全 文 :※营养卫生 食品科学 2013, Vol.34, No.15 267
膳食补充剂荔枝壳原花青素对大鼠排泄物的影响
李书艺,吴 茜,汪 荣,孙智达*,谢笔钧*
(华中农业大学食品科学技术学院,湖北 武汉 430070)
摘 要:以荔枝壳原花青素低聚体(LPOPC)为研究对象,对SD大鼠连续给药1周,给药剂量150mg/(kg·d)。给药
期间,收集动物灌胃后第1、2、3、5、7天的排泄物,并分析动物给药前后尿液和粪便性质的改变与差异。结果表
明:给药后大鼠尿液的总抗氧化能力显著升高(P<0.01),且与尿液中总酚类物质的含量呈现相关性。在电子鼻分析
仪中,给药组大鼠的粪便气味响应值明显低于空白组;HS-SPME-GC-MS分析证实,原花青素灌胃后粪便中挥发性
物质苯甲醛、4-甲基苯酚等的强度升高,而产生腐败气味的吲哚、4-乙基苯酚等物质的含量则降低。对粪便中原花
青素的代谢产物进行鉴定,发现了单体(-)-表儿茶素和m-香豆酸的存在。
关键词:荔枝壳原花青素;大鼠;排泄物;抗氧化能力;电子鼻;气质联用
Effect of Litchi Pericarp Procyanidins as a Dietary Supplement on Excreta of Rats
LI Shu-yi,WU Qian,WANG Rong,SUN Zhi-da*,XIE Bi-jun*
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)
Abstract:An increasing amount of attention is being paid to litchi pericarp procyanidins due to its strong antioxidant activity
in vitro and in vivo. Litchi pericarp oligomeric procyanidins (LPOPC) were investigated in this study. SD rats were administered
with LPOPC at the dose of 150 mg/(kg•d) for 1 week. The urine and feces were collected on the 1st, 2nd, 3rd, 5th and 7th day
during LPOPC administration to compare excreta characteristics from the control group. LPOPC administration resulted in
a signifi cant elevation in the T-AOC of rat urine, which was linked to total phenol content. However, the fecal odor of rats
revealed a decreasing trend after the administration of LPOPC as illustrated by electronic nose analysis, which was due to the
reduction in putrefactive products such as indole and 4-ethyl phenol in feces and an increasing amount of volatile compounds
such as benzaldehyde and 4-methyl phenol as identifi ed by HS-SPME-GC-MS. In addition, LC-MS analysis of procyanidin
metabolites in feces suggested that (-)-epicatechin and m-coumaric acid were the major components.
Key words:Litchi pericarp procyanidins;rats;excreta;T-AOC;electronic nose;GC-MS
中图分类号:TS264.4 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2013)15-0267-05
doi:10.7506/spkx1002-6630-201315055
收稿日期:2013-06-07
基金项目:“十二五”国家科技支撑计划项目(2012BAD31B03)
作者简介:李书艺(1987—),女,博士研究生,研究方向为天然产物化学。E-mail:lishuyisz@sina.com
*通信作者:谢笔钧(1943—),女,教授, 研究方向为食品化学。E-mail:bijunxie@sina.com
孙智达(1963—),男,教授,博士,研究方向为天然产物化学。E-mail:sunzhida@sina.com
