全 文 :第37卷 第4期 西 南 师 范 大 学 学 报 (自然科学版) 2012年4月
Vol.37 No.4 Journal of Southwest China Normal University(Natural Science Edition) Apr.2012
文章编号:1000-5471(2012)04-0108-05
巴东醉鱼草杀虫活性成分的初步分离及活性追踪
①
张秀云, 李治伟, 陆德玲, 冯俊涛, 张 兴
西北农林科技大学 无公害农药研究服务中心 陕西省生物农药工程技术研究中心,陕西 杨凌712100
摘要:采用杀虫活性追踪和化学分离相结合的方法对巴东醉鱼草95%乙醇提取物的石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取
物进行活性成分分离,在5mg/mL的体积质量分数下,石油醚萃取物经一级柱层析所得馏分AG的活性最高,对
3龄粘虫24h,48h和72h拒食率分别达58.44%,79.77%和71.52%,对5龄菜青虫24h和48h拒食率分别达
89.03%和72.73%;乙酸乙酯萃取物经一级柱层析所得馏分BB对3龄粘虫24h,48h和72h拒食率分别达
97.34%,100%和100%,对3龄小菜蛾24h和48h拒食率最高分别达97.33%和99.46%.实验结果表明,经过
一级柱层析后,石油醚萃取物杀虫活性物质主要分布在AG段,乙酸乙酯萃取物杀虫活性物质主要分布在BA,BB
和BC段.
关 键 词:巴东醉鱼草;拒食活性;粘虫;小菜蛾;菜青虫
中图分类号:Q949.776.3 文献标志码:A
醉鱼草属BudddlejaLinn.是马钱科中最大的一个属,全世界约有100余种,分布于美洲和亚洲的热
带和温带地区,该属一些种类可供药用和观赏[1].巴东醉鱼草B.albiflora Hemsl.,又叫酒药花 ,为马钱
科Loganiaceae醉鱼草属BuddlejaL.,该植物的花蕾部分能止咳化痰,具有治眼痛的功效.西北农林科技
大学无公害农药研究服务中心经过初筛,发现巴东醉鱼草95%乙醇提取物对粘虫具有良好的拒食及毒杀作
用[2].随后的研究发现,巴东醉鱼草95%乙醇提取物的不同溶剂萃取物对3龄小菜蛾幼虫、5龄菜青虫幼
虫均有明显的拒食和生长发育抑制作用[3].为了进一步探明巴东醉鱼草提取物中的杀虫活性物质,本研究
采用活性跟踪法对巴东醉鱼草95%乙醇提取物的石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物进行了阶段性分离,进一
步明确了杀虫活性成分所在部位,为后续的分离工作提供了有效依据.
1 材料与方法
1.1 材 料
供试材料:巴东醉鱼草95%乙醇提取物的石油醚和乙酸乙酯萃取物分别经一级柱层析所得各馏分,再
分别取适量样品用丙酮溶解定容至5mg/mL(置于4℃冰箱中)备用.
供试昆虫:粘虫Mythimna separatea W.3龄幼虫、小菜蛾Plutella xylostella L.3龄幼虫均为“西北
农林科技大学无公害农药研究服务中心”养虫室提供.菜青虫Pieris rapae L.自近期内未施过药的甘蓝地
采回菜青虫幼虫,经室内饲养2~3d后,挑选生理发育状态一致且健壮的5龄前期幼虫供试.
1.2 石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物的柱层析分离
用95%乙醇对粉碎后的巴东醉鱼草样品进行渗漉提取,提取液浓缩回收得到乙醇浸膏,然后将浸膏用
① 收稿日期:2011-01-28
基金项目:国家自然科学基金资助项目(青年基金31101486);农业部行业(农业)专项“生物源农药创制与技术集成及产业化开发”基金
资助项目(K312021014);陕西省农业攻关基金资助项目“巴东醉鱼草杀虫剂的研制及产品开发”(2010K02-09-1).
作者简介:张秀云(1974-),女,安徽青阳人,博士,讲师,主要从事天然产物农药研究.
通信作者:冯俊涛,教授.
水捏溶分散,依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇不同极性的溶剂萃取,得到相应的萃取物.
石油醚萃取物(A)的分离:石油醚萃取物(621g)以石油醚∶丙酮(1∶0,10∶1,8∶1,5∶1,3∶1,各
5 000mL)为洗脱剂进行硅胶柱层析(Φ12cm,L140cm,2.5kg,200~300目),通过TLC分析合并为9
个馏分,分别记为A1,A2,A3,A4,A5,A6,A7,A8和A9,并分别取适量样品用丙酮溶解定容至5mg/mL
(置于4℃冰箱中)备用.
