间试验
紫花苜蓿(Med icago sativa Linn. )是一种优良的饲用作物 ,有 “牧草之王”之称 ,其茎
叶柔嫩鲜美 ,不论青饲 、青贮 、调制青干草 、加工草粉 ,还是用于配制饲料或混合饲料 ,都具
有很高的营养价值[ 1-2] ,紫花苜蓿的地域适应性强 ,有助于当地的生态环境建设 [ 3] .
豆科植物与根瘤菌的共生固氮 ,是已知固氮能力最强的生物固氮体系 [ 4] . 紫花苜蓿
可以通过根瘤固氮获得生长所需的氮素营养 ,故生长期间可以少施氮肥 [ 5] ,这样既节约
了化肥用量 ,同时也减少了对土壤和水体的污染. 北京地区紫花苜蓿种植区多属于新种
植区 ,土壤内能与其结合共生固氮的根瘤菌数量很少 ,并且一种或几种根瘤菌只能在特定
的一种或几种紫花苜蓿根部结瘤固氮 [ 6-7] . 因此筛选适用于北京地区不同紫花苜蓿品种
的根瘤菌 ,研究根瘤菌接种剂的加工工艺 ,进一步研制复合微生物肥料 ,代替化肥的使用 ,
将会产生很好的经济效益和生态效益.
第 15卷 1期
2007年 3月
应用基础与工程科学学报
JOURNAL OF BASIC SC IENCE AND ENG INEERING
Vo.l 15, No. 1
M arch 2007
DOI牶牨牥牣牨牰牥牭牳牤j牣issn牣牨牥牥牭牠牥牴牫牥牣牪牥牥牱牣牥牨牣牥牥牫
1　材料与方法
1. 1　试验材料
供试紫花苜蓿品种:赛特 、三德力 、中苜一号 、CW300、WL323(北京市种子管理站 ,北
京 );供试根瘤菌菌株:X J83073、XJ83097、X J83060、NM48-2、NM024-2(中国农业大学生物
学院 ,北京);种衣剂本底 , (中国农业大学种衣剂研究中心 ,北京 );透明根盘 (20×8×30
cm
3 ,自制 );其它试剂均为市售分析纯.
YMA培养基:蒸馏水 1000mL;甘露醇 10. 0 g;酵母膏 3. 0 g;KH2 PO4 0. 25 g;K 2HPO 4
0. 25 g;CaCO3 3. 5 g;MgSO 4 7H2O 0. 2 g;氯化钠 0. 1 g;琼脂 15 g(配制固体培养基时加
入 );pH =6. 8— 7. 2.
YEM培养基:蒸馏水 1000mL;甘露醇 10. 0 g;酵母膏 3. 0 g;K2HPO4 0. 5 g;MgSO4
7H2O 0. 2 g;NaC l 0. 2 g;琼脂 17 g(配制固体培养基时加入);pH =6. 8— 7. 2.
523培养基:蒸馏水 1000mL;蔗糖 10. 0 g;M gSO4 7H2O 0. 3 g;K2HPO4 2. 0 g;NaC l
2. 0 g;酵母膏 10. 0 g;琼脂 20. 0 g(配制固体培养基时加入);pH =6. 8— 7. 2.
LB培养基:蒸馏水 1000 mL;胰蛋白胨 10. 0 g;酵母膏 5. 0 g;N aC l 10. 0 g;琼脂 10 ～
16 g(配制固体培养基时加入 );pH =6. 8— 7. 2.
种子罐和发酵罐灭菌条件:总过滤器保持 0. 2M Pa蒸汽 1 h , 0. 2MPa压缩空气吹干;在
121℃, 0. 14M Pa条件下对空气过滤系统 、种子罐和发酵罐灭菌 30m in,然后冷却至 28℃.
1. 2　试验方法
1. 2. 1　菌株的筛选　　以固体 YMA培养基活化各供试根瘤菌菌株 , 28℃恒温培养 2d.
