全 文 ：Chinese Journal of New Drugs 2013,22(22)
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中国新药杂志 2013 年第 22 卷第 22 期
［基金项目］ 国家中医药管理局中医肿瘤病学重点学科基金资助项目(国中医药发(2009)30)
［作者简介］ 尤伟，男，硕士研究生，主要从事中西医结合治疗肿瘤研究。联系电话:18715511572，E-mail:aidenahan0@ 163． com。
［通讯作者］ 张梅，女，教授，主任医师，主要从事中西医结合治疗肿瘤研究。联系电话:13856990019，E-mail:zhang69@ sohu． com。
·实验研究·
亮菌多糖对顺铂致小鼠肠黏膜损伤的保护作用
尤 伟，张 梅，李 平，张峰利，苏 丽，徐媛媛
(安徽医科大学附属省立医院中医科，合肥 230001)
［摘要］ 目的:探讨亮菌多糖(ATPS)对顺铂(DDP)致小鼠小肠黏膜损伤的保护作用。方法:90 只雄
性小鼠随机分为空白对照组，模型组，ATPS低、中、高剂量组(30，60，120 mg·kg －1)，瑞巴派特(45 mg·kg －1)
组;腹腔注射 DDP 10 mg·kg －1建立小鼠小肠黏膜损伤模型，分别用 HE染色和免疫组化观察小鼠小肠黏膜病
理学改变与小肠黏膜增殖核抗原(PCNA)阳性细胞表达情况;采用 ELISA 法检测小鼠小肠黏膜组织表皮生
长因子(EGF)含量。结果:与空白对照组比较，模型组小鼠小肠黏膜病理损伤积分显著增高;与模型组比较，
ATPS 60，120 mg·kg －1组小肠病理损伤积分均显著降低。与模型组比较，ATPS 60，120 mg·kg －1组 EGF 含量
和 PCNA阳性细胞率也均显著增高;随着 EGF 含量增高，黏膜病理损伤和 PCNA 阳性细胞率分别有下降和
增高趋势。EGF与 PCNA阳性细胞率之间存在线性相关。结论:ATPS 能刺激 DDP 致小鼠肠黏膜损伤后细
胞增殖修复，对肠黏膜损伤起到保护作用，其机制与 EGF调节有关。
［关键词］ 亮菌多糖;顺铂;黏膜损伤;表皮生长因子;细胞增殖核抗原
［中图分类号］ Ｒ961 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1003 － 3734(2013)22 － 2683 － 06
Protective effect of polysaccharide from Armillariella tabescens
on cisplatin-induced intestinal mucosal injury in mice
YOU Wei，ZHANG Mei，LI Ping，ZHANG Feng-li，SU Li，XU Yuan-yuan
(Department of Chinese Medicine，Anhui Provincial Hospital，Anhui Medical University，Hefei 230001，China)
［Abstract］ Objective:To determine the protective effect of polysaccharide from Armillariella tabescens
(ATPS)against cisplatin (DDP)-induced intestinal mucosal injury in mice． Methods:Male mice (n = 90)was
randomly divided into groups，and treated with ATPS (30，60 and 120 mg·kg －1)or rebamipide (45 mg·kg －1)．
Intestinal mucosal injury was induced by single intraperitoneal injection of DDP 10 mg·kg －1 ． The pathological
