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苗药果上叶镇咳、抗炎作用有效部位筛选



全 文 :书基金项目:1. 贵州省中医药管理局中医药、民族药科学技术研究项目,项目编号:QZYY - 34;2. 贵州省科技合作计划项
目,项目编号:黔科合 LH字[2015]7265 号。
作者简介:马四补(1979 -),男,回族,副教授,在读博士,主要从事民族医药研究。
通讯作者:屈相玲,女,副主任药师,主要从事民族药物的研究与开发,E-mail:125193312@ qq. com
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贵 州
民族药
苗药果上叶镇咳、抗炎作用有效部位筛选
马四补1,2,隋艳华1,王绍辉2,刘同祥2,屈相玲3
(1. 贵阳中医学院,贵州贵阳 550002;2. 中央民族大学中国少数民族传统医学研究院,北京 100081;
3. 贵阳中医学院第二附属医院,贵州贵阳 550003)
摘 要:目的:筛选苗药果上叶镇咳、抗炎作用的有效部位。方法:观察果上叶三种提取部位对小鼠
氨水、二氧化硫引咳的镇咳作用;观察果上叶三种提取部位对二甲苯致小鼠急性炎症耳肿,腹腔毛细血管
通透性,角叉菜胶致小鼠亚急性炎症足跖肿的抗炎作用。结果:果上叶石油醚提取部位、乙酸乙酯提取部
位、水层提取部位对氨水、二氧化硫引咳及对二甲苯致小鼠耳肿胀、小鼠腹腔毛细血管通透性及角叉菜胶
致足跖肿胀均有不同程度抑制作用。结论:果上叶乙酸乙酯提取部位中剂量镇咳、抗炎作用显著。
关键词:苗药果上叶;镇咳作用;抗炎作用;筛选
Doi:10. 16588 / j. cnki. issn1002 - 1108. 2016. 01. 001
中图分类号:R285. 6 文献标识码:B 文章编号:1002 - 1108(2016)01 - 0001 - 05
Screening Effective Parts of Antitussive and Anti-inflammatory
from Miao Medicine Guoshangye
MA Si-bu1,2,SUI Yan-hua1,WANG Shao-hui2,LIU Tong-xiang2,QU Xiang-ling3
(1. Guiyang College of TCM,Guiyang 550002,Guizhou China;2. Minzu University of China,
Institute of Chinese minority traditional medicine ,Beijing 100081,China;3. The second Affiliated Hospital of
Gaiyang College of TCM,Guiyang 550001,Guizhou China)
Abstract:Objective:To screen the effective parts of antitussive and anti-inflammatory fromMiao Medicine
Guoshangye. Methods:The effect on alleviating cough was observed in mice with ammonia water or sulfur diox-
ide induced cough;and the effect of extracts on xylene-induced ear edema,acetic acid induced vascular perme-
ability and carrageenan-induced hind paw edema tests in mice were investigated. Results:The parts of petrole-
um ether,ethyl acetate and water extracts could decrease the cough frequency in mice with ammonia water or
sulfur dioxide,inhibit ear swelling caused by Dimethyl benzene,carrageenan-induced hind paw edema model in
mice and the increase of peritoneal capillary permeability induced by HAC. Conclusion:The ethyl acetate parts
·1·
第 38 卷 第 1 期
2016 年 1 月
贵阳中医学院学报
Journal of Guiyang college of TCM
No. 1 Vol. 38
January 2016
of Guoshangye has significant function of antitussive and anti-inflammatory effects.