然后接种到液体 YMA培养基中 ,以 160 r /m in、28℃摇瓶培养 30 h,平皿菌落计数法测定
活菌量 。将每种根瘤菌用液体 YMA培养基配制成菌悬液 (109 CFU /mL),按质量比 1 ∶
30拌种处理不同品种的紫花苜蓿种子 ,按 10株 /盘播种于透明根盘中 ,每个处理重复播种
3次 。不接种根瘤菌的处理为空白对照 ,出苗 40d后 ,测量植株鲜重.
1. 2. 2　根瘤菌发酵条件的选择　　将根瘤菌转接于各供试培养基斜面上 ,于 28℃恒温
培养箱中培养 2— 3 d后 ,观察菌落形态和大小等指标 ,选择培养性状最好的培养基作为
根瘤菌的最适活化培养基.使用 0. 85%的生理盐水将活化后的菌株稀释为 108 CFU /mL
菌悬液 ,按 1 ∶100(V /V)的比例分别接种于 200mL的 YMA、YEM 、523和 LB液体培养基
中 ,以 160 r /m in、28℃摇瓶培养 。 15 m in后开始第一次取样 ,之后每 4 h取样一次 。测定
不同液体培养基菌悬液的 OD 650值及 pH值 ,确定菌种的最适液体培养基和 pH条件. 在
发酵罐内搅拌速率 200 r /m in、通气量 1. 0 V /m in,罐压 0. 05M Pa的条件下 ,进行菌种发
酵 ,平皿菌落记数法测量不同发酵时间的活菌量 ,确定最佳放罐时间.
1. 2. 3　根瘤菌接种剂剂型加工　　根瘤菌草炭制剂的配制:将根瘤菌浓缩发酵液 85 L
与 300 kg草炭混合后加入 50 kg钾镁肥 (钾含量 8%)、650 g硼砂和 200 g钼酸铵 ,搅拌均
匀. 根瘤菌种衣剂的配制:将根瘤菌浓缩发酵液与种衣剂本底按照 1 ∶5(V /V)混合.
1. 2. 4　盆栽试验条件　　紫花苜蓿供试品种为WL323,根瘤菌株为 XJ83073. 土壤取自
北京市通州宋庄 ,为潮土 ,中壤质地 , 有机质含量 12. 22 g /kg,全氮 0. 63 g /kg,碱解氮 58. 5
mg /kg, O lsen-P 20. 7mg /kg,有效钾 127mg /kg.将土壤过 3 mm筛 ,日光下暴晒 2 d. 试验
中每盆 (35 cm ×35 cm)装土 14 kg,其中每公斤土中含有 0. 12 g P2O 5和 0. 16 g K2O作为
18 应用基础与工程科学学报　　　　　　　　　　　　　　Vo.l 15
基肥. 试验设 3个处理:分别为不接种空白对照 、接种根瘤菌草炭剂处理 (0. 12 g /盆)和
根瘤菌种衣剂包衣处理(种衣剂和紫花苜蓿种子的质量比 1∶30),晾干后播种 ,每盆点播
30粒种子 。出苗后每盆留苗 10株 ,待 50%植株开花后连根挖出 ,记录长度大于 5 cm的
分枝数量 ,测量紫花苜蓿生物量 、株高 (分枝点至生长点 )和根系干重 ,重复 4次.
1. 2. 5　田间试验条件 　　紫花苜蓿供试品种为 WL323, 根瘤菌株为 X J83073和
XJ83097,试验地点为北京市昌平区. 试验设 3个处理:不含根瘤菌的种衣剂本底包衣处
理种子为对照 ,其它处理分别使用 X J83073和 XJ83097根瘤菌种衣剂包衣紫花苜蓿种子 ,
每个处理重复 3次. 播种前分别使用种衣剂本底 ,不同的根瘤菌种衣剂按照 1 ∶30质量
比包衣紫花苜蓿种子 ,阴干后播种. 测量地上部干重 、结瘤数 、株高和根长 ,分析紫花苜蓿接
种根瘤菌的增产效果.
