全 文 ：岩黄连注射液的高效液相色谱质谱联用指纹图谱研究
刘思明 1, 2 , 胡　坪 1 , 罗国安 1, 2* , 王义明 2 , 陈令新2
(1. 华东理工大学 化学与制药学院中药现代化工程中心 , 上海 200237;2. 清华大学 药物研究所 , 北京 100084)
摘要:目的　建立岩黄连注射液的指纹图谱。方法　色谱部分采用高效液相色谱梯度洗脱法 , 色谱柱为
K rom asil 100-10C
18
柱(250 mm ×4. 6 mm ID, 5 μm);流动相为乙腈和水;流速为 0.5 mL m in - 1;在 254 nm 波长下进
行分析。质谱部分采用电喷雾离子阱质谱分析 ,正离子扫描方式。结果　通过 LC M/ S对其中的 11种主要成分进行
了指认 , LC /UV对其中的 2种成分进行了定量评价。结论　所建指纹图谱能体现岩黄连注射液的特点 ,相似度评价
和方法学考察结果良好 ,可用于质量控制及定量测定。
关键词:HPLC /UV M/ S;指纹图谱;岩黄连注射液
中图分类号:R917　　　文献标识码:A　　　文章编号:0513 - 4870(2005)09 - 0846 -04
收稿日期:2004-12-06.
基金项目:科技部重大技术标准专项资助项目(2002BA906A29-
3).
*通讯作者　Tel:86 - 10 - 62772263,
E-m ai l: luoga@ chem. tsinghua. edu. cn
HPLC fingerprint for theCoryda lis saxicola Bunting injection
LIU Si-m ing1, 2 , HU Ping1 , LUO Guo-an1, 2* , WANG Y i-m ing2 , CHEN Ling-x in2
(1. Modern Eng ineering Center for Traditional Ch ineseM ed icine, School of Chem istry and Pharmaceutics, East-Ch ina University of
Science and Technology, Shangha i200237 , Ch ina;2. Institute of Materia Medica , Tsinghua Un iversity, B eijing 100084 , Ch ina)
Abstract:A mi 　To estab lish the fingerprint o fCoryda lis saxicola Bunting in jec tion. M ethods　 It
w as perfo rmed by HPLC K rom asil co lumnw as used w ith acetonitrile andH 2O as mobile phase. The flow
ra te was 0.5 mL min- 1. The de tection w ave leng th w as 254 nm. The mass spectrome try de tection w as
performed on a trap equ ipped w ith an ES I inte rface and operated in positive-ionization mode. Results
E leven components o fCoryda lis saxicola Bunting we re identified by LC-MS and 7 of them we re quantified.
Conc lusion　 The fingerprint chromatog ram could rep resent the characte ristics o f Coryda lis saxicola
Bunting in jec tion. Eva luation of resemblances and results of p recision w ere satisfactory. Thismethod cou ld
be used as quality and quantity contro.l
Key words:HPLC /UV M/ S;fingerprint;Coryda lis saxicola Bun ting injection
　　随着各种联用技术方法应用和信息量的加大 ,
中药指纹图谱的定性和定量方法更加深入和多元
化 。本实验室在指纹图谱的研究方面 ,发掘了多样
化检测技术在指纹图谱建立方面的应用性 ,致力其
应用于实际质量评价研究方面[ 1, 2] 。岩黄连
(Corydalis saxicola Bunting)为罂粟科紫堇属植物 ,
药用根部或全草 , 有消热解毒 、消肿 、止痛等功
效 [ 3] 。目前国内关于岩黄连的相关研究较少 [ 4, 5] ,
其注射液的质量控制仍然停留在单一成分的检测水
平上 。本文通过对岩黄连注射液指纹图谱中的定性
和定量二方面的深入研究 ,挖掘了指纹图谱中的有
效信息 ,指纹图谱的建立更具可靠性 ,所建指纹图谱
能体现岩黄连注射液的主要成分 , 可用于质量控
制[ 6, 7] 。本文所建立的研究方法对其他中药指纹图
谱研究也具有参考价值 。
材料与方法
仪器和试剂 　 Agilen t 1100 HPLC-ES I-MSD-
Trap;二次蒸馏水(自制 );乙腈(美国 Fishe r公司 ,色