荔枝(Litchi chinensis Sonn.),为无患子科常绿植物所
结果实,亚热带盛产,是我国著名的特产水果之一。它广
泛种植于我国广东、广西等地,栽培面积约900万亩,产
量达130万t,分别占世界荔枝总种植面积的84.5%和总产
量的59.7%。荔枝果壳色泽鲜艳,占果实鲜质量15%,产
量丰富,但常作为食品工业的弃料,造成了极大的环境污
染和浪费。实际上,荔枝果皮的药用价值很高,且含有丰
富的多酚类物质(花色苷、原花青素、黄酮等),抗氧化活
性显著,可作为一种极好的天然抗氧化剂植物原料[1-3]。
荔枝壳中的原花青素主要为A-型原花青素低聚体,其不
仅具有很好的清除DPPH自由基、氧自由基、抑制脂质过
氧化等的体外抗氧化活性[4-5],还具有较好的抑菌性和抑
制小鼠动脉粥样硬化的效果[6]。鉴于原花青素已逐渐被人
们定义为日常饮食中的一种膳食补充剂,其在生物体内的
吸收、代谢和排泄等情况也越来越多的引起科学家的关
注,并成为影响其生物活性和生物利用率的重要因素。
实验室近期研究发现,荔枝壳原花青素在动物体内
的吸收很少,在血液中主要以表儿茶素单体及其甲基化
形式存在;而未被吸收的原花青素低聚体到达结肠后被
肠道微生物降解,形成了多种酚酸及其衍生物并通过尿
液排出体外[7]。在此过程中,原花青素不仅在小肠和肝脏
酶系的作用下发生了一系列的修饰反应,同时也和各器
268 2013, Vol.34, No.15 食品科学 ※营养卫生
官组织及肠道微生物之间发生着相互作用[8]。因此,荔枝
壳原花青素的代谢必然会对生物体的终端排泄物产生影
响。本实验将收集荔枝壳原花青素喂养一周时间内SD大
鼠的粪便和尿液,通过研究它们性质的变化,探究原花
青素的代谢特征。为进一步研究原花青素的活性、提高
其生物利用率提供思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
荔枝品种白腊(Litchi chinensis Sonn. cv. Baila),2012
年7月采自广州。采后去皮,果壳于—18℃冰柜中保
存。大鼠灌胃所用荔枝壳原花青素低聚体(litchi pericarp
oligomeric procyanidins,LPOPC),按实验室已成熟的纯
化方法进行制备[9]:将果皮浸泡在70%乙醇中50℃恒温水
浴90min,随后提取液除去乙醇经过AB-8大孔吸附树脂
进行纯化。洗脱液先减压蒸馏,再用乙酸乙酯萃取,酯
相除去有机试剂后冷冻干燥即得到所需样品,其中低聚
体含量>90%。
SD雄性大鼠10只,(100±5)g/只,6周龄,由武汉大
学动物实验中心提供(编号No.4200593442)。动物房饲养
温度在20~25℃之间,湿度60%~65%,光照10~12h/d。
自由饮食2周适应环境后,开始实验。
乙腈、甲醇均为色谱纯 美国Fisher公司;福林-酚
试剂 美国Sigma公司分装;T-AOC试剂盒 南京建成
生物工程研究所;其他化学试剂(分析纯) 国药集团化
学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
1100series 液相质谱联用仪、5975C-7890A气相质
谱联用仪 美国Agilent公司;LC-1000高效液相色谱仪
日本岛津公司;Fox 4000气味指纹分析仪 法国Alpha
Mos公司;UV-2100分光光度计 美国尤尼科公司。
1.3 方法
1.3.1 动物实验
当大鼠体质量达到(200±10)g(8周龄)时,开始进行
代谢实验。LPOPC灌胃剂量为150mg/(kg·d),灌胃体
积为大鼠体质量的1%。每天上午10点左右灌胃,持续1
周。在此1周内,大鼠保持正常饮食,并置于代谢笼中单
笼喂养。分别收集灌胃前和灌胃后第1、2、3、5、7天动
物的尿液和粪便,于-80℃冰柜中冷冻保存。提示尿液
体积约为7~8mL,分析前定容至10mL。
1.3.2 尿液中原花青素含量的测定
以葡萄籽原花青素为标准品,分别配制质量浓度
为0.15、0.1、0.05、0.025、0.01mg/mL的标准液,采
用盐酸 -正丁醇法 [10],作标准曲线并计算回归方程为
Y=2.8451X+0.006(R2=0.9994)。各取1.0mL尿样加水定
容至10mL,再取稀释液按上述相同方法进行操作。在
546nm波长处测定反应产物的吸光度,根据标准曲线计
算尿液中原花青素的含量。
1.3.3 尿液总酚含量的测定
分别取质量浓度为 0、 5 0、 1 0 0、 1 5 0、 2 5 0、
500mg/L的标准溶液0.2mL加至12mL去离子水中,混
合后加入1mL 福林-酚试剂,均匀混合30s再静置8min,
最后加入3mL 20g/100mL碳酸钠溶液,定容至20mL。
室温下放置2h后,765nm波长处比色,用吸光度(Y)对
标准溶液质量浓度(X)制作标准曲线 [11]。计算回归方程
为Y =0.001X-0.0139(R2=0.9991)。吸取1mL尿样稀释至