Key words:Miao Medicine Guoshangye;antitussive effect;Anti-inflammatory effect;Screening
果上叶为《贵州省中药材、民族药材质量标
准》(2003 版)收载品种,来源于兰科植物云南石
仙桃 Pholidota yunnanensis Rolfe 的干燥根状茎和
假鳞茎,具有养阴清肺,化痰止咳,行气止痛之功
效,用于肺结核咳嗽、咯血,慢性气管炎,慢性咽
炎,疝气疼痛,月经不调,疮疡肿痛等症[1]。为进
一步研究果上叶的疗效和作用机制,为果上叶的
新药开发提供依据,本文进行了果上叶镇咳、抗炎
作用有效部位筛选研究,现报告如下。
1 材料
1. 1 受试药物
果上叶经贵阳中医学院孙庆文副教授鉴定为
兰科植物云南石仙桃 Pholidota yunnanensis Rolfe
的干燥根状茎和假鳞茎。果上叶 15kg 95%乙醇
回流提取三次(4h,3h,3h),回收乙醇,浓缩,分别
用石油醚和乙酸乙酯萃取,获得石油醚部位
74. 01g,乙 酸 乙 酯 部 位 592. 97g,水 层 部 位
255. 78g。根据果上叶民间成人用量 30g /日,配制
成高、中、低剂量组,分别相当于成人剂量的 20
倍、10 倍、5 倍。
1. 2 阳性药
消炎止咳片(伊春五加参药业有限责任公司,
国药准字 Z20055423,批号:20130809),规格
0. 25g /片,成人剂量(2 片 × 3 次 /日),即相当于
0. 025g /kg。小鼠实验用量为 0. 25g /kg,相当于成
人剂量 10 倍,实验时用蒸馏水配置成 1. 25%,给
药剂量 20ml /kg,即 0. 2ml /10g。
1. 3 试剂与仪器
1. 3. 1 试剂吐温 - 80 北京索莱宝公司,批号:
304A52;25%氨水,重庆茂名化学试剂有限公司,
批号 20120501;99%硫酸:成都市科龙化工试验场
(分析纯),批号:20120704;无水亚硫酸钠,重庆吉
元化学试剂有限公司,批号 20140116,氯化钠注射
液,四川科伦药业股份有限公司,批号 20131101;
二甲苯,重庆川东化工有限公司化学试剂厂,批
号:20090803;角叉菜胶,瑞士 Flukα 公司进口分
装,批号:CH -9803;伊文思蓝,瑞士 Flukα 公司进
口分装,批号:CH -9803;冰醋酸,重庆市东方试剂
研究所,批号:20041210。
1. 3. 2 仪器电子天平 上海菁海仪器有限公司;
超声雾化器,江苏双盛医疗器械有限公司;微量电
子天平,上海菁海仪器有限公司;L600 台式低速离
心机:湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。
1. 4 实验动物
SPF级 KM 小鼠,(20 ± 2)g,雌雄各半(重庆
市动物质检中心提供,实验动物质量合格证号,
NO:00200503,许可证号:SCXK - (军)2012 -
0003);二级 KM小鼠,(20 ± 2)g,雌雄各半(贵阳
医学院实验动物中心提供,实验动物质量合格证
号,NO:00200406,许可证号:SCXK -(黔)2012 -
001)。饲料:全价颗粒喂养动物,提供单位同上。
1. 5 实验场地
贵阳中医学院实验中心,室温 20℃,相对湿度
60 - 70%,温、湿度适宜,清洁卫生,通风良好。
2 统计学处理
本文数据处理均以均数 ±标准差(x ± s)表
示,采用 SPSS 20. 0 统计软件,比较组间及与对照
组是否有统计学差异。
3 实验方法与结果
3. 1 果上叶三种提取部位镇咳作用实验
研究[2 - 5]
3. 1. 1 果上叶三种提取部位对小鼠氨水引咳镇
咳作用 取昆明种小鼠 132 只(20 ± 2g),雌雄各
半,分别称重,随机分为:正常对照组、阳性药对照
组、水层提取部位高、中、低剂量组、乙酸乙酯提取
部位高、中、低剂量组、石油醚提取部位高、中、低
剂量组,共 11 组,每组各 12 只。分别灌胃给药,
灌胃容量均为 20ml /kg,即 0. 2ml /10g体重,每日 1
