全 文 ：第 35卷 第 3期 东　北　林　业　大　学　学　报 Vol.35 No.3
2007年 3月 JOURNALOFNORTHEASTFORESTRYUNIVERSITY Mar.2007
虎舌红茎尖高频再生体系的建立 1)
杜敏华　李玉英　田　龙　柴春月
(南阳师范学院 ,南阳 , 473061)
　　摘　要　以虎舌红(ArdisiamamilataHance)幼嫩茎尖为外植体 ,采用正交设计及方差分析对影响虎舌红植株
离体培养的因素进行了优化研究。结果表明:最佳愈伤组织诱导培养基为 MS+2, 4-D0.7mg/L+6-BA0.2mg/L+蔗糖 28g/L+琼脂 6.0g/L;不定芽诱导最佳培养基为 MS+NAA0.2 mg/L+CPPU0.4mg/L+蔗糖 30g/L+琼
脂 6.0g/L,分化率为 96%,增殖率为 5.5;最佳生根培养基为 1/2MS+NAA0.4mg/L+IBA0.3mg/L+蔗糖 26g/L+
琼脂 5.0g/L, 生根率为 93%。
关键词　虎舌红;茎尖;正交设计;方差分析;离体再生
分类号　S685.99;Q943.1EstablishmentofHigh-frequencyRegenerationSystemforStemApexesofArdisiamamillataHance/DuMinhua, LiYuying, TianLong, ChaiChunyue(ColegeofLifeSciencesandTechnology, NanyangNormalCollege, Nanyang473061,P.R.China)//JournalofNortheastForestryUniversity.-2007, 35(3).-21 ～ 22, 30TheinfluencingfactorsofArdisiamamillataHanceinvitrocultivationwereoptimizedbyorthogonaldesignandvari-anceanalysisusingtenderstemapexesofA.mamilataasexplants.Resultsshowthattheoptimalmediumforcallusin-ductionisMSsupplementedwith0.7mg/L2, 4-D, 0.2mg6-BA, 28g/Lsucroseand6.0g/Lagar, thatforadventitiousbudinductionisMSwith0.2mg/LNAA, 0.4mg/LCPPU, 30g/Lsucroseand6.0g/Lagarwithadiferentiationrateof
96% andamultiplicationrateof5.5, andthatforrootingis1/2MSwith0.4mg/LNAA, 0.3mg/LIBA, 26g/Lsucroseand5.0g/Lagarwitharootingrateof93%.Keywords　ArdisiamamillataHance;Stemapexes;Orthogonaldesign;Varianceanalysis;Invitroregeneration
　　虎舌红(ArdisiamamilataHance)是紫金牛科(Myrsinace-
ae)、紫金牛属的多年生常绿矮小灌木 , 是一种以观赏和药用
价值为主 、具有多种经济用途的重要植物资源 [ 1] 。虎舌红的
常规繁殖有种子繁殖和扦插繁殖两种。种子繁殖的实生苗形
状不稳定 , 易变异 ,优良单株不易保存和扩繁;扦插繁殖往往
消耗较多母体材料 , 成活率低 , 繁殖系数低 , 速度慢 [ 2] 。 所以
常规繁殖无法满足当今虎舌红市场需要。
目前 , 有关虎舌红组织培养研究报道很少。江香梅等采
用虎舌红成年植株的茎段培养成完整的虎舌红植株 [ 3];卢其
能利用虎舌红的茎段 、芽 、花和叶进行组织培养 ,仅见有芽分
化的最佳培养基为 1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.01mg/L
的结论报道 , 并未提及其是否培养成完整的虎舌红植株 [ 4];
罗吉凤等利用虎舌红的带节茎段 、叶和叶柄也进行了成功的
尝试 [ 5];但尚未见以虎舌红茎尖为外植体的报道。本试验采