乙酸乙酯萃取物(B)的分离:乙酸乙酯萃取物(870g)以氯仿∶甲醇(1∶0,50∶1,20∶1,15∶1,10∶1,
各5 000mL)为洗脱剂分2次进行硅胶柱层析(Φ12cm,L140cm,2.5kg,200~300目),通过TLC分析
合并为9个馏分,分别记为B1,B2,B3,B4,B5,B6,B7,B8和B9,并分别取适量样品用丙酮溶解定容至
5mg/mL(置于4℃冰箱中)备用.
1.3 生物活性测定
对粘虫和菜青虫的生物活性测定采用小叶碟添加法[4],在直径9.0cm的培养皿底部铺一层滤纸,并加
水保湿.每培养皿内放10头试虫,试虫饥饿约4h.每处理设3个重复.将待测样品用丙酮(分析纯)稀释
成一定体积质量分数的溶液,从近期内未施过药的玉米田采回新鲜玉米叶片(菜青虫用甘篮叶片代替玉米
叶片),用打孔器打成直径1cm的叶碟,在配好的药液内浸2~3s,自然晾干(另设丙酮对照).于皿内加叶
碟1片,恒温(T=25℃±1℃;RH=70%~80%)下饲养,待试虫取食完再加,夜晚视试虫取食情况可以
多加几片,记录试虫取食的叶碟数量,并于24h,48h和72h用坐标纸统计取食总量,计算拒食率,同时采
用 Microsoft office excel统计函数求出拒食毒力曲线及拒食中浓度(AFC50).72h后开始用正常叶片饲养,
直至化蛹、羽化,并检查试虫最终死亡情况(死亡标准以不能取食,触之不动为准),计算死亡率和校正死
亡率.
拒食率(%)=
对照组取食面积-处理组取食面积
对照组取食面积 ×100
(1)
死亡率(%)=
死亡数
供试总虫数×100
(2)
校正死亡率(%)=
处理组死亡率(%)-对照组死亡率(%)
1-对照组死亡率(%) ×
100 (3)
对小菜蛾生物活性测定采用叶碟法[5],即用直径5cm的养虫盒,将近期内未施过药的新鲜甘蓝叶片用
打孔器打制成直径为0.5cm的叶碟,在配好的药液内浸2~3s,自然晾干(另设丙酮对照).于皿内加叶碟
3片,恒温(T=25℃±1℃;RH=70~80%)下饲养,并于24h和48h检查试虫取食叶片量和中毒死亡情
况(死亡标准以试虫不能取食,触之不动为准),调查结果采用叶片分级法,根据取食面积统计拒食率,并
统计试虫死亡情况,依据式(2)计算死亡率.
叶片分级标准如下:
0级:叶片上无取食的痕迹;Ⅰ级:叶片上有零星取食痕迹;Ⅱ级:叶片上有明显取食缺刻;Ⅲ级:叶
片被取食面积约占1/3;Ⅳ 级:叶片被取食面积约占1/2;Ⅴ级:仅留下少量残渣.
取食指数(%)= ∑(为害级别数×各级叶片数)总叶片数×最高为害级别数×参试总虫数×100 (4)
拒食率(%)=
对照取食指数(%)-处理取食指数(%)
对照取食指数(%) ×100
(5)
2 结果与分析
2.1 巴东醉鱼草石油醚萃取物一级柱层析各馏分的生物活性
巴东醉鱼草石油醚萃取物经一级柱层析后,所得9个馏分对3龄粘虫幼虫的生物活性见表1.从表1
可知,A7馏分对3龄粘虫幼虫的拒食活性明显比其他馏分强,其24h,48h和72h的拒食率分别为
58.44%,79.77%和64.69%;A5和A9在24h对试虫不表现出拒食活性,随着处理时间的延长,显示出
一定的活性,但其72h的拒食率均不超过40%;其余各馏分在不同时间内对3龄粘虫幼虫均有一定程度的
901第4期 张秀云,等:巴东醉鱼草杀虫活性成分的初步分离及活性追踪
活性,但都不如A7的活性强.说明石油醚萃取物中对3龄粘虫幼虫的活性成分主要集中在A7段.
石油醚萃取物各馏分72h的校正死亡率差异较大,其中A2和A7两个馏分对3龄粘虫的校正死亡率
分别达48.25%和37.74%;其余各馏分对3龄粘虫72h的校正死亡率均不超过25%.说明A2和A7馏分
是石油醚萃取物中对3龄粘虫毒杀活性较强的部分.