changes and expression of proliferative cell nuclear antigen (PCNA)were determined by HE staining and immuno-
histochemistry，respectively，in small intestinal mucosa． The levels of EGF in small intestinal samples were assayed
by ELISA． Ｒesults:The pathological scores in small intestinal samples were significantly increased in injured mice
compared with control mice． ATPS at 60 and 120 mg·kg －1 significantly reduced the pathological scores，and signif-
icantly increased the levels of EGF and the expression of PCNA． The pathological scores decreased and the expres-
sion of PCNA increased with the increase in the levels of EGF in small intestinal samples． The expression of PCNA
had linear correlation with levels of EGF． Conclusion:ATPS attenuates cisplatin-induced intestinal mucosal injury
in mice by stimulating mucosal cell proliferation via mechanisms involving EGF．
［Key words］ polysaccharide from Armillariella tabescens;cisplatin;mucosal injury;epidermal growth fac-
tor;proliferative cell nuclear antigen
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顺铂(DDP)是目前临床中应用比较广泛的抗
肿瘤细胞毒性药物，其作用机制主要是细胞 DNA损
伤，即作用于细胞 DNA产生铂-DNA络合物，阻碍了
细胞分裂、DNA 复制以及由此引发的 DNA 修
复［1 － 2］。然而 DDP 的这一抗肿瘤机制对于增殖较
快的正常小肠黏膜细胞会产生严重的细胞毒作用，
根据化疗方案的不同，DDP 化疗产生的严重的胃肠
黏膜损伤发生率可达 40% ～ 76%［1，3 － 5］。因此对于
DDP化疗后胃肠黏膜损伤的保护一直是 DDP 应用
的研究重点。
亮菌属白蘑科小蜜环菌中含有多种化学成分，
诸如亮菌多糖，多肽，亮菌甲素，氨基酸，脑苷脂以及
钾、镁、锌、磷等微量元素，药用价值较高;中医认为，
该菌性寒、味甘，有明目、利肺、益肠胃等功效［6］。
国内研究证实亮菌及其制剂可有效治疗小儿腹泻、
慢性胃肠炎及化疗后胃肠道黏膜损伤［6］，但对于亮
菌具体成分的消化道治疗功效并未阐明。亮菌多糖
则是由该菌中提取的多糖类生物大分子，能有效提
高放化疗后外周血白细胞增殖及骨髓细胞 DNA 含
量［7］。因此本实验就亮菌提纯物 ATPS 是否具有促
进肠黏膜细胞增殖，抑制 DDP致肠黏膜损伤和保护
肠黏膜能力进行研究，并探讨其可能的作用机制。
材 料
1 药物与试剂
ATPS由合肥志诚生物医药公司以亮菌经固态
发酵，水提醇沉法提取和柱层析纯化制取后提供，含
量 ＞ 95%;DDP(批号 H20030675，南京制药厂)和瑞
巴派特片(批号 H20020541，浙江大冢制药有限公
司)均以生理盐水配制成所需浓度。鼠抗 PCNA 单