次,连续 8 天,末次给药后 1 小时,将小鼠逐只放
入倒置 500ml 烧杯内,以超声喷雾器喷入定量
25%氨水引咳,观察小鼠咳嗽潜伏期“s”,2min 内
小鼠咳嗽次数,结果显示:果上叶乙酸乙酯提取部
位镇咳作用明显(P < 0. 01),其镇咳作用优于阳性
药对照药(P < 0. 001),见表 1。
·2· 贵阳中医学院学报 第 38 卷
表 1 果上叶三种提取部位对氨水引咳小鼠止咳作用结果表(x ± s,N =12)
组别 剂量 g /kg 咳嗽潜伏期(s) 咳嗽次数 /2min
正常对照组 - 27. 0 ± 8. 23 56. 3 ± 10. 09
阳性药对照组 0. 25 33. 0 ± 8. 23 41. 7 ± 10. 21##
水层高剂量组 0. 171 36. 8 ± 6. 07# 22. 1 ± 12. 84##**
水层中剂量组 0. 086 30. 3 ± 6. 58 34. 9 ± 9. 28##
水层低剂量组 0. 043 40. 67 ± 13. 18# 18. 3 ± 7. 18##**
乙酸乙酯高剂量组 0. 395 50. 6 ± 14. 69##** 17. 8 ± 6. 71#**
乙酸乙酯中剂量组 0. 196 57. 5 ± 16. 06##** 15. 5 ± 6. 35##**
乙酸乙酯低剂量组 0. 099 52. 1 ± 13. 45##** 21. 5 ± 6. 02##**
石油醚高剂量组 0. 049 49. 4 ± 14. 21##* 32. 9 ± 8. 63*
石油醚中剂量组 0. 025 39. 4 ± 10. 19## 31. 0 ± 8. 01###*
石油醚低剂量组 0. 013 56. 7 ± 8. 17##** 25. 3 ± 8. 86##**
注:与正常对照组比,#P < 0. 05,##P < 0. 01;与阳性药对照组比,* P < 0. 05,**P < 0. 01。
3. 1. 2 果上叶三种提取部位对二氧化硫(SO2)引
咳小鼠的镇咳作用 取昆明种小鼠(动物、分组、
给药方式均同“3. 1. 1”)连续灌胃给药 8 天,末次
给药后 1 小时,立即将 0. 5g 无水亚硫酸钠滴入
5ml 50%硫酸蒸发皿,放在 500ml 倒置烧杯内,随
即将逐只小鼠放入此烧杯内,立即观察并记录各
小鼠咳嗽潜伏期(s)及 2min 内咳嗽次数,结果果
上叶乙酸乙酯提取部位中剂量组及石油醚提取部
位高剂量组均有明显的镇咳作用(P < 0. 05),镇咳
效应近似于阳性药对照组(P < 0. 05)。见表 2。
表 2 果上叶三种提取部位对 SO2 引咳小鼠止咳作用结果表(x ± s,N =12)
组别 剂量 咳嗽潜伏期(s) 咳嗽次数 /2min
正常对照组 - 37. 8 ± 9. 73 58. 0 ± 11. 88
阳性药对照组 0. 25 51. 6 ± 14. 1 27. 5 ± 13. 3
水层高剂量组 0. 171 48. 6 ± 15. 23# 42. 9 ± 24. 54**
水层中剂量组 0. 086 47. 0 ± 18. 58# 52. 5 ± 16. 76**
水层低剂量组 0. 043 51. 7 ± 15. 09# 44. 9 ± 22. 83**
乙酸乙酯高剂量组 0. 395 35. 5 ± 12. 12* 61. 5 ± 10. 93**
乙酸乙酯中剂量组 0. 196 50. 9 ± 11. 71# 42. 6 ± 9. 09##*
乙酸乙酯低剂量组 0. 099 35. 2 ± 13. 26* 66. 2 ± 17. 68**
石油醚高剂量组 0. 049 50. 4 ± 8. 92# 44. 4 ± 8. 5#**
石油醚中剂量组 0. 025 45. 6 ± 11. 51* # 62. 7 ± 17. 69**
石油醚低剂量组 0. 013 40. 2 ± 7. 76* 66. 3 ± 13. 3**
注:与正常对照组比较,#P < 0. 05,##P < 0. 01;与阳性药对照组比,* P < 0. 05,**P < 0. 01。