2　结果与讨论
2. 1　根瘤菌的筛选
由表 1可知 ,不同品种的供试紫花苜蓿分别接种根瘤菌 X J83073、XJ83097、XJ83060、
NM48-2、NM 024-2,生长 40d后测定其植株鲜重 (产量). 结果表明 ,接种根瘤菌 XJ83073、
XJ83097后 ,均可明显地提高各紫花苜蓿的产量 ,其中 XJ83073处理的增产幅度为 13.
7%— 65. 2%, XJ83097处理的增产幅度为 25. 0%— 81. 1%,其它几种供试的根瘤菌接种
后仅对个别种紫花苜蓿表现出较好的增产效果. 说明根瘤菌 XJ83073和 X J83097与北京
地区种植的主要紫花苜蓿品种具有较强的亲和性 ,是适合于此地区紫花苜蓿共生固氮的
高效根瘤菌菌株.
表 1　根盘试验条件下接种根瘤菌对紫花苜蓿植株鲜重(产量)的影响
Tab le 1　E ffects ofRhizobium stra ins on plan t fresh w e ight( y ie ld ) of alfa lfas in roo t-po t tests
菌株 不同品种紫花苜蓿的鲜重 (g /株)赛特 三德力 中苜一号 CW300 WL323
对照(CK) 4. 4a 5. 0a 5. 1ab 3. 7a 4. 6a
X J83073 5. 4b(22. 7%) 6. 8b(36. 0%) 5. 8bc(13. 7%) 5. 8b(56. 8%) 7. 6bc(65. 2%)
X J83097 5. 5b(25. 0%) 6. 9b(38. 0%) 6. 9c(35. 3%) 6. 7c(81. 1%) 8. 1c(76. 1%)
X J83060 4. 1a( - 6. 8%) 6. 2b(24. 0%) 5. 4b(5. 9%) 3. 9a(5. 4%) 6. 8b(47. 8%)
NM48-2 5. 4b(22. 7%) 4. 5a( - 10. 0%) 4. 2a( - 17. 6%) 3. 5a( - 5. 4%) 4. 6a(0. 0%)
NM024-2 4. 5a(2. 3%) 4. 1a( - 18. 0%) 4. 6a( - 9. 8%) 6. 2bc(67. 6%) 7. 8bc(69. 6%)
　　　注:相同列中相同字母表示差异不显著(P<0. 05),下同. 括号内数据为与相同苜蓿品种的对照相比 ,重量增加
百分比(%).
2. 2　根瘤菌发酵条件的选择
将活化后的 X J83073和 XJ83097菌种分别接种于 YMA、YEM 、LB和 523 4种液体培
养基中 ,结果如图 1所示 , X J83073经历 12 h左右的迟缓期 ,然后进入对数生长期 , 32 h
后逐渐进入稳定期;XJ83097的迟缓期稍长 ,为 16 h ,但是 28 h后即进入稳定期 , X J83097
在不同供试培养基中的生物量均低于 XJ83073的生物量。 X J83073在 4种培养基中的吸
光度随培养时间的变化基本一致 ,表明 4种培养基均适合 X J83073的生长;X J83097在 4
种培养基中的生长差别较大 ,在 YMA培养基中生长最好 ,因此选择 YMA培养基作为
XJ83073和 XJ83097进一步扩大培养的适宜培养基.