用正交试验法 , 以虎舌红茎尖为试验材料 , 对影响虎舌红愈伤
组织形成和出芽的培养基 、培养条件进行了较为系统的研究 ,
从中分析了影响虎舌红茎尖离体再生的主导因素 , 优化了培
养基配方和培养条件 ,达到了快速繁殖的目的。
1　材料与方法
1.1　取材及培养条件
材料来源:虎舌红由广西省植物研究所提供。
材料处理:取带 2 ～ 3个叶片的虎舌红幼嫩茎尖 , 以流水
冲洗 30min, 75%酒精灭菌 35s, 0.1% HgCl2消毒 5 ～ 8min,
取出后用无菌水冲洗 4 ～ 6次 ,得无菌材料。
愈伤组织的诱导:取虎舌红无菌茎尖 , 以 MS+蔗糖 28g/
1)河南省重大科技攻关项目(0524050006)。
第一作者简介:杜敏华 ,男 , 1964年 8月生 ,南阳师范学院生命科
学与技术学院 ,副教授。
收稿日期:2006年 6月 29日。
责任编辑:程　红。
L+琼脂 6.0g/L为基本培养基 ,附加不同质量浓度的激素 2,
4-D、NAA和 6-BA进行愈伤组织的诱导。暗处理 15d后 ,
每日光照。
不定芽诱导:取虎舌红无菌芽 , 以 MS+NAA+CPPU+
AgNO3 +蔗糖 30g/L+琼脂 6.0g/L为基本培养基。
生根培养:取虎舌红不定芽 , 以 1/2MS+IBA+NAA+蔗
糖 26g/L+琼脂 5.0g/L为基本培养基。
培养条件:置 MGC-350HPX型智能人工气侯箱中 ,光强
1 500 ～ 2 000lx, 每日光照 15h, 培养温度(26±2)℃。
1.2　正交试验设计
不定芽诱导及增殖培养:选择 NAA、CPPU和 AgNO3 3个
考查因素 , 每个因素取 3个水平 ,选用 L9(34)正交表 , 考查对
虎舌红不定芽诱导的影响 [ 6-7] ,因子水平安排见表 1。
表 1　虎舌红不定芽诱导影响因素L9(34)正交试验设计
水平 因　　　素A(NAA/mg·L-1)B(CPPU/mg·L-1)C(AgNO3 /mg· L-1)
1 0.1 0.4 3.5
2 0.2 0.6 4.0
3 0.3 0.8 4.5
　　生根培养:根据文献报道 [ 8-9]及预试验 , 选择 NAA、IBA
和活性炭因子 , 每个因子取 3个水平 , 选用 L9(34)正交表 , 考
查对虎舌红生根的影响 [ 10-11] ,因子水平安排见表 2。
表 2　虎舌红不定芽生根诱导影响因素L9(34)正交试验设计
水平 因　　　素A(NAA/mg·L-1) B(IBA/mg·L-1) C(活性炭 /mg·L-1)
1 0.2 0.1 1.0
2 0.4 0.3 3.0
3 0.6 0.5 5.0
2　结果与分析
2.1　不同激素对虎舌红茎尖愈伤组织诱导的影响
在虎舌红脱分化过程中 ,生长素 2, 4 -D、NAA起着十分
重要的作用 , 但它们对愈伤组织诱导 、生长和分化的影响却不
相同:在附加 2, 4-D的培养基中 , 愈伤组织数量多 , 生长快 ,
但愈伤组织不能分化出再生植株;而附加 NAA的培养基 , 愈
伤组织数量明显减少 , 仅为前者的 1/4 ～ 1/3倍 , 甚至更少 , 但
愈伤组织能够迅速分化出大量不定芽及再生植株。 这表明
2, 4-D在试验的质量浓度范围内促进虎舌红茎尖脱分化及
愈伤组织生长 , 抑制愈伤组织分化 , 而 NAA在试验的质量浓
度范围内则促进愈伤组织分化。
由于虎舌红茎尖对外援激素的反应不同 , 在实际应用时 ,
应根据需要选择不同的外源激素。若以诱导愈伤组织为目的 ,
生长素 2, 4-D适宜质量浓度为 0.7mg/L, 6-BA适宜质量浓
度为 0.2mg/L。若以获得再生植株为目的 ,则生长素 NAA适
宜质量浓度为 0.1mg/L, 6-BA适宜质量浓度为 0.8mg/L。
2.2　不定芽诱导及培养系统的建立
无菌芽接种 6d后 ,开始有新芽出现 ,随后大多数培养基中
的丛生芽不断增加 ,且生长健壮,接种 4周后统计分化率(表 3)。
表 3　虎舌红不定芽诱导试验结果 L9(34)
处理
因　　素
A(NAA/
mg· L-1)
B(CPPU/
mg· L-1)
C(AgNO3 /
mg· L-1) 空列
接种
数
分化
数
分化
率%
1 0.1 0.4 3.5 1 74 39 53.3
2 0.1 0.6 4.0 2 73 31 42.5
