全 文 ：　[收稿日期] 　2011-02-21;2011-04-26修回
　[作者简介] 　曲芬霞(1977-)女 ,讲师 ,硕士 ,从事种苗培育栽培 、生物技术研究。 E-mai l:qufenxia@126.com
[ 文章编号] 1001-3601(2011)06-0348-0026-03
贺州香芋组织培养离体再生体系的建立
曲芬霞
(广西贺州学院 生化系 , 广西 贺州 542800)
　　[摘　要] 以贺州香芋幼嫩叶片为外植体 ,研究了消毒时间 、外源激素等因素对贺州香芋成活率 、愈伤组
织诱导 、增殖和分化 、生根形成的影响。结果表明 ,用 5%的次氯酸钙处理 6min的污染率和褐变率低 ,成活率为 81 %。对愈伤组织诱导的主导因子依次是 KT 、IBA 和 BA ,最佳诱导培养基为 MS +IBA 0.1mg/ L+
KT 1.0mg/L +BA 1 .0mg/ L ,平均诱导率为 99%;最佳分化和增殖培养基为 MS +KT 3.0mg/L +IBA
0.5mg/L ,增殖系数为 3.0 ;在增殖培养基中添加 3 g/ L 酵母提取液 ,能显著增加苗木高生长和干物质量;最佳生根培养基是 1/2MS +NAA 0.5mg/ L ,生根率 100%,主侧根粗壮 ,须根浓密 ,成活率高 。[关键词] 贺州香芋;离体再生;愈伤组织;增殖和分化[中图分类号] S336;Q813.12 [文献标识码] A
Regeneration System Establishment of Tissue Culture of
Colacasia escuenla in Hezhou
QU Fen-x ia
(Department of Chemistry and Biology , Hezhou College , Hezhou , Guangxi 542800 , China)
　　Abstract:The effects o f disinfection time and ectoho rmone on the survival rate , induct ion ,
multiplicat ion and dif ferentiation o f callus and roo t fo rmation w ere studied by taking young leaf of
Colacasia escuenla in Hezhou as explants.The results showed that the pollution ra te and brow ning rate
decreased when treated w ith 5% calcium hypochlo ri te fo r 6 min , and the survival rate w as 81%.The
dominant factors fo r callus induction w ere in the order of KT , IBA and BA , the opt imum induction
medium was MS +IBA 0.1mg/L+KT 1.0mg/L +BA 1.0mg/ L and the average induction rate w as 99%;
the opt imum medium for mul tiplication and dif ferentiation w as MS +KT 3 .0mg/L + IBA 0 .5mg/L and
the mul tiplication coef ficient w as 3 .0 .Adding 3 g/L yeast ex t ract to the medium for mult iplication could
significant ly increase seedling height g row th and dry mat ter w eight.T he best root ing medium was 1/2
M S +NAA 0.5mg/ L , the root ing rate w as 100 %, the survival rate was high w ith thick and st rong lateral
roo ts and dense fibrous roo ts .
Key words:Colacasia escuenla in Hezhou;in vitro regeneration;callus;multiplication and differentiation
　　贺州香芋是当地农民栽培的芋类作物当家品
种 ,含淀粉 59 .5%,粗蛋白 5.8 %,并含有多种维生
素 ,营养丰富 ,香味浓郁 ,风味独特 ,加工前景广阔 ,
闻名并畅销广西 、广东及港 、澳地区[ 1-2] ,因此是当地
农民种植的主要经济作物之一 ,种植规模逐年扩大 。
贺州香芋通常采用母芋留种方式进行繁殖 ,种性退
化问题较为突出 ,且抗病性和抗逆性减退。目前国
内对其组培快繁技术方面研究尚无报道 ,因此 ,开展
贺州香芋组培再生体系技术研究 ,不仅有利于品种
的更新复壮 ,更为工厂化育苗提供一定的借鉴作用 。
1 材料与方法
1.1 试验材料