谱纯 );岩黄连注射液由广西河丰药业有限责任公
司提供 ,取岩黄连注射液 2 mL置样品管中 , 0.45
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μm滤膜过滤后备用;盐酸小檗碱 (标号 110713-
200208,供含量测定用 )和盐酸巴马汀 (标号 0732-
200005,供含量测定用 )对照品由中国药品生物制
品检定所提供。
色谱条件　色谱柱选用 K rom asil 100-10C18柱
(250mm ×4.6 mm ID , 5 μm);进样量 20 μL;梯度
洗脱流动相 A为 0.4%三乙胺水溶液 (冰醋酸调至
pH 8.5), B为乙腈;梯度洗脱:10% B ～ 20% B(0 ～
10 m in), 20% B ～ 30% B(10 ～ 50 m in), 30% B ～
100% B(50 ～ 70 m in), 100% B ～ 100% B(70 ～ 80
m in);流速为 0.5mL m in-1;柱温 30℃;检测波长
254 nm。
质谱条件　MS自动记录 2级总离子流 (TIC)
谱图。正离子扫描 ,质量扫描范围 m /z 110 ～ 1 500,
干燥气流速 7 L min- 1 ,干燥气温度 300 ℃,雾化气
压 140 kPa,目标分子 m /z 350,化合物稳定性 70%。
结果与讨论
1　岩黄连注射液指纹图谱的获取
岩黄连注射液主要成分为生物碱 ,其结构中碱
性氮原子与固定相未键合酸性硅醇基的相互作用常
导致色谱峰展宽拖尾 、峰对称性差等现象 ,为此 ,在
流动相中添加三乙胺竞争或部分阻断硅醇基的影
响 ,冰醋酸调节至 pH值为 8.5,通过改变流动相离
子强度 ,稳定 pH值及促进离子对相互作用而起到
改善色谱峰形 ,分离选择性和分离效能的作用 。
采用上述色谱条件和质谱条件 ,建立的岩黄连
注射液指纹图谱如图 1。图 1A为岩黄连注射液
HPLC-UV在波长为 254 nm处的指纹图谱 ,图 1B为
质谱总离子流图 。该指纹图谱通过质谱检测器和紫
外检测器同时对色谱分离的成分进行表征 ,丰富了
色谱分离后的检测方式。
2　岩黄连注射液的质谱分析
岩黄连注射液中的生物碱结构基本类似 [ 8] ,为
异喹啉类生物碱 ,其基本骨架是四氢异喹啉与苯二
亚甲基连接构成的四环系统 , 结构如图 2所示 。当
分子中的 C环存在双键并面对 B环时 , C环将产生
Retro-Die ls-A lder(RDA)裂解 ,得到 1个碎片离子与
中性分子 ,不同的母离子分别得到 2个互补的碎片
离子 a和 b,前者来自四氢异喹啉部分 ,后者来自苯
二亚甲基部分。而 C环发生 RDA裂解生成的碎片
离子由于结构的不同 ,其离子大小也不同 ,其中化合
物 6 , 7和 12得到碎片离子 a,而化合物 11和 13则
得到碎片离子 b, 因此可根据分子离子和碎片离子
F igure 1　Comparison be tw eenUV 254 nm chromat-
og ram (A) and M S TIC (B) of Coryda lis saxicola
Bun ting in jec tion. Peak 1-13 are list in Tab le 1
对以上成分进行鉴别 。当 C环芳香化以后 ,由于不
符合 RDA裂解开裂要求 ,因此不发生裂解 ,没有明
显的碎片离子峰 。对于 C环开环的化合物原阿片
碱而言 ,其开环的 C环也能发生类似的 RDA裂解 ,
生成碎片基峰 c。化合物 8分子中存在-OH使其易
失去 1分子水 ,形成 322的碎片离子基峰。以上信
息结合分子离子峰的差别 ,可初步确定其归属 ,其在
色谱图与质谱图上的归属见表 1。
Table 1　Results ofmass spectrog raphic analysis
No. tR /m in M +1 m /z C om pound
1 30. 1 336 - -
2 42. 0 350 - D ehyd rocavid ine
3 47. 7 352 - Palm atine hydroch loride
4 50. 5 336 - Berberine hyd roch lorid e
5 54. 2 366 - -
6 60. 3 328 178 Scou lerine
7 65. 1 342 178 Tetrahyd rocolumbam ine
8 67. 7 340 322 13β-Hydroxysty lop ine
9 68. 4 356 192 Tetrahyd ropalm atine
10 69. 4 354 149 Protop ine
11 70. 2 340 151 Th alictrifo line
12 70. 9 340 176 Tetrahyd roberberine
13 72. 8 354 165 Cav id ine
3　岩黄连注射液质量评价
标准曲线的测定　岩黄连注射液的定量测定以
847 刘思明等:岩黄连注射液的高效液相色谱质谱联用指纹图谱研究
F igure 2　S tructure o f alkalo ids in the Coryda lis sax icola Bunting injection
前采用的是其成分岩黄连碱的单一指标定量。在实
际应用中 ,所采用的对照品来自厂家精制提取 ,缺乏
统一性与可比性 。本实验中 ,选取了盐酸巴马汀和
盐酸小檗碱 2个指标成分 ,药理及临床实验证明 ,这