表1 石油醚萃取物一级柱层析各馏分对3龄粘虫幼虫的生物活性
供试
样品
拒食率/%
24h 48h 72h
校正死亡率/%
24h 48h 72h
A1 23.26abc 65.63b 57.16b 0.00c 1.15d 13.35cd
A2 38.22abc 37.46de 64.37ab 10.00a 39.86a 48.25a
A3 13.14c 15.34f 64.37ab 4.53ab 16.36bc 13.35cd
A4 52.38ab 49.75c 28.50c 1.15bc 13.01bc 23.95bc
A5 0.00d 7.69g 39.20c 10.00a 13.01bc 20.49cd
A6 48.49ab 50.00c 71.52a 0.00c 23.18ab 23.54bc
A7 58.44a 79.77a 64.69ab 10.00a 23.18ab 37.74ab
A8 26.80abc 31.22e 35.68c 10.00a 16.36bc 17.24cd
A9 0.00d 43.74cd 35.69c 0.00c 6.70cd 9.89d
注:同列数据后不同小写字母表示差异具有统计学意义(p<0.05).下同.
巴东醉鱼草石油醚萃取物经一级柱层析后,所得各馏分对5龄菜青虫幼虫的生物活性见表2.48h的
拒食率以A1,A7和 A8较强,分别为79.85%,59.09%和72.73%,24h的拒食率则以 A7最佳,达到
89.03%.说明石油醚萃取物对5龄菜青虫幼虫拒食活性较强的馏分主要集中在A1,A7和A8部分.从表2
还看出,石油醚各馏分对5龄菜青虫幼虫没有明显的致死和致畸作用.
表2 石油醚萃取物一级柱层析各馏分对5龄菜青虫幼虫的生物活性
供试样品
拒食率/%
24h 48h
校正死亡率/%
24h 48h
畸形蛹数
/头
A1 38.10f 79.85a 0.00a 0.00c 0.00
A2 0.00i 0.00f 0.00a 0.00c 0.00
A3 48.65e 25.85d 0.00a 0.00c 2.00
A4 24.26g 45.44bc 0.00a 6.67b 0.00
A5 6.24h 11.83e 0.00a 10.00a 0.00
A6 73.82b 48.48bc 0.00a 0.00c 4.00
A7 89.03a 59.09b 0.00a 0.00c 0.00
A8 68.46c 72.73a 0.00a 0.00c 0.00
A9 28.63g 43.06c 0.00a 0.00c 0.00
A 58.54d 45.44bc 0.00a 6.67b 0.00
2.2 巴东醉鱼草乙酸乙酯萃取物一级柱层析各馏分的生物活性
乙酸乙酯萃取物经一级柱层析后,所得各馏分对3龄粘虫和3龄小菜蛾幼虫的拒食活性和胃毒活性有
明显差异,其中对小菜蛾拒食活性较高的馏分有B1和B2,对粘虫有较强拒食活性的成分集中在B1,B2和
B3三个部分,其中对粘虫72h的拒食作用强烈,拒食率均达到100%;校正死亡率呈现出与拒食率大致相
同的趋势,对粘虫的毒杀作用尤为显著,此三个馏分在48h和72h对粘虫的校正死亡率均为100%,显示
了强烈的毒杀活性.以上实验数据说明,乙酸乙酯萃取物中的活性成分主要集中在B1,B2和B3三个部分.