挑选具有充实 、健壮顶芽的优良母芋 ,用 0.2 %
的高锰酸钾浸泡 5min ,放在河沙中发芽 ,取其新生
叶片备用 。
1.2 方法
1.2.1 组织培养
1)外植体消毒 。取新生叶片 ,先用 75%酒精浸
30 s后 ,再用 5%的次氯酸钙消毒 ,设置消毒时间分别
为 2min 、4min 、6min 、8min ,比较消毒效果 ,消毒后用
无菌水冲洗 3次 ,切成适当大小 ,接种在诱导培养基
上。
2)愈伤组织的诱导 。诱导的激素种类和浓度
采用 L9(34)正交设计 ,其中 , IBA 浓度为0.1mg/L 、
0.4mg/L 、0 .8mg/ L , 6-BA 和 KT 的浓度均为
0.5mg/ L 、1.0mg/ L 、1 .5mg/L。
3)分化增殖培养 。将愈伤组织分别移接到附
加 K T 为 1 .0mg/L 、2.0mg/L 、3.0mg/L 和 IBA为
0.5mg/ L 、1.0mg/ L 的分化培养基上诱导丛生芽 。
4)添加有机附加物对丛生芽生长的影响。把
分化的丛生芽转入分别添加了南瓜汁 150 g/L 、椰乳
100mL/L 、西红柿汁 100mL/L 和酵母提取液 3g/L
的有机附加物培养基上 ,进行中间增殖培养。
5)生根培养 。把生长健壮的 3 cm 左右的无根
芽苗转接到 NAA 浓度分别为 0.3mg/ L 、0 .5mg/L
和 IBA 浓度分别为 0 .3mg/L 、0 .5mg/L 的 1/2M S
培养基上进行生根培养 。
　贵州农业科学　2011 , 39(6):26 ～ 28　Guizhou Ag ricultural Science s
1.2.2 培养条件 以 MS 为基本培养基 ,添加
30 g/ L 的蔗糖和 3.5g/L 的琼脂粉(国药集团化学
试剂有限公司),调节 pH 值为 5 .8 ,培养温度(23 ±
2)℃,光照时数为 12h/d ,光强 2000 lx 。每处理均
20瓶 ,重复 3次 ,培养周期为 30 d。
1.2.3 数据分析 用 SPSS 分析软件[ 4] 对试验数
据进行统计分析 。
2 结果与分析
2.1 消毒时间对贺州香芋污染率的影响
在植物组培中 ,适宜的消毒时间能降低外植体
的褐变 、玻璃化及污染率 。从表 1看出 ,用 5%的次
氯酸钙处理贺州香芋叶片 ,随着消毒时间的增加 ,污
染率逐渐降低 ,各个处理之间均达到显著差异 。褐
化率随着消毒时间的增加而上升 ,当处理 8min 时
褐化率达 34%。成活率随着消毒时间的增加呈先
上升后下降的趋势。综合比较 ,最适宜的消毒时间
为 6min ,此时污染率为 14.7%,褐化率为 4%,成活
率为 81 .3%。
2.2 激素种类和浓度对贺州香芋叶片愈伤组织诱
导的影响
香芋叶片在接种 10d 后开始卷曲 ,接着在边缘
加厚并出现瘤状突起 ,继续膨大形成浅绿色愈伤组
织 。从表 2看出 ,在 3个因素中 , KT 对贺州香芋叶
片诱导作用最大 ,其次是 IBA ,最小的是 6-BA 。方
差分析结果表明 , K T 对愈伤组织的诱导有极显著
作用(FKT =16.7＊＊), IBA 有显著作用(F IBA =
9.7＊),6-BA没有达到显著水平 ,这与极差分析一
致 。根据试验结果 ,各个因素的不同水平中 ,理论的
最优处理组合为 A 2B2C2 ,但综合比较 ,以 A 1B2C2为
试验最佳处理组合 ,其平均诱导率为 99 %, A 1 B3 C3
为较优处理组合 ,诱导率为 93 %。
2.3 KT和 IBA的浓度配比对分化增殖的影响
在植物离体再生体系的建立中 ,愈伤组织诱导
是常用的方法 ,可是脱分化后如何诱导再分化 ,这与
植物的基因型密切相关 。从表3看出 , 高浓度的
K T 利于分化增殖 ,而低浓度的 IBA作用效果显著 ,
当用 3.0mg/L K T 配合 0.5mg/L 的 IBA时 ,增殖
表 1 不同消毒时间贺州香芋的污染率 、褐变率及成活率
Table 1　The po llution ra te , brow ning r ate and surviv al rate of Colacasia escuenla in Hezhou in different disinfection time
消毒时间/ min
Disinfection time
污染率/ % Pollution rate
Ⅰ Ⅱ Ⅲ 平均/ %
褐化率/ % Brow ning rate
Ⅰ Ⅱ Ⅲ 平均/ %
成活率/ %
Surviv al rate
2 67 67 70 68.0 d 0 0 0 0.0 a 32.0 a
4 45 48 49 47.3 c 2 3 5 3.3 a 49.4 b
6 12 15 17 14.7 b 4 3 5 4.0 a 81.3 c
8 4 5 6 5.0 a 29 34 39 34.0 b 61.0 d
　注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
　No te:Different lower ca se le tters in the same column indicate the significant lev el a t 5%.The same be low .
