全 文 ：天然产物研究与开发 NatProdResDev2007, 19:939-943
文章编号:1001-6880(2007)04-0939-05
　
　
　收稿日期:2007-01-29　　　接受日期:2007-03-13
＊通讯作者 Tel:86-27-87792264;E-mail:yulongjiang@hust.edu.cn
放大培养对岩黄连细胞悬浮培养的影响
程　华 1, 2 ,张同存 2 ,熊　斌 1 ,朱　凡 2 ,余龙江 3＊
1武汉科技大学医学院 ,武汉 430065;2武汉烟草(集团)有限公司技术中心 ,武汉 430051;
3华中科技大学生命科学与技术学院 ,武汉 430074
摘　要:为了优化岩黄连细胞悬浮培养的条件 , 研究了在放大培养过程中 , 岩黄连细胞生长与主要营养成分的
代谢动力学 , 以及生物碱的产生情况。结果表明 , 在不同培养体系下 ,细胞生长曲线均呈现 “S”型。随着培养体
积从 50、 100 mL放大到 500 mL和 1 L, 培养液中碳源 、氮源和磷源的消耗减慢 ,细胞生物量减少 ,生物碱产量降
低。其中 100 mL培养体系所获生物量最高 , 达到 15.2 g/L, 生物碱产量也最高 , 脱氢卡维丁为 8.35 mg/mL,小
檗碱为 4.58mg/mL。根据本文结果 ,提出了岩黄连细胞培养条件的优化和大规模细胞培养生产岩黄连生物碱
应采取的策略 。
关键词:细胞培养;岩黄连;脱氢卡维丁
中图分类号:Q942 文献标识码:A
EfectsofScale-upCultivationonCelSuspensionCultures
ofCorydalissaxicolaBunting
CHENGHua1, 2 , ZHANGTong-cun2 , XIONGBin1 , ZHUFan2 , YULong-jiang3＊
1MedicalColege, WuhanUniversityofScienceandTechnology, Wuhan430065 , China;
2CenterofTechnology, WuhanTobaccoGroupCo., Ltd., Wuhan430051 , China;
3ColegeofLifeScienceandTechnology, HuazhongUniversityofScienceandTechnology, Wuhan430074 , China
Abstract:Inscale-upcellsuspensionculturesofCorydalissaxicolaBunting, celgrowth, nutrientconsumptionandalka-
loidproductionswereinvestigatedtooptimizethecultureconditions.Theresultsshowedthatalthoughcellswerecultivat-
edatdiferentconditions, thegrowthcurveswereall“S” shaped.Totalcarbohydrate, nitrateandphosphatewereassimi-
latedgradualythroughoutthegrowthperiod, andthenutrientconsumptionsweredepressedwiththeculturevolumein-
creasedfrom50and100mLto500mLand1L, respectively.Thescale-upculturesalsoresultedindecreaseofbiomass
andalkaloidproductions.Thehighestbiomassandproductionsofdehydrocavidineandberberinewereobtainedin100-
mLcultures, with15.2g/L, 8.35 mg/mLand4.58 mg/mL, respectively.Accordingtotheresults, strategieswerefor-
wardedtooptimizecultureconditionandtopromotealkaloidproductionsbylarge-scaleofC.saxicolacels.