3 0.1 0.8 4.5 3 87 32 36.5
4 0.2 0.4 4.0 3 75 72 96.0
5 0.2 0.6 4.5 1 73 64 87.0
6 0.2 0.8 3.5 2 80 55 69.1
7 0.3 0.4 4.5 2 81 72 88.9
8 0.3 0.6 3.5 3 78 45 58.3
9 0.3 0.8 4.0 1 89 36 40.2
K1 132.3 238.2 180.7 180.5
K2 252.1 187.8 178.7 200.5
K3 187.4 145.8 212.4 190.8
k1 44.1 79.4 60.2 60.2
k2 88.0 62.6 59.6 66.8
k3 62.5 48.6 70.8 63.6
极差(R) 39.9 30.8 11.2 6.5
　　注:Ki代表水平 i的总值;ki代表水平 i的平均值。
直观分析表明 , 3种因子对丛生芽诱导产生效应的大小
依次是 NAA>CPPU>AgNO3 , NAA、CPPU、AgNO3 的极差均
比空列的大 , 说明各因素间的变异是可靠的。
NAA的质量浓度为 0.2 mg/L时的平均相对分化率为
29.33,分别是质量浓度为 0.1mg/L和 0.3mg/L时的 1.99和
1.41倍 , 3种水平的平均相对分化率的极差为 14.63,表现出
明显的差异。 CPPU质量浓度为 0.4mg/L时和 AgNO3质量
浓度为 4.5mg/L时的水平相对分化率最高 ,分别为 26.47和
23.60, 其 3种水平的平均相对分化率的极差分别为 10.27和
3.73(表 4)。
方差分析结果(表 5)表明 , NAA和 CPPU各水平对虎舌
红不定芽增殖诱导的影响均达到显著水平(P<0.05),而 Ag-
NO
3
各水平对虎舌红不定芽增殖诱导的影响则无显著差异。
说明不同浓度的 NAA和 CPPU水平对虎舌红不定芽增殖诱
导的影响很大 , AgNO3则次之 , 这与直观分析的结果相一致。
由于 AgNO3对虎舌红不定芽增殖诱导的影响较小 , 可以不考
虑。以上分析结合表 3可知 , 各因子的最佳组合为 A2B1, 即
0.2mg/LNAA和 0.4mg/LCPPU,分化率为 96%。对原接种
芽数和新形成的丛生芽数进行统计分析 ,得此处理单芽均增
殖率(新形成的丛生芽数 /原接种芽数)为 5.5。
表 4　虎舌红各因子不定芽的平均相对分化率比较
水平代码 NAA/mg· L-1 CPPU/mg·L-1 AgNO3 /mg· L-1 空列
1 14.70 26.47 20.07 20.07
2 29.33 20.87 19.87 22.27
3 20.83 16.20 23.60 21.20
极差(R) 14.63 10.27 3.73 2.20
表 5　虎舌红不定芽诱导试验结果的方差分析
变异来源 自由度 平方和 均方 F F0.05
NAA 2 2 397.12 1 198.60 35.94＊ 19.00
CPPU 2 1 426.90 713.45 21.39＊ 19.00
AgNO3 2 238.31 119.15 3.57 19.00
试验误差 2 66.72 33.35
总计 8 4 129.05
　　注:＊为 0.05水平显著。
2.3　不定芽诱导生根试验
接种不定芽 6d后, 开始有根出现 , 随后, 大多数培养基中
的不定芽开始生根 ,在接种 4周后统计丛生芽生根率(表 6)。
表 6　虎舌红不定芽生根诱导试验结果 L9(34)
处理
因　　素
A(NAA/
mg· L-1)
B(CPPU/
mg· L-1)
C(AgNO3/
mg· L-1) 空列
接种
数
分化
数
分化
率%
1 0.2 0.1 1.0 1 78 58 70.2
2 0.2 0.3 3.0 2 83 65 78.1
3 0.2 0.5 5.0 3 76 28 36.5
4 0.4 0.1 3.0 3 81 64 79.6
5 0.4 0.3 5.0 1 83 77 93.0
6 0.4 0.5 1.0 2 81 62 76.2
7 0.6 0.1 5.0 2 90 43 47.4
8 0.6 0.3 1.0 3 78 52 66.3
9 0.6 0.5 3.0 1 89 21 23.8