表 2 贺州香芋叶片愈伤组织诱导的正交试验结果
Table 2　The o rthogonal test results o f callus induction o f Colacasia escuenla leaf in H ezhou
处理
T reatment
IBA(A)/
(mg/ L)
KT(B)/
(mg/ L)
6-BA(C)/
(mg/ L)
诱导率/ % Induction rate
Ⅰ Ⅱ Ⅲ
平均/ %
Ave rage
1 A1(0.1) B1(0.5) C1(0.5) 28.0 29.0 31.0 29.3
2 A1(0.1) B2(1.0) C2(1.0) 100.0 98.0 99.0 99.0
3 A1(0.1) B3(1.5) C3(1.5) 92.0 93.0 94.0 93.0
4 A2(0.4) B1(0.5) C2(1.0) 83.0 82.0 80.0 81.7
5 A2(0.4) B2(1.0) C3(1.5) 76.0 74.0 78.0 76.0
6 A2(0.4) B3(1.5) C1(0.5) 83.0 85.0 82.0 83.3
7 A3(0.8) B1(0.5) C3(1.5) 0.0 0.0 0.0 0.0
8 A3(0.8) B2(1.0) C1(0.5) 86.0 87.0 84.0 85.7
9 A3(0.8) B3(1.5) C2(1.0) 46.0 43.0 42.0 43.7
K1 73.78 37.00 66.11
K2 80.33 86.89 74.78
K3 43.11 73.33 56.33
R 37.22 49.89 18.44
表 3 KT和 IBA对贺州香芋增殖的影响
Table 3　Effect o f KT and IBA on multiplica tion of Colacasia escuenla in Hezhou
处理
T reatment
K T/
(mg/ L)
IBA/
(mg/ L)
增殖系数 M ultiplica tion coefficient
Ⅰ Ⅱ Ⅲ
平均
Average
备注
Remark
1 1.0 0.5 0 0 0 0 a　 仅有愈伤组织增大 ,
2 1.0 1.0 0 0 0 0 a　 愈伤组织无分化
3 2.0 0.5 2.3 2.5 2.6 2.5 d 分化速度快 , 生长缓慢
4 2.0 1.0 1.3 1.7 1.9 1.6 b 分化速度慢
5 3.0 0.5 3.1 3.2 2.8 3.0 e 分化快 , 芽苗生长较快
6 3.0 1.0 1.9 2.3 1.8 2.0 c 分化慢 , 生长速度慢
·27·　第 6 期 曲芬霞　贺州香芋组织培养离体再生体系的建立
表 4 不同有机附加物与芽苗的生长
Table 4　Different or ganic appendages and seedling g row th
处理
T reatment
用量标准
Dosage standa rd
茎高/ cm
Stem height
干物质量/ g
D ry ma tte r weight
备注
Remark
南瓜汁/(g/ L) 150 3.5 b 0.14 b 芽苗较纤弱淡绿椰乳/(ml/ L) 100 4.9 cd 0.23 cd 苗粗壮 ,浓绿
西红柿汁/(ml/ L)) 100 4.4 c 0.17 bc 苗纤细 ,浓绿
酵母提取液/(g/ L) 3 5.1 d 0.30 d 芽苗粗 ,浓绿对照 0 2.8 a 0.09 a 苗纤弱 ,黄绿
表 5 NAA和 IBA不同浓度贺州香芋的生根率
Table 5　Rooting rate o f Colacasia escuenla in Hezhou unde r different NAA and IBA concentra tion
生长素种类
Grow th hormone
浓度/(m L/ L)
Concentration
生根率/ % Rooting rate
Ⅰ Ⅱ Ⅲ
平均/ %
Average
备注
Remark
NAA 0.3 87 84 85 85.3 根系稀疏 , 细短
0.5 100 100 100 100.0 主侧根发达 , 须根浓密
IBA 0.3 86 85 88 86.3 主侧根发达 , 须根浓密