Keywords:celsuspensionculture;CorydalissaxicolaBunting;dehydrocavidine
　　岩黄连(CorydalissaxicolaBunting), 紫堇科紫
堇属植物 ,多年生草本 [ 1] 。全草含脱氢卡维丁(de-
hydrocavidine)、小檗碱(berberine)等多种活性生物
碱成分 [ 2] ;是桂西北山区常用于消炎止痛 、排毒 ,治
疗急慢性肝炎和肝硬化等疾病的一种中草药 [ 2] 。
岩黄连野生资源少 ,被列入中国南部石灰岩濒危植
物名录 [ 1] 。目前制成岩黄连总生物碱的注射液和
片剂 ,临床主治肝炎 ,疗效较佳 ,特别是对乙型肝炎 、
肝硬化 、肝癌等 [ 3] 。由于岩黄连巨大的经济价值 ,
引起人们大量采挖和收购 ,导致岩黄连资源匮乏。
因此 ,有必要考虑开发其它途径来获得更多的岩黄
连资源 ,维持其可持续开发利用。
植物悬浮细胞培养是利用现代生物技术开发植
物资源的重要手段之一 [ 4-6] ,是一种可持续开发利用
植物资源的重要措施 [ 4] ,为大规模反应器培养和工
业化生产提供依据 ,同时是一种缓解资源危机的潜
在有效方法。我们已经建立岩黄连的细胞悬浮培养
体系 ,并确定其中含有脱氢卡维丁 、小檗碱等活性生
物碱成分 [ 7] 。如能实现岩黄连细胞的大规模培养 ,
将为解决岩黄连资源短缺提供新的方法 。本文对岩
黄连细胞在摇瓶放大培养中的生长和营养物质代谢
动力学进行研究 ,分析在不同摇瓶培养体系中细胞
生长 、营养物质消耗和生物碱合成情况 ,以期为培养
条件的优化和大规模细胞培养生产岩黄连生物碱提
供参考依据 。
1　材料与方法
1.1　实验材料
脱氢卡维丁标准品购于中国生物制品检定所
(批号:111667-200401), 小檗碱标准品购自美国
Sigma公司(批号:119H0687)。岩黄连细胞悬浮的
建立和培养条件参考文献 [ 7] 。培养基为改良的 B5
(Gamborg)培养液 ,添加 0.5 mg/L2, 4-D, 2 mg/L
BA和 30 g/L蔗糖。温度 25 ℃,摇床转速 130rpm,
暗培养 。
1.2　摇瓶培养
使用 150 mL三角瓶 ,分装 50 mL培养液 ,接种
密度 10%, 25 ℃, 130 rpm摇床培养 。 250 mL三角
瓶 ,分装 100mL培养液进行摇瓶培养 。使用 2L三
角瓶 ,分装 500 mL培养液 ,接种密度 10%, 25 ℃,
130rpm摇床培养。采用多个 3 L三角瓶 ,分装 1 L
培养液 ,每瓶接种 10%鲜细胞 ,于 25℃, 130rpm摇
床培养 。
1.3　培养液中总糖 、磷酸盐 、硝酸盐和铵盐的含量
测定
培养液中总糖的测定采用 3, 5-二硝基水杨酸
(DNS)法[ 8] 。将 1 mL适当稀释的培养液置于试管
中 ,加入 1mL6 mol/L盐酸 ,在沸水中消化 10 min,
立即用冷水冷却 ,加入 2滴酚酞试剂 ,用 10%氢氧
化钠滴定至微红 ,定容到 10 mL。再用 DNS法测定
其中的还原糖。利用公式换算成总糖含量 ,总糖 =
样品水解后还原糖 mg数 ×样品稀释倍数。
磷酸盐的测定采用磷钼蓝显色法 [ 9] 。测定时
吸取 1 mL适当稀释的培养液于试管中 ,加入 2 mL
水和 3mL定磷试剂 ,立即混匀 ,于 45℃水浴中加热
25 min,取出冷却至室温 ,测定 660 nm处的吸光值 。
根据标准曲线计算磷酸盐含量 。
铵盐的测定采用茚三酮法[ 8] 。吸取 2 mL适当
稀释的培养液 ,加 3 mL茚三酮试剂 , 0.1 mL1%的
抗坏血酸 ,混匀。盖上漏斗或球形盖 , 沸水浴 15
min,试管从水中取出后 ,间歇搅拌并于空气中冷却
15 min。加热形成的红色茚满酮在冷却和氧化而退
色 ,得到茚三酮与氨基酸的蓝紫色反应产物 ,在 580
nm下测定吸光值。
硝酸盐的测定采用锌粉还原法 [ 9] 。吸取 1 mL
适当稀释的培养液 ,加入 1%乙酸和 0.8mol/L的乙
酸钠 4.0 mL, 摇匀后 ,加入 20 mg锌粉 , 摇动 20
min,过滤 ,取滤液 4 mL,加入 1 mLα-萘胺-磺胺试
剂 ,摇匀 10 min后 ,测定 540 nm处的吸光值 。根据
标准曲线计算硝酸盐的含量 。