克隆抗体(批号 BM0104，武汉博士德生物工程有限
公司) ;小鼠 EGF ELISA试剂盒(上海源叶生物科技
有限公司) ，其他试剂均为北京生命科学研究所
提供。
2 动物
SPF级 BALB /c 雄性小鼠 90 只，6 周龄，体重
(22 ± 2)g，由北京生命科学研究所实验动物中心提
供，动物许可证号 SYXK(京)2012-0024。
方 法
1 实验分组
90 只健康 BALB /c小鼠随机均分为 6 组，分别
为空白对照组，模型组，ATPS 低、中、高剂量组(30，
60，120 mg·kg －1)和阳性药组。适应性喂养 1 周后
开始实验。
2 模型制备
实验 d 1 下午 16:00 时，给药组小鼠按照上述
方案分别灌胃给予 ATPS(30，60，120 mg·kg －1) ，阳
性药组小鼠灌胃给予成人每千克体重用量 9 倍的瑞
巴派特(45 mg·kg －1) ，空白对照组和模型组小鼠灌
胃给予等体积生理盐水(20 μL·g －1) ，每日相同时间
操作，连续重复 8 d。d 8 上午 9:00 时，参照 Tamaki
等［8 － 9］研究建立的小鼠肠黏膜损伤模型，除空白对照
组外，其他各组小鼠分别腹腔注射 DDP 10 mg·kg －1，
空白对照组给予等体积生理盐水(10 μL·g －1)。
3 取材与检测
注射 DDP 24 h 后颈椎脱臼处死小鼠，迅速取其
回盲部以上 30 cm处约 2 cm小肠，均分称重，一份迅
速置于 4%多聚甲醛中，过夜后进行常规石蜡包埋切
片，余下部分迅速置于液氮中随后转移至 － 80 ℃冰
箱中保存待测。
3． 1 小肠黏膜形态学观察及病理学积分评价 常
规 HE 染色，光镜下观察其形态学变化;高倍镜下
(× 20) ，任选 5 个非重叠视野，根据改良 Chius
法［10］评价肠黏膜病理学积分。
3． 2 小肠黏膜 PCNA 免疫组化 SP 法分析 切片
脱蜡至水，3% H2O2 封闭内源性过氧化物酶，微波
抗原修复，山羊血清封闭抗原，加一抗 4 ℃孵育过
夜，加 HＲP标记二抗孵育后加 SP 孵育，DAB 显色。
结果判定:阳性细胞以细胞核内出现棕褐色颗粒为
准，于阳性细胞最密集处任选 5 个非重叠视野，高倍
镜(× 40)下计数 200 个细胞，计算阳性细胞百
分率。
3． 3 组织 EGF 测定 按照相关 ELISA 试剂盒说
明进行检测，其中组织以 PBS液制备组织匀浆。
4 统计学处理
符合正态分布的数据用 珋x ± s 表示。多组间比
较采用单因素方差分析。符合非正态分布数据相关
性分析，用 Spearman相关分析。所有数据分析均采
用 SPSS 17． 0 软件，检验水准为 α = 0． 05。
结 果
1 ATPS对小肠黏膜病理损伤的影响
空白对照组小鼠小肠黏膜绒毛细长，排列整齐，
各层结构正常存在;模型组与 ATPS 30 mg·kg －1组小
鼠小肠黏膜绒毛排列散乱、脱落，黏膜腺体稀疏，隐
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窝结构破坏严重，各层结构欠清晰，尤以模型组明
显;ATPS 60，120 mg·kg －1组及阳性药组小鼠肠黏膜
各层结构清晰，绒毛排列整齐但变矮变粗，腺体排列
较整齐，隐窝结构相对完整，见图 1。
图 1 ATPS对小肠黏膜病理损伤影响
2 ATPS对小肠黏膜组织病理学损伤积分及 EGF
含量的影响
与空白对照组比较，模型组小肠黏膜组织病理
学损伤积分明显增高(P ＜ 0． 01) ;与模型组比较，
ATPS 60，120 mg·kg －1组及阳性药组损伤积分均显
著降低(P ＜ 0． 01) ，ATPS 30 mg·kg －1组虽有降低，
但无统计学差异。与空白对照组比较，模型组 EGF
含量增高，但统计学差异不明显;与模型组比较，
ATPS 60，120 mg·kg －1组及阳性药组 EGF 含量均显
著增高(P ＜ 0． 01) ，ATPS 30 mg·kg －1组虽有增高，
但无统计学差异。见表 1。
表 1 组织病理损伤积分、PCNA阳性表达率与 EGF含量 n = 15，珋x ± s