K1 184.80 197.20 212.71 187.00
K2 248.80 237.40 181.50 201.70
K
3 137.50 136.50 176.91 182.40
k1 61.60 65.73 70.90 62.33
k2 82.93 79.13 60.50 67.23k3 45.83 45.50 58.97 60.80
极差(R) 37.10 33.63 11.93 6.43
　　注:Ki代表水平 i的总值;ki代表水平 i的平均值。
NAA、IBA和活性炭 3个水平 9个浓度组合的正交试验
的直观结果表明 , 3种因子对丛生芽诱导产生效应的大小依
次是 NAA>IBA>活性炭。 NAA、IBA、活性炭的极差均比空
列的大 , 说明各因素间的变异是可靠的。
方差分析结果(表 7)表明 , NAA和 IBA各水平对虎舌红
不定芽诱导生根的影响达到显著水平(P<0.05), 而活性炭
各水平对虎舌红不定芽诱导生根的影响则无显著差异。说明
不同浓度的 NAA和 IBA水平对虎舌红丛生芽诱根的影响较
大 ,活性炭对从生芽诱根的影响较小 ,可以不考虑。以上分析
结合表 8可知 ,各因子的最佳组合为 A2B2, 即 0.4mg/LNAA
和 0.3mg/LIBA。生根率为 93%。 (下转 30页)
22 　　　　　　　　　　　东　北　林　业　大　学　学　报　　　　　　　　　　　　　　　第 35卷
养水源 、益鸟益兽的生存和繁殖都是重要的。凡在林内频繁
割草砍灌的地方 , 侧柏林下都有严重的水土流失 , 有的甚至石
砾满山 , 林木生长更差 , 形成了恶性循环 , 所以从长远的和维
护生态平衡的观点 , 对林下植物应适当保护。
4　结论
沂源县的石灰岩山地以黄荆 +酸枣 +胡枝子—结缕草为
建群种 , 并在数量和功能上是占优势的灌草丛。博山区的石
灰岩山地以黄荆 +酸枣 +胡枝子—结缕草 +荩草 +白羊草为
建群种。高位芽植物是灌木层中的优势层片 , 其优势种为荆
条 、黑构叶和大果榆;地上芽植物多混生于草本植物中 , 以 3
种胡枝子占优势。草本植物的优势层片为地面芽植物 ,披针
苔草 、野菊 、白羊草 、黄背草和茵陈蒿等占优势 , 卷柏是地被层
的唯一植物 , 在侧柏纯林和混交林中分布都很广 , 在林下植物
中占有重要地位。
侧柏混交林与侧柏纯林林下植物种类贫乏 ,在植物种类
组成上 , 侧柏纯林与混交林没有明显的不同 , 但也存在某些差
异 , 即同一种植物在不同林分中重要性不同 , 具体表现为重要
值的排列次序有不同(表 3、表 4)。喜光耐旱的植物种类在
纯林中的重要程度大 , 中生的 、比较耐阴的植物种类在混交林
中的重要程度大。
了解石灰岩山区植被结构特点 ,对于石灰岩山区森林的
植被恢复有重要的作用。根据条件相似地区的植被结构特
点 ,应选择合适的物种 , 改善土壤条件 , 进行植树造林。尽量
避免单一物种造林 , 根据种间关系和群落结构选用在类似条
件下自然植被种的优势种 , 按比例种植 ,避免盲目造林。对于
恢复目标的制定不能一概而论 , 而应该根据土壤条件 、经纬度
等自然条件确定恢复目标。
参　考　文　献
[ 1] 　房用 ,孙蕾 ,孟振农 , 梅丽.山东林业重点生态系统保护与利用
研究方向 [ J] .水土保持研究, 2003(2):56-58.
[ 2] 　李健 ,郗金标.山东省石灰岩山地的适生树种 [ J].山东林业科
技 , 2000(增刊):44-46.
[ 3] 　卫书平 ,董存成 ,贾静华 ,等.石灰岩山地天然灌木植被的定向
培育 [ J] .山西林业科技 , 2000(3):29-31.
[ 4] 　李林英 ,王启明 ,王玉生 ,等.石灰岩山地野皂荚灌丛水保功能
及营造技术研究 [ J] .山西林业科技 , 1998(1):13-16.
[ 5] 　王仁卿 , 周光裕.山东植被 [ M] .济南:山东科学技术出版社 ,
2000.
[ 6] 　山东森林编委会.山东森林 [ M] .北京:中国林业出版社 , 1986.
[ 7] 　王月海 ,房用 ,孟振农 ,等.山东省石灰岩山地植被资源结构特
点的初步研究 [ J] .山东林业科技 , 2003(5):26-28.
[ 8] 　龙庄如 ,梁玉堂.应把藤本和草本植物纳入山区林业生产结构
[ J] .山东林业科技 , 1995(5):2-6.