10mL,按标准曲线取样方法操作,根据标曲计算尿液中
的总酚含量(即没食子酸当量)。
1.3.4 尿液总抗氧化能力的评价
根据T-AOC试剂盒说明书操作,结果表示为U/mL
尿液。
1.3.5 粪便气味的电子鼻分析
准确称取给药前后大鼠1g粪便置于进样瓶中,用气
味指纹分析仪进行分析。样品在室温下平衡20min,以
洁净干燥空气为载气,流速150mL/min,数据采集时间
120s,延滞时间5min,最优进样体积为1000μL,平行操
作3次。结果处理由Fox 4000型电子鼻附带的Alpha Soft
V11软件完成。
1.3.6 粪便气味成分HS-SPME-GC-MS分析
将DVB-CAR-PDMS固相萃取头在GC进样口老化
5min,再插入装有1g大鼠粪便和15mL蒸馏水的样品瓶中
进行萃取。萃取条件为40℃水浴,搅拌转速500r/min。
45min后取出,插入GC-MS仪器进样口进行分析。
色谱条件:HP-5MS毛细管柱 (30m×0.25mm,
0.25μm);载气:高纯氦气,载气流量1.0mL/min;进样口
温度250℃;进样方式:顶空静态进样;进样量1µL;程序
升温:40℃保留3min,5℃/min从40℃到120℃,8℃/min从
120℃到250℃,250℃条件下保持10min。
质谱条件:GC-MS接口温度280℃;离子源温度
230℃;四极杆温度150℃;电离方式EI源;电离电压
70eV;扫描离子范围50~400u。
1.3.7 粪便中主要原花青素代谢产物的鉴定
取5g给药大鼠粪便溶于50mL 50%甲醇水溶液中,
50℃水浴提取1h。水浴后5000r/min离心10min取上清液,
减压旋蒸除去有机试剂。剩余溶液通过乙酸乙酯萃取后
复溶于25%甲醇中,通过C18固相萃取柱纯化。所得为粪
便中原花青素的代谢产物,进行HPLC-MS分析。
色谱条件:色谱柱ZORBAX Ec l ipse XDB-C 18
(150mm×4.6mm,5μm);流动相A为0.4%乙酸水溶
液,流动相B为乙腈,洗脱梯度参考实验室前期研究
方法[9]。
※营养卫生 食品科学 2013, Vol.34, No.15 269
质谱条件:采用ESI负离子模式;孔压-30V;雾化
压力4kV;气体流速20mL/min;离子源温度325℃;质谱
离子扫描范围m/z 100~1200。
1.4 统计学分析
数据以 x ±s表示,采用Origin8.0软件进行一元方
差分析(One-Way ANOVA),组间差异表现为P<0.05和
P<0.01。
2 结果与分析
2.1 大鼠尿液中原花青素含量的变化
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0(ぎⱑ㒘) 1 2 3 5 7
ᯊ䯈/d
䞣
/ (m
g/
m
L)
图 1 大鼠给予LPOPC前后7d尿液中原花青素的含量
Fig.1 Procyanidin contents in rat urine before and after LPOPC
administration
由图1可知,空白组尿液在盐酸-正丁醇体系中有显
色反应,折合原花青素的含量为(0.355±0.074)mg/mL;
而灌胃1、2、3、5、7d后大鼠尿液中的原花青素含量
为(0.714±0.127)、(0.541±0.151)、(0.513±0.131)、
(0.531±0.139)、(0.573±0.112)mg/mL。根据统计学分
析,给药1d后动物尿液中原花青素的响应值最高,且和
空白组尿液的检出值存在显著性差异(P<0.05)。2d后大
鼠的原花青素排泄量趋于稳定,但和空白组尿液之间无
显著性差异。说明黄烷醇类物质在尿液中的排出量并不
高,且未对尿液性质产生显著的影响。
2.2 大鼠尿液中总酚含量的变化
0.9
1.0
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0(ぎⱑ㒘) 1 2 3 5 7
ᯊ䯈/d
䞣
/ (m
g/
m
L)
图 2 大鼠给予LPOPC前后7d尿液中总酚含量的变化
Fig.2 Change in total phenol content of rat urine before and after
LPOPC administration
由图2可知,给药前(0d)和给药后(1、2、3、5、
7d)大鼠尿液中的总酚含量分别为 (0 .339±0 .047)、
(0.610±0.065)、(0.641±0.144)、(0.748±0.209)、
(0.728±0.210)、(0.738±0.191)mg/mL。灌胃原花青素的
大鼠尿液均与空白组尿液之间存在显著差异(P<0.05)。
且在灌胃1周之内,动物尿液中酚类物质的含量保持稳
定。说明原花青素给药对大鼠尿液的影响主要体现在酚
类物质的排泄上,此与之前的研究结果保持一致[12]。
2.3 大鼠尿液的总抗氧化能力分析
24
20
16
12
8
4
0
0(ぎⱑ㒘) 1 2 3 5 7
ᯊ䯈/d