1.4　细胞生长的检测
培养物用布氏漏斗抽滤 ,得到的细胞用多倍体
积蒸馏水充分洗涤 ,抽干后称取细胞湿重 , 然后于
50 ℃烘箱中烘干 ,冷却后称取干重 。以细胞干重作
为细胞生长的依据 。
1.5　生物碱含量测定
参考文献 [ 7]方法。将烘干的细胞研磨成粉末 ,
精确称取 100mg,加 5 mL75%乙醇(含 1%盐酸),
室温下超声提取 3次 ,每次 1 h,过滤去沉淀 ,滤液用
氨水调至 pH9.0,然后用 5mL氯仿萃取 ,加少量无
水硫酸钠 ,过滤 ,滤液加热蒸干 ,加入 0.1mL甲醇溶
解备用。取 5mL培养液 ,氨水调 pH值为 9.0,然后
用 5 mL氯仿萃取 ,加少量无水硫酸钠 ,过滤 ,滤液加
热蒸干 ,加入适量甲醇溶解备用。上样前过 0.45
μm滤膜 ,取 10μL上样 ,采用 Waters510液相色谱
仪 , C18柱 (DikmaDiamonsil, 5 μm, 250 mm×4.6
mm),流动相为乙腈:水(40:60),每升流动相加 3.4
g磷酸二氢钾和 1.7gSDS,检测波长 345nm,流速 1
mL/min,柱温:室温。
色谱峰与标准品进行对照 ,测定样品中脱氢卡
维丁和小糪碱的含量。
图 1　不同摇瓶培养中细胞生长状况
Fig.1　Timecourseofcelgrowthindiferentflaskcul-
tures.Valuesaremeansofthreeindependent
cultures
Errorbarsrepresent±S.D.□, 50 mLmedium;○, 500mLme-
dium;△, 100mLmedium;▼ , 1Lmedium.
940 天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.19
2　结果与分析
2.1　放大培养对岩黄连细胞生长的影响
　　不同摇瓶培养对细胞生长有显著影响 。如图 1
所示 ,随着培养液体积的增大 ,细胞生长被延迟 。用
50mL培养液时 ,细胞生长快速 ,在第 15d达到最高
12.1g/L,之后生物量逐渐降低。从 50 mL放大到
500mL时 ,细胞生长缓慢 ,生物量到 24 d才达到最
高 。 100mL培养时 ,所获得细胞生物量最高 ,第 18
d达到 15.2 g/L,进入稳定期后 ,生物量基本保持不
变 。放大到 1 L摇瓶培养时 ,细胞生长减慢 ,生物量
到 28 d才达到最大值 ,此时获得的生物量比 100 mL
培养时降低了 35%。
2.2　放大培养对总糖消耗的影响
图 2显示不同培养中总糖消耗曲线。总糖消耗
曲线基本相似 ,随着培养时间的延长 ,培养液中总糖
含量逐渐减少并最终降低为 0。随着培养液体积的
从 50mL增大到 1L,总糖消耗的时间逐渐减缓。 50
mL培养液种总糖消耗最快 , 1 L培养液中总糖消耗
最慢。在培养中期 , 100mL培养液中总糖浓度降低
超过 50 mL培养体系。
图 2　不同摇瓶培养中总糖消耗曲线
Fig.2　Metaboliccurvesoftotalsugarindifferentflask
cultures.Valuesaremeansofthreeindependent
cultures
Erorbarsrepresent±S.D.□, 50mLmedium;○, 500mLmedi-
um;△, 100mLmedium;▼ , 1Lmedium.
2.3　放大培养对磷酸盐消耗的影响
　　在不同的培养体系 ,培养液中磷酸盐浓度均下
降非常快速 , 在培养的中期 , 几乎被完全吸收 (图
3)。 100 mL培养液中磷酸根含量的下降速度略快
于 50mL培养体系 ,于第 6 d降到 4.7 mg/mL。 1 L
培养体系中磷酸根的消耗速率在培养的前 6d快于
图 3　培养液中磷酸盐消耗曲线
Fig.3　Themetaboliccurvesofphosphateindifferent
flaskcultures.Valuesaremeansofthreeinde-
pendentcultures
Errorbarsrepresent±S.D.□, 50mLmedium;○, 500mLmedi-
um;△, 100mLmedium;▼ , 1Lmedium.