011 西南师范大学学报(自然科学版) http://xbbjb.swu.cn 第37卷
表3 乙酸乙酯萃取物的一级柱层析各馏分对3龄粘虫和3龄小菜蛾幼虫的生物活性
供试
样品
拒食率/%
小菜蛾
24h 48h
粘虫
24h 48h 72h
校正死亡率/%
小菜蛾
24h 48h
粘虫
24h 48h 72h
B1 93.75a 99.46ab 94.68a 99.07ab 100.00a 60.64ab 100.00a 95.47ab 100.00a 100.00a
B2 97.33a 99.46a 86.13ab100.00a 100.00a 6.70a 98.85a 100.00a 100.00a 100.00a
B3 72.44b 83.86abc 94.68a 95.83abc 100.00a 4.53b 22.46a 77.85b 100.00a 100.00a
B4 50.00c 54.29abc 94.68a 95.83abc 99.38a 6.70c 1.15b 2.37c 56.67b100.00a
B5 24.23d 57.21abc 97.34a 97.92abc 99.38a 0.00c 1.15cd 6.70c 20.00cd 81.65b
B6 54.21c 8.75d 97.34a 67.08c 99.38a 0.00c 8.76bc 0.00c 46.50bc 86.99ab
B7 50.00c 62.59abc 92.93a 76.43abc 78.33b 0.00c 6.70d 4.53c 10.00d 25.00c
B8 20.47d 48.56c 97.34a 66.67c 76.67b 0.00c 0.00cd 4.53c 16.67cd 22.46c
B9 56.39c 54.37cd 69.55b 61.23cd 53.33cd 0.00c 0.00d 2.37c 10.00d 11.61c
3 结 论
巴东醉鱼草提取物的杀虫活性成分主要集中在A7和BB馏分中.前期的研究结果表明,巴东醉鱼草乙
醇提取物经不同溶剂萃取后,所得各萃取段对试虫的生物活性有差异,其中石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取
物的活性明显高于正丁醇萃取物和水相[3].在此基础上,本研究着重对石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物进
行了进一步分离,以明确杀虫活性成分所在部位,试验结果表明,经过一级柱层析,该两相萃取物中杀虫
活性成分的分布有差异,其中石油醚萃取物的杀虫活性成分主要集中在 A7段,在整个石油醚萃取物中,
极性处于中等偏大;而乙酸乙酯萃取物的杀虫活性成分主要集中在B1、B2和B3,在整个乙酸乙酯萃取物
中,极性较小.这说明巴东醉鱼草中杀虫活性成分为中等极性.要明确其结构,还需要进一步采用活性跟
踪法进行分离和结构鉴定.乙酸乙酯萃取物一级柱层析的B1,B2和B3三个馏分对粘虫72h的拒食率及校
正死亡率均达到100%,显示出强烈的活性,为了更加明确地探明其中的杀虫活性成分,进一步的分离工
作正在进行中.
巴东醉鱼草提取物中含有多种类型的次生代谢产物,建立合理的活性物质分离方法,是发现高活性杀
虫先导化合物的有效手段.从植物提取物中探寻新的有效成分作为合成新型化学农药的模板,一直是植物
源农药研究的重点之一.巴东醉鱼草属于马钱科醉鱼草属,该属植物富含多种类型的次生代谢产物,如环
烯醚萜苷类[6]、黄酮[7]、酚酸及其苷类[8]等,这些成分显示出了多方面的生物活性,如大叶醉鱼草
B.davidii F.对蝗虫有胃毒和触杀活性[9];张海平[10]、陶靓[11]研究了巴东醉鱼草的化学成分,其中含有黄
酮、苷类、甾体皂苷和苯丙素等成分,但均未开展活性研究工作.本研究以杀虫活性为基础,进行活性成分
的追踪分离,目标明确,分离流程更加合理,有望从中发现具有良好杀虫活性的化合物.周刚[12]等指出,
植物提取物中对供试昆虫有活性的化合物可能不止一种,只是分布在不同的极性范围内,而这种分布将有
利于植物提取物中其他组分的分离和进一步的开发利用.目前,有关巴东醉鱼草杀虫活性成分的分离和鉴
定工作正在进行中.
另外,据文献报道,植物中含有大量的精油[13],有些精油具有明显的生物活性[14~15],有关巴东醉鱼草
精油的农用生物活性也值得研究.
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Tracing Insecticidal Ingredients
fromBuddleja albiflora Hemsl.
ZHANG Xiu-yun, LI Zhi-wei, LU De-ling,
FENG Jun-tao, ZHANG Xing
Research and Development Center of Biorational Pesticide,Northwest A&F University,
Shaanxi Research Center of Biopesticide Engineering and Technology,Yangling Shaanxi,712100,China
Abstract:The petroleum extracts and ethyl acetate extracts of 95%ethanol extract of Buddleja albiflora H.
were isolated by means of phytochemistry combined with insecticidal bioassay.Fraction AG from petrole-
um extracts,with concentration of 5mg/mL,showed the antifeedant rate against 3rd instar of Mythimna
separata W.of 58.44%,79.77%and 71.52%during 24,48and 72h,respectively,which were 89.03%
and 72.73%against 5rd instar of Pieris rapae L.during 24and 48h.Fraction BB from ethyl acetate ex-
tracts showed the antifeedant rate against 3rd instar of Mythimna separata W.of 97.34%,100%and
100%during 24,48and 72h,respectively,which were 97.33%and 99.46%against 3rd instar of Plutella
xylostella L.during 24and 48h.The results showed that the insecticidal ingredients of petroleum ex-
tracts were distributed in AG part,while that of ethyl acetate extracts were in BA,BB and BC parts.
Key words:Buddleja albiflora Hemsl;antifeedant activity;Mythimna separata W.;Pieris rapae L.;
Mythimna separata W.
责任编辑 夏 娟
211 西南师范大学学报(自然科学版) http://xbbjb.swu.cn 第37卷