19No. 1 贾小红等:北京地区紫花苜蓿根瘤菌接种剂的研制
图 1　不同培养时间内 X J83073和 XJ83097在 4种液体培养基中的 OD650值
F ig. 1　The OD650 of X J83073 and XJ83097 ferm ent suspension in fourm edia at differen t incuba tion time
　
图 2　不同培养时间内 XJ83073和 XJ83097
在发酵罐中的活菌量
F ig. 2　The co lon ie s ofRhizobium XJ83073
and XJ83097 in fe rmenta tion cy linder
a t differen t incuba tion time
　　通常认为 ,发酵液中活菌量达 109 CFU /
mL,且维持在该数量级水平上的时间达 6 h,
则可视为达到最佳放罐时间. 从图 2可以看
出 ,根瘤菌 XJ83073发酵 24 h后活菌量即超
过 109 CFU /mL,因此确定 30 h为 X J83073
的最佳放罐时间 ,此时活菌量达到 8. 9×109
CFU /mL;而 XJ83097在发酵 30 h后才达到
10
9
CFU /mL,其最佳放罐时间为 36 h,此时
活菌量达到 5. 1×109 CFU /mL. 两种菌的活
菌数均达到根瘤菌肥料农业部标准 (NY410-
2000)[ 8]所要求的 2×108 CFU /mL的标准 ,
pH值也均在规定的 6. 0— 7. 2之间.
2. 3　盆栽试验结果
采用盆栽试验研究了两种剂型 (草炭剂
拌种和种衣剂包衣)对紫花苜蓿生长的影响 ,结果如表 2所示. 与不接种根瘤菌的空白对
照相比 , X J83073的草炭剂拌种及其根瘤菌种衣剂包衣处理的紫花苜蓿地下部干重 、分枝
数 、株高 、地下部生物量均明显增加;根瘤菌种衣剂包衣处理种子后 ,紫花苜蓿各项生物学
指标均优于草炭剂型拌种处理 ,且在生产中 ,包衣处理的种子表面光滑 ,易于机械化播种 ,
是一项值得推广的实用技术。
表 2　两种根瘤菌剂型对紫花苜蓿生长的影响
Tab le 2　E ffec t o f tw o fo rmu la tions ofRhizobium stra ins X J83073 on the grow th of alfa lfa
处理 地下部干重(g /株)平均值 增量(%)
分枝数(枝 /株)
平均值 增量(%)
株高(cm)
平均值 增量(%)
地上部生物量(g /株)
平均值 增量(%)
CK 1. 53c — 3. 4b — 40. 2b — 2. 97b —
草炭剂型 1. 90b 24. 2 4. 1a 20. 6 47. 1a 17. 2 3. 23b 8. 8
种衣剂 2. 20c 43. 8 4. 3a 26. 5 52. 0a 29. 4 3. 80a 27. 9
20 应用基础与工程科学学报　　　　　　　　　　　　　　Vo.l 15
2. 4　根瘤菌田间试验结果
分别种植经 X J83073和 XJ83097根瘤菌种衣剂包衣处理的紫花苜蓿种子于田间 ,待
生长成熟后测定地上部干重 、结瘤数 、株高及根长的 3次平均值 ,结果如表 3所示 ,与空白
对照相比 , XJ83073和 X J83097根瘤菌种衣剂包衣处理可使紫花苜蓿地上部产量分别增
加了 64. 7%和 88. 2%;结瘤数 、株高 、根长与对照相比均有不同程度地增加。因此综合田
间试验结果 ,说明 XJ83097和 X J83073是两株高效根瘤菌株 ,能与北京地区的紫花苜蓿主
栽品种形成良好的共生固氮关系.