500 mL培养体系 ,但在培养 10d之后 , 500mL培养
体系中磷酸根的消耗速率超过 1L培养体系 。
2.4　放大培养对含氮盐消耗的影响
图 4　不同培养体系中含氮盐的消耗曲线
Fig.4　Themetaboliccurvesofnitrateandammoniumin
differentflaskcultures.Valuesaremeansofthree
independentcultures
Errorbarsrepresent±S.D.□, 50mLmedium;○, 500 mLmedi-
um;△, 100mLmedium;▼ , 1Lmedium.
　　随着培养时间的延长 ,培养液中的含氮盐(包
括铵盐和硝酸盐)逐渐被消耗 。由图 4可以看出 ,
不同培养体系种含氮盐的浓度曲线基本相同 。随着
培养体系的增大 ,含氮盐的消耗速率依次降低。 50
mL培养液中含氮盐被利用得最快 ,至第 15 d左右
基本全部被吸收 , 1 L培养液中含氮盐被利用得最
慢 ,到第 25 d左右才被完全吸收 。
941Vol.19 程　华等:放大培养对岩黄连细胞悬浮培养的影响
2.5　放大培养对生物碱产量的影响
表 1　不同培养类型对生物碱产量的影响
Table1　Efectofdifferentculturetypesonalkaloidproduction
inC.saxicolasuspensioncultures
培养类型
Culturetype
取样时间
Harvestday
细胞干重
Drybiomass
(g/L)
生物碱产量 Alkaloidproduction
Dehydrocavidine
(mg/mL)
Berberine
(mg/mL)
50-mL 15 12.1 ± 0.80 7.51 ± 0.18 4.06 ± 0.27
100-mL 18 15.2 ± 0.53 8.35 ± 0.24 4.58 ± 0.32
500-mL 24 11.7 ± 0.38 7.63 ± 1.18 3.32 ± 0.45
1-L 28 9.50 ± 0.57 4.12 ± 0.74 2.10 ± 0.36
　　ThesuspensioncultureswerecultivatedinB5 mediumcontaining
0.5mg/mL2, 4-Dand2mg/mLBAonarotaryshaker.Dataareex-
pressedasmeans±S.D.(n=3).
　　表 1显示不同摇瓶培养对生物碱产量的影响 。
不同培养体系中 ,生物量达到最大时所化时间不同 ,
随着培养体系的扩大 ,培养时间从 15 d增加到 28
d。分别在生物量最高时取样进行生物碱含量测定 ,
发现 100mL培养体系中生物碱含量最高 ,脱氢卡维
丁的含量达到 8.35 mg/mL,比 50 mL体系提高了
11%;小檗碱的含量为 4.58 mg/mL,比 50 mL体系
提高了 13%。当培养体积从 100 mL增加到 1 L,生
物碱含量逐渐降低 。 1 L培养体系中 ,脱氢卡维丁
的含量只有 4.12 mg/mL, 为 100 mL培养体系的
49%;小檗碱的含量为 2.10mg/mL,为 100mL培养
体系的 46%。
3　讨论
在植物细胞培养中 ,常采用逐级增加体积的容器
将优良的细胞株经过多次扩大繁殖得到大量细胞 ,以
逐步实现植物细胞的大规模培养[ 6, 10] 。本文对岩黄
连细胞悬浮放大培养进行研究 ,发现在不同摇瓶培养
中岩黄连细胞生长曲线的差异并不大 ,基本呈现 “S”
型 ,在 0 ～ 6 d内增长缓慢 ,快速增长期一般持续 6 ～
12d,在一个生长周期内细胞生物量可增加 4 ～ 6倍
左右 。其中细胞在 100 mL培养体系中生长最快 ,生
物量也最高。随着培养体积进一步扩大 ,细胞生长速
率明显减慢 ,生物量降低 ,生物碱产量也显著减少。
从表 2得知 ,在 100 mL体系中岩黄连细胞的倍增时
间最短 ,生长指数最大 ,最大生长率最高。说明 100
mL培养体系更适合岩黄连细胞的生长和生物碱合
成 ,而进一步的摇瓶放大培养则不利于岩黄连细胞生
长和生物碱的积累 ,因此有必要对放大培养中的影响
因素进行分析 ,调整放大培养策略。
表 2　岩黄连细胞悬浮培养的倍增时间 、生长指数 、最大比
生长率 、最大生物量和生物碱最大产量
Table2　Doublingtime, growthrate, maximumspecificgrowth
rateandmaximum biomass, maximumalkaloidpro-
ductioninsuspensionculturesofC.saxicola
指标
Criterion
培养类型 Culturetype
50mL 100mL500mL 1 L
Doublingtime(d) 10.7 9.1 11.3 16.9
Growthrate(g/L· d) 0.88 1.39 0.83 0.47
Maximumspecificgrowthrate(g/d) 3.40 3.49 2.91 2.73
Maximumbiomass(g/L) 12.1 15.2 11.7 9.5
Maximumalkaloidproduction＊(mg/L) 11.2 12.9 10.9 6.2
　　＊Maximumalkaloidproductionincludedproductionsofdehydrocavi-
dineandberberine.