3. 2 果上叶三种提取部位抗炎作用实验
研究[4 - 6]
3. 2. 1 果上叶三种提取部位对二甲苯致小鼠(急
性炎症)肿胀抑制作用 昆明种小鼠(分组、给药
等均同“3. 1. 1”),末次给药后 1h逐只在小鼠左耳
正反两面涂二甲苯 0. 03ml /只,右耳作为自身对
照,15min脱颈处死小鼠,沿耳廓基线剪下两耳,用
直径 8mm的打孔器分别在两耳相应部位打孔取
耳片,分别天平称重(mg),以左耳片减去右耳片
重量之差为肿胀度(mg),并求肿胀度抑制率
·3·第 1 期 马四补,隋艳华,王绍辉,等.苗药果上叶镇咳、抗炎作用有效部位筛选
(%),肿胀度抑制率(%)= (正常对照组平均肿
胀度 -给药组平均肿胀度)/正常对照组平均肿胀
度 × 100%。结果显示,果上叶乙酸乙酯提取部位
中、低剂量组及石油醚提取部位低剂量组有明显
的抗炎作用(P < 0. 01);阳性药对照组与正常对照
组比较,抗炎效应不显著,果上叶三种提取部位及
阳性药的抑制率均大于 30%,表明果上叶各种提
取部位均有抗二甲苯致急性炎症的作用。见表 3。
表 3 果上叶三种提取部位对二甲苯致小鼠耳廓肿胀
的抑制作用(x ± s,N =12)
组别 剂量 g /kg 肿胀度(mg) 抑制率(%)
正常对照组 - 21. 0 ± 7. 29
阳性药对照组 0. 25 12. 1 ± 7. 75 42. 38
水层高剂量组 0. 171 10. 6 ± 8. 66# 49. 52
水层中剂量组 0. 086 9. 2 ± 6. 18 56. 19
水层低剂量组 0. 043 11. 4 ± 8. 38# 45. 71
乙酸乙酯高剂量组 0. 395 9. 9 ± 7. 62##** 52. 86
乙酸乙酯中剂量组 0. 196 10. 9 ± 7. 29##** 48. 10
乙酸乙酯低剂量组 0. 099 6. 1 ± 3. 51##** 70. 95
石油醚高剂量组 0. 049 9 ± 4. 74##* 57. 14
石油醚中剂量组 0. 025 5. 3 ± 3. 37# 74. 76
石油醚低剂量组 0. 013 6. 1 ± 4. 58##** 70. 95
注:与正常对照组比较,#P < 0. 05,##P < 0. 01;与阳性药对照
组比,* P < 0. 05,**P < 0. 01。
3. 2. 2 果上叶三种提取部位对小鼠腹腔毛细血
管通透性影响 昆明种小鼠(分组、给药等均同
“3. 1. 1”),末次给药 1h 后,逐鼠尾静脉注射
0. 5%伊文思蓝生理盐水溶液 0. 2ml /10g 体重,并
立即腹腔注射 0. 6%冰醋酸 0. 2ml /只,20min 后腹
腔注射 5ml 生理盐水,脱颈处死,剪开腹腔,用吸
管取腹腔液 4 ~ 6ml,分别注入试管内,再用生理盐
水加至 7ml,置入 L600 台式低速离心机,1000rmp
离心 5min,取上清液加入比色杯内,在 721 分光光
度计 590nm处测量吸光度(OD 值),结果显示,果
上叶乙酸乙酯提取部位中剂量组与正常对照组比
较显著降低(P < 0. 05),与阳性药对照组比较有显
著性差异(P < 0. 05)。显示乙酸乙酯提取部位中
剂量有明显的抗炎作用,见表 4。
表 4 果上叶三个提取部位对小鼠腹腔毛细血管通透性
的影响(x ± s,N =12)
组别 剂量 k /kg 吸光度(OD值)
正常对照组 - 0. 296
阳性药对照组 0. 25 0. 276
水层高剂量组 0. 171 0. 260
水层中剂量组 0. 086 0. 267
水层低剂量组 0. 043 0. 273
乙酸乙酯高剂量组 0. 395 0. 268
乙酸乙酯中剂量组 0. 196 0. 217#*
乙酸乙酯低剂量组 0. 099 0. 267
石油醚高剂量组 0. 049 0. 262
石油醚中剂量组 0. 025 0. 262
石油醚低剂量组 0. 013 0. 290
注:与正常对照组比较,#P < 0. 05;与阳性药对照组比较,* P
< 0. 05。