T-
A
O
C
/ (U
/ m
L)
图 3 大鼠灌胃后尿液的总抗氧化能力比较
Fig.3 Total antioxidant capacity (T-AOC) of rat urine before and after
LPOPC administration
由图3可知,从第2天开始,给药大鼠尿液的总抗
氧化能力与空白组尿液呈现出极显著的差异(P<0.01),
且大鼠尿液的总抗氧化能力与其酚类物质的含量显著相
关。说明LPOPC改变了SD大鼠体内的内循环和排泄物的
性质,其吸收和代谢的过程在动物的体内发挥着不容忽
视的抗氧化作用。
2.4 电子鼻分析大鼠粪便气味的变化
P30/2
T40/2
T40/1
TA/2
LY2/LG
LY2/G
LY2/AA
LY2/GH
LY2/gCTL
LY2/gCT
T30/1
P10/1
P10/2
P40/1
T70/2
PA/2
P30/1
P40/2
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
0d
1d
2d
3d
5d
7d
图 4 大鼠灌胃不同天数后粪便的电子鼻数据雷达图
Fig.4 Radar chart of fecal odor of rats at different days before and
after LPOPC administration determined by electronic nose
由图4可知,电子鼻18个传感器对不同给药天数和未
给药大鼠的粪便均能作出不同程度的响应。其中P30/1、
PA/2、T30/1、LY2/AA这4个传感器响应值较高,区分效
果良好。主成分分析法(PCA)处理电子鼻实验数据后发
现,空白组和给药组粪便的贡献率之和在98%以上,且
差异显著。空白粪便的气味强度最大,给药第2天粪便的
气味最弱。说明LPOPC能改变并减弱动物粪便的气味。
270 2013, Vol.34, No.15 食品科学 ※营养卫生
2.5 大鼠粪便的挥发性气味成分分析
鉴于空白组和给药组大鼠粪便气味的显著性差异,
分别对两组粪便中的挥发性气味成分进行了顶空固相微
萃取和气质联用分析。由图5可知,LPOPC的体内代谢并
未改变大鼠粪便气味的组成,但相对丰度有所不同。
5 10 15 20 25 30 35 40
0
1
2
3
4
ᔎ
ᑺ
(h
10
6 )
a
ᯊ䯈/min
ᔎ
ᑺ
(h
10
6 )
ᯊ䯈/min
5 10 15 20 25 30 35 40
0
1
2
3
b
a. 空白组;b.给药组。
图 5 大鼠粪便挥发性气味成分GC-MS总离子流图
Fig.5 Total ion chromatogram of GC-MS analysis for the volatile odor
of rat feces
表 1 大鼠灌胃前后粪便挥发性气味成分的HS-SPME-GC-MS比较分析
Table 1 Characterization of fecal odor compounds in LPOPC-
administrated rats by HS-SPME-GC-MS
序号 保留时间/min 化合物 分子式 编号CAS# 匹配度/% 变化
1 4.4113 3-甲基庚烯 C8H16 004810-09-7 91
2 7.2596 2-庚酮 C7H14O 000110-43-0 90
3 9.4278 苯甲醛 C7H6O 000100-52-7 94 ↑
4 10.3841 苯酚 C6H6O 000108-95-2 90
5 13.4962 4-甲基苯酚 C7H8O 000106-44-5 96 ↑
6 14.3741 小茴香醇 C10H18O 001632-73-1 96
7 15.9281 龙脑莰醇 C10H18O 010385-78-1 95 ↓
8 16.1012 4-乙基苯酚 C8H10O 000123-07-9 95 ↓
9 16.8473 α-松油醇 C10H18O 000098-55-5 91
10 17.6676 苯并噻唑 C7H5NS 000095-16-9 95
11 19.7121 吲哚 C8H7N 000120-72-9 97 ↓
12 21.9586 奎酸乙酯 C12H24O2 000110-38-3 95 ↓
13 22.0204 十四烷 C14H30 000629-59-4 96 ↑
14 22.3460 α-柏木烯 C15H24 000469-61-4 98
15 22.5150 β-柏木烯 C15H24 000546-28-1 96
16 22.7129 罗汉柏烯 C15H24 000470-40-6 99
17 23.3930 α-柏木萜烯 C15H24 050894-66-1 92
18 23.6733 α-姜黄烯 C15H22 000644-30-4 93
19 23.9248 十五烷 C15H32 000629-62-9 95 ↑
20 24.1267 (+)-花侧柏烯 C15H22 016982-00-6 97