(上接 22页)
表 7　虎舌红不定芽生根诱导试验结果的方差分析
变异来源 自由度 平方和 均方 F F0.05
NAA 2 2080.11 1 040.05 30.70＊ 19.00
IBA 2 1715.67 857.83 25.32＊ 19.00
活性炭 2 252.92 126.46 3.73 19.00
试验误差 2 67.74 33.87
总计 8 4116.44
　　注:＊为 0.05水平显著。
表 8　虎舌红各因子不定芽生根的平均相对分化率比较
水平代码 NAA/mg· L-1 IBA/mg· L-1 活性炭 /mg· L-1 空列
1 20.53 21.92 23.63 20.78
2 27.64 26.38 20.17 22.41
3 15.28 15.17 19.66 20.27
极差(R) 12.36 11.21 3.97 2.14
　　诱导生根后 , 移栽到珍珠岩和沙土各半的栽培基质中 , 炼
苗 2周 , 然后移栽到土壤中 ,按常规方法管理。 35d后小苗成
活。
3　讨论
采用正交设计筛选出虎舌红愈伤组织 、丛生芽和生根培
养的最佳培养基 , 建立了虎舌红离体培养系统 , 为其观赏和药
用价值的开发利用奠定了基础。与茎段等外植体培养 [ 4-5]相
比用茎尖进行培养 , 形成丛生芽的比例高 ,因而增殖率高 , 且
变异性小。本试验选用的无菌芽茎尖最利于虎舌红的再生 ,
可能是由于虎舌红茎尖的分生能力强 、内源激素水平利于芽
分化的缘故。
植物生长调节剂种类和质量浓度对虎舌红的诱导和分化
有较大影响。本室前阶段试验发现 CPPU在刺激细胞分裂 ,
诱导芽的分化等方面比 6-BA好。因此 , 首次应用于紫金牛
属植物 , 丛生效果较好。在不定芽诱导阶段 ,适量添加 AgNO3
对不定芽的增殖起一定的辅助作用 , 并可一定程度地控制黄
化现象 [ 12] 。蔗糖对虎舌红再生体系的构建有一定的影响。
蔗糖除起维持渗透压和提供碳源的作用外 , 其浓度对离体培
养过程中器官发生的影响己有许多报道 [ 13] ,蔗糖有时能影响
丛生芽发生频率。
参　考　文　献
[ 1] 　杨妙贤.虎舌红野生资源的开发利用 [ J] .中国野生植物资源 ,
2004, 23(6):27-32.
[ 2] 　詹选怀 ,桂忠明 ,陈春泉 ,等.虎舌红迁地保护技术的研究 [ J] .
中国野生植物资源 , 2005, 24(1):65-67.
[ 3] 　江香梅 ,邓小梅.虎舌红的组织培养和植株再生 [ J] .江西林业
科技 , 2001(6):3-11.
[ 4] 　卢其能.虎舌红的生物学特性与组织培养研究 [ J] .江西林业科
技 , 2002(1):5-6.
[ 5] 　罗吉风 ,程治英 ,龙春林 ,等.虎舌红的组织培养 [ J].植物生理
学通讯 , 2004, 40(4):465.
[ 6] 　李正平.月季试管繁殖和移栽中几个因素的研究 [ J] .园艺学
报 , 1988, 15(2):131-134.
[ 7] 　程家胜.植物组织培养与工厂化育苗技术 [ M] .北京:金盾出版
社 , 2003:116-119.
[ 8] 　DebasisC, AzadMAK, DataSK.Invitropropagationofroseculti-
vars[ J].IndianJournalofPlantPhysiology, 2000, 5(2):189-192.
[ 9] 　RosuA, SkivinRM, BeinA, etal.Thedevelopmentofputative
adventitiousshootsfromachimeralthornlesroseinvitro[ J] .Jour-
nalofHorticulturalScience, 1995, 70(6):901-907.
[ 10] 　张德炎 ,李喜文 ,李建民 ,等.正交设计法在白三叶组织培养中
的应用 [ J] .东北师范大学学报:自然科学版 , 1998(1):40-
45.
[ 11] 　欧光鉴 ,胡中立.生物统计 [ M] .西安:陕西师范大学出版社 ,
1995:73-89.
[ 12] 　DebasisC, AzadMAK, DataSK.Invitropropagationofrose
cultivars[ J] .IndianJournalofPlantPhysiology, 2000, 5(2):189
-192.
[ 13] 　TangHaoru, RenZhenglong, ReustleG.Plantregenerationfrom
leavesofsweetandsourcherrycultivars[ J] .ScientiaHorticultu-
rae, 2002, 93:235-244.
30 　　　　　　　　　　　东　北　林　业　大　学　学　报　　　　　　　　　　　　　　　第 35卷