3. 2. 3 果上叶三种提取部位对角叉菜胶致小鼠
足跖肿胀(亚急性炎症)的抑制作用 昆明种小鼠
(分组、给药等均同上述“3. 1. 1”)末次给药后 1h,
逐只在小鼠踝关节以上长毛部位与短毛部位分界
线剪取左、右鼠双足,分别称其重量(g),以致炎左
足减去右足重量之差为肿胀度,并求肿胀度抑制
率,肿胀度抑制率(%)= (正常对照组平均肿胀
度 -给药组平均肿胀度)/正常对照组平均肿胀度
× 100%。结果显示,果上叶水层提取部位低剂
量、乙酸乙酯提取部位中剂量组及石油醚提取部
位中、低剂量组有明显的抗炎作用(P < 0. 01),果
上叶石油醚提取物中剂量抗炎效应优于阳性药对
照组(P < 0. 05)。果上叶水层提取部位低剂量组、
乙酸乙酯提取部位中剂量组、石油醚提取部位中
剂量组对对角叉菜胶致小鼠足跖肿胀(亚急性炎
症)的抑制率均大于 30%,表明果上叶水层提取部
位低剂量、乙酸乙酯提取部位中剂量、石油醚提取
部位中剂量均有抗角叉菜胶致亚急性炎症的作
用,见表 5。
·4· 贵阳中医学院学报 第 38 卷
表 5 果上叶三种提取部位对角叉菜胶致小鼠足跖肿胀度的
抑制作用(x ± s,N =12)
组别 剂量 g /kg 肿胀度(mg) 抑制率(%)
正常对照组 - 16. 0 ± 1. 94 -
阳性药对照组 0. 25 11. 9 ± 4. 36# 25. 63
水层高剂量组 0. 171 14. 3 ± 3. 97 10. 63
水层中剂量组 0. 086 12. 3 ± 3. 47# 23. 13
水层低剂量组 0. 043 10. 8 ± 2. 94## 32. 50
乙酸乙酯高剂量组 0. 395 13. 0 ± 2. 67# 18. 75
乙酸乙酯中剂量组 0. 196 10. 7 ± 2. 5## 33. 13
乙酸乙酯低剂量组 0. 099 12. 7 ± 3. 06# 20. 63
石油醚高剂量组 0. 049 11. 3 ± 4. 42# 29. 38
石油醚中剂量组 0. 025 7. 1 ± 3. 14##* 55. 63
石油醚低剂量组 0. 013 11. 6 ± 2. 27## 27. 50
注:与正常对照组比较,#P < 0. 05,##P < 0. 01;与阳性药对照
组比较,* P < 0. 05。
4 讨论
咳嗽是呼吸系统疾病的一个主要症状,是一
种保护性反射,正常、偶尔的咳嗽具有促进呼吸道
的痰液和异物排出,保持呼吸道清洁与通畅的作
用。但长期慢性咳嗽会使肺内压增高,有慢性支
气管炎症、肺结核等肺部疾病病人,剧烈咳嗽还会
使肺泡壁弹性减弱,最终导致肺泡破裂,形成肺大
泡,形成恶性循环。炎症是具有血管系统的机体
对组织损伤或致病因子浸入所发生的以防御为主
的反应,分为以毛细血管扩张、通透性增加而引起
炎性渗出和炎性肿胀为特征的早期炎症,以白细
胞趋化游走为特征的中期炎症和以结缔组织增
生、肉芽肿形成为特征的晚期炎症。长期炎症可
能会引起一些自身免疫性疾病,严重者甚至可导
致癌症。咳嗽和炎症对机体的危害不可小觑。果
上叶作为苗族、水族、土家族民间常用的镇咳、止
痛药[7 - 10],疗效确切、愈后良好、不易复发,且毒副
作用小,具备良好的开发研究前景。本文采用传
统经典的氨水、二氧化硫引咳小鼠模型,筛选果上
叶镇咳有效部位;采用二甲苯、冰醋酸致炎症模型
和角叉菜胶致小鼠足跖肿胀模型,筛选果上叶抗
炎有效部位,实验结果表明:果上叶乙酸乙酯提取
部位有显著的镇咳作用和显著的抗炎作用。本实
验不仅验证了苗族传统药物果上叶的镇咳、抗炎
作用,还进一步验证了其镇咳、抗炎的有效成分主
要集中在乙酸乙酯提取部位,为果上叶的临床应
用和进一步开发研究提供了可靠的科学理论及实
验依据。但具体是乙酸乙酯提取部位的哪个或哪
些化学成分发挥作用,其机理、机制尚不清楚,有
待进一步深入研究探讨。
参考文献
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(修回日期:2015 - 09 - 25)
·5·第 1 期 马四补,隋艳华,王绍辉,等.苗药果上叶镇咳、抗炎作用有效部位筛选