21 24.4111 d-杜松烯 C15H24 000483-76-1 98 ↑
22 25.8456 柏木脑 C15H26O 000077-53-2 99 ↓
23 26.5669 α-杜松醇 C15H26O 000481-34-5 96 ↓
24 28.5042 十八烷 C18H38 000593-45-3 97
由表1可知,将定性结果与NIST质谱库中标准质谱图
对照,参考相关文献进行人工检索,共鉴定出24种匹配
度大于90%的粪便挥发性成分。其中,有11种气味物质
的含量存在显著差异。给药后,粪便中苯甲醛、4-甲基
苯酚等5种物质的强度升高,而吲哚、龙脑莰醇等6种物
质的含量降低。表明原花青素提取物的给予确实能显著
的改变动物粪便的气味,与电子鼻的结果相符。
2.6 粪便中原花青素的代谢产物分析
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
1
2
3
4
5
ᔎ
ᑺ
(h
10
6 )
ᯊ䯈/min
图 6 粪便中原花青素代谢产物的LC-MS总离子流图
Fig.6 Total ion chromatogram of LC-MS analysis for procyanidin
metabolites in rat feces
Є
ᑺ
(h
10
5 )
290.8
0
2
4
6
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
m/z
a
Є
ᑺ
(h
10
6 )
m/z
165.0
0
1
2
3
4
5
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
b
a.化合物1;b. 化合物2。
图 7 粪便中主要代谢产物的质谱图
Fig.7 Mass spectra of main metabolites in feces
表 2 粪便中主要原花青素代谢产物的鉴定
Table 2 Identifi cation of main procyanidin metabolites in feces
化合物 保留时间/min 母离子(m/z) 碎片(m/z) 鉴定化合物
1 15.4 290.8 244.9,124.8 (-)-表儿茶素
2 19.3 165.0 118.9 m-香豆酸
对纯化后粪便中原花青素的代谢产物进行了LC-MS
分析,总离子流图如图6所示。对图中主要物质进行鉴
定,结合标品的保留时间(图6)和质谱信息(图7),可以确
定化合物1和化合物2分别为黄烷醇单体(-)-表儿茶素和
※营养卫生 食品科学 2013, Vol.34, No.15 271
m-香豆酸(表2)。其中,(-)-表儿茶素是荔枝壳原花青素
的主要结构单元,而m-香豆酸是肠道微生物降解黄烷醇
类物质产生的一种重要酚酸,具有多种抗氧化抗炎症的
活性[13]。根据色谱的洗脱条件,30min后出峰的物质极性
很弱,且质谱分析m/z为254.1,其既不可能为原花青素的
共轭化合物,也不可能为降解产物。故推测,原花青素
通过粪便排出的代谢产物主要有两种,不仅远没有尿液
排泄途径中复杂,而且含量均较低。
3 讨 论
研究表明,原花青素从经口摄入到在体内吸收、代
谢,最后通过尿液和粪便排出的过程,都在发挥着其不
容忽视的抗氧化活性。原花青素抗肿瘤、抗心肌缺血,
抗炎症,抑制阿尔兹海默症,抑制动脉粥样硬化等的功
能都与其抗氧化的能力息息相关[14-16]。除此之外,原花青
素对排泄物的性质也产生了重要影响:蔓越橘原花青素
能抑制细菌造成的尿路感染[17],茶多酚能改善恶臭化合
物引起的粪便的异味[18]等,这些活性虽然表现在排泄器
官中,但同样重要。
通过分析荔枝壳原花青素给药1周内SD大鼠的尿液
发现,原花青素能通过增加尿液中酚类物质的排泄来提
高尿液的抗氧化活性,进而对整个尿路的免疫机能产生
正面影响,这是A-型原花青素所特有的[17]。尿液中原花
青素的质量浓度先升高后逐渐平稳,而总酚含量则先呈
现上升趋势后逐渐稳定,推测是因为在给药初期动物对
外源物质的耐受性较差,体内酚类物质的代谢酶未被完
全激活。原花青素在大鼠体内吸收量极少,而大部分转
化为其他物质[19],伴随着原花青素被利用的程度逐渐加
大,其代谢产生的酚类物质的含量也相应增加。有报道
显示,原花青素提取物能有效减少成人粪便中甲硫醇和
硫化氢的释放,从而达到对粪臭除臭的效果[20]。在本实
验中LPOPC给药1周,大鼠粪便的气味强度变弱,4-乙基
苯酚、吲哚、奎酸乙酯、柏木脑等挥发性腐败物质的浓
度显著降低。极有可能是原花青素在肠道中的代谢改变
了肠道菌群的分布,从而减少了粪便中这些臭味化合物
产生和吸收[21]。
因此,荔枝壳原花青素在大鼠尿液和粪便中的排泄
及其产生的影响,与其代谢途径途径息息相关。进一步
研究原花青素在生物体内的生物利用率和生物转化,对
开发其成为膳食补充剂具有重要的理论意义。
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