　　对培养液中的营养成分进行测定分析 ,发现培
养体系从 50 mL增大到 100 mL时 ,碳源 、磷源和氮
源的吸收速率未见明显变化 ,而培养体系从 100 mL
增大到 1 L时 ,碳源 、磷源和氮源的吸收速率明显降
低。碳 、氮 、磷元素的吸收速率与细胞生长以及生物
碱的合成密切相关。延迟期 ,这些营养物质消耗缓
慢 ,细胞生长慢 ,生物碱含量低;进入快速生长期后 ,
营养成分被快速吸收 ,为细胞生长代谢提供能量和
物质基础;到生长后期 ,由于营养植物消耗殆尽 ,细
胞生长受阻 ,生物量出现缓慢下降 。表明培养基中
营养物质的吸收决定了细胞生长的快慢和生物碱产
量的高低 。而根据植物细胞生长及代谢的需求 ,调
整培养基组分和培养条件 ,使生长和代谢都能在最
适的条件下 ,进行两步法培养 ,能较好的解决细胞生
物量增长与次生代谢产物积累之间的矛盾 ,提高次
生代谢产物的产率[ 11, 12] 。比较岩黄连细胞悬浮培
养过程中 ,大量元素的相对消耗速率 ,发现磷 >氮 >
碳 ,在大量元素中无机磷消耗最快 ,其中氮和磷在细
胞进入快速生长中期几乎耗尽 ,提示氮和磷可能是
影响岩黄连细胞放大培养的主要营养成分 ,在进一
步进行放大培养的过程中 ,应该补给足够的氮源和
磷源 。郭志刚等 [ 13]在研究紫杉细胞悬浮培养过程
中 ,得到了相似的结果 ,认为氮 、磷和钾是影响细胞
培养的主要因素。 Pan等 [ 14] 通过补给氮源提高了
喜树细胞的生物量和次生代谢产物———喜树碱的产
量。姜绍通等 [ 15]研究发现磷是霍山石斛类原球茎
细胞悬浮生长的限制性因素 ,提高磷的起始浓度有
利于多糖产物的积累。
悬浮培养的植物细胞的生长与次生代谢产物合
成常受培养环境的影响 。实验中观察发现 ,在 500
942 天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.19
mL和 1 L体系培养过程中 ,培养液的表面出现大量
泡沫。这会导致培养液中溶氧量的降低 ,从而抑制
岩黄连细胞的生长。此外 ,在同样转速下 ,体积大的
培养体系内部的传质效率比体积小的培养体系的传
质效率低 ,这也会影响到细胞生长和生物碱合成 。
提示我们 ,在进一步放大培养中 ,应考虑溶氧 、传质
等因素 。尽管本实验中所使用的培养基均为改良
B5培养基 ,但由于培养液和培养容器体积的扩大 ,
造成细胞外部条件的差异 ,从而使得不同培养体系
中岩黄连细胞的倍增时间 、生长指数 、最大生长率 、
最大生物量 、最大生物碱产量存在显著的差别(表
2)。目前人们设计出多种类型的生物反应器来实
现植物细胞的大规模培养 [ 16-19] ,其中气升式生物反
应器具有切变低 、混合好的优点 ,可以避免叶轮转动
轴封口处的污染 ,适宜高密度培养和粘度较大的系
统 [ 20, 21] ,适合岩黄连细胞的生长特点 ,可考虑用于
岩黄连细胞的进一步放大培养 。
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