0.5 78 76 78 77.3 根系生长较好
系数最高 ,为 3.0 ,与其他处理均达到显著差异 ,在
转接 10d 后 ,在愈伤组织上出现绿色芽点 ,接着伸
长生长 ,形成丛生芽 。
2.4 有机附加物对贺州香芋丛生芽生长的影响
在试验中 ,贺州香芋增殖速度相对较慢 ,系数
低 ,且芽苗生长缓慢 ,因此在中间培养基中添加了南
瓜汁 、椰乳等物质 ,比较苗高和干物质生长情况 ,结
果(表 4)表明 ,所有处理与比照相比 ,均达到显著差
异 ,其中以酵母提取液效果最佳 ,苗高为 5.1 cm ,干重
为0.30 g;其次是椰乳 ,苗高4.9 cm ,干重为 0.23g 。
2.5 不同生长素对贺州香芋组培苗生根率的影响
用NAA 和 IBA 的不同浓度比较贺州香芋组培
苗的生根率 ,结果表明 ,以 0.5mg/L 的 NAA 处理
效果最佳 ,此时生根率高 ,达到 100%,且根系发达 ,
易于移栽成活 ,且后期生长旺盛 。待生根 15 d后 ,
把苗木转移至驯化室 , 1 ～ 2 d 后再打开瓶盖炼苗 ,
2 ～ 3 d后洗净苗木上残留的培养基 ,然后移栽到温
室中 ,苗期管理与普通苗木相同。
3 结论
1)在植物组培中 ,外植体灭菌剂的选择和灭菌
时间与其生长环境 、生长状态 、敏感程度密切相关 。
在千层金试验中[ 5] , 5 %次氯酸钙消毒效果较为理
想 ,在贺州香芋试验中也取得同样的效果 ,处理外植
体 6min效果最佳 ,成活率达 81%,处理 8min时 ,
污染率比前者下降了 9.7%,可褐变率却从 4 %提高
到 34%,也许消毒时间延长会伤害植物组织 ,导致
酚类氧化物加速氧化过程 ,从而褐变增加。
2)在植物组织培养中 ,愈伤组织能否诱导成功
的关键是适宜的分裂素和生长素浓度配比[ 6] ,在器
官培养中 ,通常以叶片易诱导成功 ,如香叶[ 7] ,丽格
海棠[ 8] ,这可能与叶肉组织中有完整薄壁细胞有关 。
对大多数植物而言 ,通常分裂素单独使用 BA 再配
合其他生长素 ,就能达到很好的诱导效果 ,如红芽大
戟 、刺山柑[ 9-10] ,但在贺州香芋叶片诱导试验中 , KT
对试验结果影响作用最大 ,其次是 IBA ,影响最小的
是 BA ,最佳的诱导培养基为 MS +IBA 0.1mg/L +
KT 1.0mg/L +6-BA 1.0mg/L 。
3)在诱导及增殖试验中发现 ,贺州香芋对分裂
素 K T 和生长素 IBA 较为敏感 ,最佳分化增殖培养
基是 MS +K T 3.0mg/L +IBA 0 .5mg/ L ,增殖系
数为 3.0 。另外 ,在预试验中发现 ,用玉米素(ZT)
2.0mg/ L与 IBA 0.3mg/ L的诱导效果略优于此处
理 ,增殖系数达 3.3 ,但玉米素价格昂贵 ,育苗成本
上升。相对其他植物增殖分化而言 , 3 .0 的增殖系
数较低 ,且芽苗生长缓慢 ,因此把分化的芽苗转入添
加有机附加物培养基上 ,结果表明 ,以 3g/L 酵母提
取液作用最为显著 ,此时苗高为 5.1 cm ,干物质量
为3.0 g ,且无根苗粗壮 ,叶片浓绿 ,极易诱导生根和
移栽成活 ,当然 ,有机附加物由于重演性 、重复性降
低 ,通常很少使用 。
4)试验结果表明 ,最佳生根培养基为 1/2M S
+NAA 0.5mg/ L ,此时生根率可达 100%,主根发
达 ,侧须根浓密 ,根系吸收能力强 ,易于成活。
[ 参 考 文 献]
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[ 5] 曲芬霞.影响千层金腋芽萌发及愈伤组织诱导因子初
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[ 6] 李永文 ,刘新波.植物组织培养技术[ M] .北京:北京
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[ 7] 张存旭 ,宋 敏.香叶组培快繁技术的研究[ J] .西北
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(责任编辑:聂克艳)
·28· 　　　　　　　　　　　　 　　　　　贵 州 农 业 科 学 2011 , 39 卷