2种成分具有清热解毒 、抗感染 、防癌等功效 ,并对
心血管疾病及其他疾病有疗效 ,因此选取这 2种指
标符合药效学评价的要求 。岩黄连注射液指纹图谱
显示 ,这 2种成分的保留时间适中 ,与其他成分没有
干扰 ,分离效果良好。
称取一定量的对照品盐酸小檗碱和盐酸巴马
汀 ,配制对照品原液 200μg mL- 1 ,分别稀释 5, 10,
15 , 25, 50和 100倍 ,以上述色谱方法进样测定色谱
图 ,以峰面积 (Y)与浓度 (X )作盐酸小檗碱和盐酸
巴马汀的标准曲线 ,分别为 Y =6 071X - 9 083, r2 =
0.999 8,线性范围为 2 ～ 200mg L -1;Y =5 525X -
1 368, r2 =0.999 7,线性范围为 2 ～ 200 mg L- 1。
盐酸小檗碱和盐酸巴马汀的定量结果　对市售
10批岩黄连注射液样品进行高效液相色谱测定 ,对
其中的盐酸小檗碱和盐酸巴马汀进行定量分析 ,其
结果见表 2。
定量方法学考察　同一批样品 ,平行操作制备
5份供试品溶液 ,测定色谱图 ,以盐酸小檗碱和盐酸
巴马汀的色谱峰峰面积为指标计算 RSD ,考察方法
重复性。
Table 2　Results o f quantification of be rbe rine hyd ro-
chloride (Ber) and palma tine hydrochloride (Pa l)
Batch no. Ber /m g L- 1 Pal /m g L- 1
1 9. 462 12. 96
2 9. 608 14. 03
3 9. 352 12. 45
4 9. 517 13. 16
5 9. 301 12. 61
6 9. 324 12. 98
7 9. 597 13. 49
8 9. 593 13. 51
9 9. 513 13. 42
10 9. 410 13. 04
Average 9. 468 13. 16
RSD /%(n=10) 1. 5 3. 8
取供试品溶液 ,分别在 0, 6, 12 , 18和 24 h测定
色谱图 ,以盐酸小檗碱和盐酸巴马汀色谱峰峰面积
为指标计算 RSD ,考察注射液在 24 h内的稳定性 。
在已知成分的样品溶液中 ,加入定量的对照品 ,
分别测定加入和未加入对照品的色谱图 ,根据其峰
面积的变化测定其回收率。
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结果见表 3,表明此方法重复性好 ,样品在 24 h
内稳定存在 ,加样回收率也说明 ,该方法适用于盐酸
小檗碱和盐酸巴马汀的定量。
Table 3　Resu lts o f precision and recove ry (n=5)
Com pound
Repetit ion
RSD /%
S tab ility
RSD /%
A verage
recovery /%
Be l 2. 2 3. 1 97.5
Pal 3. 0 2. 0 96.8
整体质量评价　采用上述色谱条件和方法 ,对
10批岩黄连注射液样品进行液相色谱测定 ,得到
HPLC /UV指纹图谱。运用药典委员会提供的中药
指纹图谱相似度软件 ,将实验数据导入后 ,按照保留
时间进行谱峰自动匹配 ,得出标准模板 ,将 10批样
品和标准模板进行相似度评价 。 10批样品的指纹
图谱见图 3,谱图 R为标准模板谱图 。相似度评价
结果见表 4,分别为 10批样品与标准模板相比的相
似度数据 , 数据结果表明 , 此 10批岩黄连注射液的
HPLC /UV指纹图谱相似度令人满意 。说明这 10批
岩黄连注射液整体质量可靠 ,生产工艺稳定。
Table 4　 Evaluation o f resemblances among 10
samples of Corydalis saxicola Bunting injection w ith
standard templa te
S amp le
N o.
E valu ation of
resem b lances
Sam p le
No.
Evaluation of
resem b lances
030215 0. 991 030426 0. 996
030303 0. 998 030507 0. 990
030325 0. 990 030518 0. 996
030401 0. 992 030526 0. 996
030412 0. 989 030601 0. 997
F igure 3　Compa rab ility of 10 samp les o f Corydalis
saxicola Bunting injection. S1-S10 are the HPLC-UV
fingerprin ts o f 10 butches o fCoryda lis saxicola Bun ting
in jec tion samp les
结论
HPLC /UV M/ S联用技术可使色谱方法和质谱
方法互相补充 ,实现定性定量的一体化 。本文在植
物化学研究的基础上 ,结合多级质谱技术 ,初步确定
了岩黄连注射液 LC M/ S指纹图谱中的 11种生物碱
成分 ,同时对其中 2种常见成分进行了定量研究 ,并
对整体相似度进行评价 。本文建立的指纹图谱在定
性定量方面既有具体指标的绝对量测定 ,又有整体
相似度的评价 ,能对主成分含量及整体质量进行质
量控制。
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