组 别 病理学损伤积分 EGF含量 /ρg·mL －1 PCNA阳性率 /%
空白对照组 0． 17 ± 0． 13 260． 96 ± 9． 65 18． 55 ± 4． 21
模型组 4． 60 ± 0． 39a 287． 81 ± 16． 44 19． 50 ± 4． 71
ATPS 30 mg·kg －1组 4． 42 ± 0． 54 288． 16 ± 17． 73 24． 10 ± 7． 27
ATPS 60 mg·kg －1组 2． 43 ± 0． 51b 436． 73 ± 14． 53b 55． 50 ± 8． 44b
ATPS 120 mg·kg －1组 2． 03 ± 0． 44b 461． 96 ± 15． 74b 60． 50 ± 6． 22b
阳性药组 2． 93 ± 0． 24b 421． 36 ± 7． 22bb 57． 27 ± 4． 77b
与空白对照组比较，a:P ＜0． 01，与模型组比较，b:P ＜0． 01
3 ATPS对小肠黏膜组织 PCNA表达率的影响
免疫组化结果显示，小鼠肠黏膜中 PCNA 阳性
细胞主要表达在黏膜底部隐窝部分，黏膜中上部分
无明显阳性细胞显示。与模型组比较，ATPS 60，120
mg·kg －1组及阳性药组 PCNA表达率显著增高(P ＜
0． 01) ，ATPS 30 mg·kg －1组虽有增高，但无统计学差
异。见表 1 和图 2。
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图 2 各组小鼠小肠黏膜 PCNA阳性表达免疫组化图
4 EGF与小肠黏膜病理损伤积分和 PCNA阳性表
达率的关系
随着小肠黏膜组织中 EGF含量的增加，黏膜病
理损伤积分有下降趋势，见图 3A，黏膜组织 PCNA
阳性细胞表达率逐渐增加，且二者具有线性相关关
系(r = 0． 840)见图 3B。
图 3 EGF与小肠黏膜病理损伤积分和 PCNA阳性细胞表达率的关系
讨 论
小鼠腹腔注射 DDP 是国外常用的制备化疗后
肠黏膜损伤模型方法［8 － 9］。本实验中模型组小鼠小
肠黏膜绒毛排列散乱、脱落，黏膜腺体稀疏，隐窝结
构破坏严重，各层结构欠清晰，黏膜病理损伤严重与
空白对照组比较具有明显差异，表明 DDP致小鼠肠
黏膜损伤模型复制成功。瑞巴派特是临床上常用消
化道黏膜损伤保护剂，可提高损伤肠黏膜组织中
EGF含量促进肠黏膜细胞增殖促进损伤修复［11］，所
以本研究选择其为阳性对照药。
DDP对于细胞损伤作用主要是通过与细胞
DNA产生铂-DNA 络合物，镶嵌于 DNA 分子链中，
阻碍 DNA复制和修复所需酶类与 DNA链结合进而
抑制细胞分裂增殖、修复［1 － 2］。PCNA 是一种核蛋
白，是 DNA 合成酶的辅助蛋白，为细胞合成 DNA
所必需，参与肠黏膜损伤后细胞增殖修复，几乎所有
处于增生状态的细胞核均有表达，其表达及合成与
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细胞增生周期有关，代表着细胞的增殖状态，能准
确地反映细胞的生长速度和状态［12 － 17］。本实验发
现，ATPS 60，120 mg·kg －1组小鼠小肠黏膜 PCNA 阳
性细胞表达率均显著增加，表明 ATPS 能促进受损
肠黏膜细胞增殖修复。
EGF能促进上皮组织细胞 DNA、蛋白质合成增
加，刺激细胞有丝分裂，研究表明 EGF 是胃肠黏膜
受损增殖修复过程中重要的生长因子，通过与其受
体 EGFＲ结合相互作用激活下游有丝分裂原激活蛋
白酶系统(MAPK) ，从而启动细胞内 DNA 复制、转
录与翻译，刺激肠道细胞(包括干细胞)分化、增殖，
促进损伤黏膜修复［11 － 12，18 － 20］。本研究发现，ATPS
60，120 mg·kg －1能显著提高小鼠小肠黏膜组织 EGF
含量，同时从散点图上可以看出随着 EGF含量的增
加，小鼠小肠黏膜病理损伤积分呈下降趋势而 PC-
NA阳性细胞表达率则呈上升趋势，EGF 含量又与
PCNA阳性细胞表达率具有线性相关关系。Vascon-