表 3　各处理紫花苜蓿的地上部干重和结瘤数
Tab le3　Dry w eight upg round and nodule num be r o f a lfalfa w ith differen t treatment in fie ld trials
菌株 地上部植株干重(g /株)平均值 增量%
结瘤数(个 /株)
平均值 增量%
株高(cm)
平均值 增量%
根长(cm)
平均值 增量%
CK 0. 17 — 4. 9 — 13. 0 — 9. 6 —
XJ-83073 0. 28 64. 7 7. 0 42. 9 13. 4 3. 1 11. 8 22. 9
XJ-83097 0. 31 88. 2 6. 4 30. 6 14. 9 14. 6 12. 6 31. 3
3　结论
(1)根盘试验表明:接种根瘤菌 X J83073和 XJ83097后 ,紫花苜蓿的植株重量 (产量)
分别较空白对照增加 13. 7%— 65. 2%和 25. 0%— 81. 0%, X J83073和 X J83097为两株具
有高效固氮活性的根瘤菌菌株;
(2)确定 YMA为根瘤菌 XJ83073和 XJ83097的最适培养基 , XJ83073和 XJ83097的最
佳放罐时间分别为 30 h和 36 h ,活菌数分别达到 8. 9×109 CFU /mL和 5. 1×109 CFU /mL;
(3)盆栽试验表明 ,根瘤菌种衣剂处理苜蓿种子的地上部生物量较对照提高 27. 9%,
草炭剂处理苜蓿种子后其产量较对照提高 8. 8%,根瘤菌种衣剂包衣处理苜蓿种子的增
产效果优于草炭剂处理;
(4)田间试验表明 , X J83073和 XJ83097根瘤菌种衣剂处理可分别使紫花苜蓿地上部
产量较对照增加 64. 7%和 88. 2%,增产效果显著.
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Developm ent and Application ofRhizobium StrainsAgents
for A lfalfa (Medicago sativa L inn. ) in Beijing Region
JIA X iaohong
1, 2 , ZHOU Shungui3 , LIXu jun2 , HUANG Zhongqiao4 , LIU Xili4*
(1. C ollege of Resou rces and E nvironm ental S ciences, Ch ina Agricu ltural University, B eijing 100094, Ch ina; 2.
Bei jing soil and ferti lizerw orking station, B eijing 100029, Ch ina;3. G uangdong Institute ofE co-E nvironmental and Soil
S cien ces, Guangdong Key Laboratory ofAg ricu ltu ralEnvironm en t In tegratedC on trol, Guangzhou 510650;4. C ollege of
Agricu ltu re and B iotechnology, Ch ina Agricu ltu ralUn iversity, Bei jing 100094, C hina)
Abstract
A lfa lfa (Medicago sativa Linn. ) plants are high nutritional feed crops, which are one o f
the ma in ly deve loping forage g rasses in Bei jing reg ion. It would be meaningfu l to screen
Rhizobium strainsw ith h igh symbiotic nitrogen fixa tion activ ity for develop ing m icrob ialmanu re
agen ts. XJ83073 and XJ83097 we re se lected as e fficient Rh izobium stra ins w ith symbio tic
ability w ith alfalfa va rie ties ex tended in Bei jing region. The results ofRoot-pot tests show ed that
the fresh w e ight o f alfalfa inoculated w ith Rh izobium strains XJ83073 and XJ83097 increased
13. 7% ～ 65. 2% and 25. 0% ～ 81. 0%, respectively, as compared to the contro .l YMA(yeast
ma lt aga r )was found to be an optimum medium fo r the cu lture o f X J83073 and XJ83097.
There is 8. 9 ×109 and 5. 1 ×109 CFU (colony-form ing unit) in 1 m illiliter XJ83073 and
XJ83097 suspension afte r fermen tation for 30h and 36h, respective ly. Two formula tions
containing peat-based and seed coa ting inocu lants we re deve loped as Rh izobium strains agents
fo r alfalfa. Pot experiments indicated that the y ield of alfalfa treated by seed coa ting formulation
(SCF) of XJ83073 w as significantly higher than that from peat-based formulation and the contro.l
F ield tria ls further revealed tha t the dry w eight upground of alfalfa treated by SCFs of XJ83073 and
XJ83097 we re 85. 9% and 69. 6% h ighe r than that o f non-inocu lated treatment, respectively.
Keywords:Medicago sa tiva Linn. ;Rhizobium;nitrogen fixa tion;roo t-po t test;field trial
22 应用基础与工程科学学报　　　　　　　　　　　　　　Vo.l 15