celos等［12］认为 EGF含量和 PCNA阳性细胞数可以
衡量肠黏膜损伤程度。据此，我们认为 ATPS 可通
过提高肠黏膜组织中 EGF含量，刺激受损肠黏膜细
胞增殖，包括肠干细胞分化、增殖，修复受损黏膜，从
而产生保护 DDP致肠黏膜损伤的作用。然而 ATPS
是如何增加组织中 EGF含量的机制尚不明确，我们
推测 ATPS增加 EGF含量的机制可能与其强大的清
除自由基能力有关［21］。因为抗氧化剂可使非跨膜
型蛋白酪氨酸磷酸酶家族中的蛋白酪氨酸磷酸酶
SHP-2 二聚体降解，而 SHP-2 二聚体则与 EGF 的表
达呈负反馈关系［22］，此种假设机制有待进一步实验
探究。
综上所述，本研究以亮菌提纯物 ATPS 作为治
疗药物探究其对 DDP 致肠黏膜损伤保护作用及其
可能的作用机制，发现 ATPS 具有刺激 DDP 致小鼠
肠黏膜损伤后细胞增殖修复的能力，对 DDP致小鼠
肠黏膜损伤起到保护作用，其机制可能与 ATPS 可
提高肠黏膜组织中 EGF含量有关。
［ 参 考 文 献 ］
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(下转第 2691 页)
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2691
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得到白色固体 2． 89 g，产率 40． 19%，mp:＞ 160 ℃分
解，1H-NMＲ(DMSO-d6)δ(ppm) :2． 15 (s，3H，
CH3) ，2． 33 (m，4H，2 × CH2) ，2． 39 (m，4H，2 ×
CH2) ，2． 61 (s，3H，CH3) ，3． 56 (s，2H，CH2) ，
7． 39 (dd，1H，Ar-H) ，7． 55 (d，1H，Ar-H) ，7． 71
(d，1H，Ar-H) ，7． 95 (dd，1H，Ar-H) ，8． 06 (dd，
1H，Ar-H) ，8． 21 (d，2H，Ar-H) ，8． 23 (s，1H，
Ar-H) ，8． 25 (dd，1H，Ar-H)，8． 72 (dd，1H，Ar-H)，
10． 54 (s，1H，NH)。ESI-MS m/z:533［M +H］+。
讨 论
在文献报道的 ponatinib 的制备研究中，以吡咯
并［1，2-b］哒嗪为起始原料，没有报道完整的合成方
法，所用原料成本较高［6，8］。本路线参考专利介绍
的该药合成方法及其类似物相关专利文献［8］设计
了一条简单温和的制备方案，改进后的合成路线以
6-氯-3-氨基哒嗪为起始原料，经 9 步反应得到目标
化合物 ponatinib。此方法通过“一锅法”来制备中
间体 5，减少催化剂使用的同时增加收率，并且简化
操作。
设计合成路线时，最初参考文献［6］的方法，由
4-(溴甲基)-3-三氟甲基)苯胺制备关键中间体 10。
实验发现 4-( (4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲
基)苯胺水溶性较好，处理过程中需要使用高沸点
的正丁醇萃取，后处理复杂且不易纯化。之后重新
设计合成路线，中间体 8 与 3-碘-4-甲基苯甲酸先进
行酰化反应制备中间体 9，降低中间体的水溶性避
免使用高沸点溶剂萃取。此方法条件温和，收率高，
后处理简单，产物经重结晶纯化。
此反应路线所用原料廉价易得，增加收率的同
时降低了成本，所有中间体及目标化合物不需经柱
色谱纯化即可得到纯品，该法制得化合物 11 的1H-
NMＲ 图谱中，结构的特征性质子信号，质谱数据与
ponatinib分子式一致，薄层(二氯甲烷 ∶ 甲醇 = 30 ∶
1)检测仅显示单个斑点，表明化合物 11 的结构确
证且纯度较高。
［ 参 考 文 献 ］
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编辑:郭超伟 /接受日期:2013 － 08 － 16