全 文 ：收稿日期:2005-10-12　　　修回日期:2005-12-14
基金项目:武汉市“晨光计划”(No. 306121046)
通讯联系人:胡先明 , 男 ,教授 , 博士生导师 ,主要研究方向为药物化学.
第 22卷第 6期
Vol. 22　No. 6 分 析 科 学 学 报JOURNAL OF ANALYTICAL SCIENCE 2006 年 12 月Dec. 2006
文章编号:1006-6144(2006)06-0636-05
高效液相色谱法测定茯苓皮的指纹图谱
胡　燕 , 王明亮 , 邱国福 , 梁淑彩 , 王敬尊 , 胡先明*
(武汉大学药学院 ,武汉 430072)
摘　要:本文用正交设计优化茯苓皮的超声提取条件 ,并有效提取了茯苓皮药材内的主
要成分三萜类物质 ,同时利用高效液相色谱法(HPLC)建立了提取物的液相指纹图谱。
实验考察了不同提取溶剂 、提取条件对提取工艺的影响;确立了最佳色谱条件 ,得到了
茯苓皮中 24种总提取物的指纹图;同时对 10种不同产地的茯苓皮药材进行分析 ,标定
了 17个共有峰 。研究结果表明 , HPLC 指纹图谱方法重现性好 ,稳定可靠 ,可用于控制
茯苓皮中三萜成分的质量 。
关键词:HPLC;茯苓皮三萜成分;指纹图谱
中图分类号:O657. 7+2;R917　　　文献标识码:A
1　前言
茯苓皮为多孔菌科真菌茯苓(Poriacocos(Schw. )Wolf)的菌核黑色外皮 ,性平 ,味甘 、淡 ,归心 、肺 、脾 、
肾经[ 1] ,主要含有多糖 、三萜酸类等有效成分[ 2 -4] ,是一味常用的利水消肿药 ,对消除腹水和抗肿瘤有一定
效果 。历来主要把茯苓入药 ,对茯苓皮研究很少 ,通常当作废物弃去 。
目前 ,建立指纹图谱的方法有多种 ,包括光谱 、色谱以及质谱等方法。其中 ,红外光谱的指纹图谱[ 5] 特
征明显 ,但其对于物质分离存在缺陷;气相色谱用于指纹图谱[ 6] 也居多 ,但是它的分析对象有很大限制;液
质联用技术[ 7] 是一种非常有用的表征方法 ,但是由于仪器价格昂贵 ,运用也缺乏广泛性。
本文选择当前运用广泛 ,而且分离效果良好的高效液相色谱方法来建立指纹图谱。与以往有关茯苓或
茯苓皮三萜成分研究的报道[ 8 ,9] 相比 ,本研究优化了茯苓皮超声提取的最佳条件 ,建立了更经济 、毒性更小的
液相色谱条件 ,分析了十种不同产地的茯苓皮药材 ,分离效果良好 ,得到色谱峰达四十多个 ,并标出典型共有
峰17个 ,比文献[ 9]中的指纹谱丰富的多 ,为进一步评价和控制茯苓皮药材质量及其制剂的开发提供了依据。
2　实验部分
2. 1　仪器 、试剂与材料
Agilent 1100型高效液相色谱仪 ,配有四元梯度泵和 Agilent chemstation数据系统;SK5200H 超声
仪 ,频率 56 kHz(上海科导超声仪器有限公司)。
甲醇为色谱纯(Fisher 公司);乙醚 ,乙酸乙酯 ,磷酸均为分析纯 。配制流动相所用水为双蒸水。
茯苓皮药材产地分别为湖北恩施(A)、陕西(B)、湖南(C)、湖北宜昌(D)、安徽(E)、四川(F)、湖北罗田
(G)、云南(H)、广西(I)、湖北英山(J),经鉴定均为 2005 药典规定的多孔菌科真菌茯苓(Poriacocos
(Schw .)Wolf)的菌核黑色外皮。
2. 2　色谱分析条件
色谱柱为 Agi lent Zo rbax SB-C18柱(250×4. 6 mm , 5 μm);流动相为甲醇(A)和 0. 05%磷酸水溶液
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第 6 期 分 析 科 学 学 报 第 22 卷
(B),采用梯度洗脱(0 ～ 30 min , 70%～ 75%A;31 ～ 40 min , 75%～ 79%A;41 ～ 55 min , 79%～ 90%A;
56 ～ 70 min , 90%A);流速:1. 0 mL min - 1 ;检测波长:242 nm;进样量 10 μL;柱温:室温 。
3　结果与讨论
3. 1　提取溶剂的选择
精密称取干燥的宜昌茯苓皮粉末 1. 0000 g 5份 ,分别加入甲醇 、正丁醇 、95%乙醇 、乙酸乙酯和水各
25 mL ,超声提取 20 min ,过滤 ,重复提取 3次 ,合并滤液 ,回收溶剂并干燥 ,称量固体物 。固体物再用甲醇
洗至 10 mL 量瓶中 ,并定容至刻度 ,用 0. 45 μm 滤膜过滤后 ,在选定色谱条件下进样分析。实验结果表
明 ,茯苓皮的甲醇和 95%乙醇提取物的干膏重量较大 , HPLC 检查为三萜类物质;丁醇 、水提取物少 ,
HPLC 检查含三萜类物很少。实验选用甲醇作为茯苓皮的提取溶剂 。
3. 2　超声提取条件的优化
考察了甲醇用量 、提取次数与提取时间对提取效率的影响。利用 L9(34)正交表安排实验 ,因素水平
表见表 1 ,得到各提取样品的 HPLC色谱图及峰面积 ,标定共有峰 17个(见图 1)。
Table 1　Factor and level
Level
Facto r
methanol do sage /time s(A) ex traction time /min(B) ext raction time s(C)
1 10 10 1
2 15 20 2
3 20 30 3
Fig. 1　HPLC chromatographs of Poria peels triterpene and common peaks
对比发现 ,17个共有峰中有 6个峰的色谱峰面积均大于总色谱峰面积的 4%,它们的峰面积和占总峰面
积的80%以上。故以此6个峰对应成分的相对总含量(计算方法为:各样品的总干膏重量×其 6个峰面积占
总峰面积的百分比)作为正交实验的评价指标。数据处理及直观分析结果见表2 ,方差分析结果见表3。
Table 2　Scheme and result of L9( 34) orthogonal experiment(n=3)
Sample number
Factor
A B C D
To tal content of
six components
(×10 - 2 g)
① 1 1 1 1 5. 422
② 1 2 2 2 6. 198
③ 1 3 3 3 6. 286
④ 2 1 2 3 5. 575
⑤ 2 2 3 1 7. 034
⑥ 2 3 1 2 5. 205
⑦ 3 1 3 2 6. 910
⑧ 3 2 1 3 6. 140
⑨ 3 3 2 1 5. 770
K1 17. 906 17. 907 16. 767 18. 226
K2 17. 814 19. 372 17. 543 18. 313 ΢=54. 54
K3 18. 82 17. 26 20. 23 18. 00
R 0. 3353 0. 7037 1. 1543 0. 1040
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第 6 期 胡　燕等:高效液相色谱法测定茯苓皮的指纹图谱 第 22 卷
Table 3　Variance analysis results
Source
Sum of Squa res
o f deviations
d f Mean Square F-value P-value
A 0. 206 2 0. 103 11. 932 0. 077
B 0. 780 2 0. 390 45. 133 0. 022
C 2. 202 2 1. 101 127. 393 0. 008
Erro r 0. 017 2 0. 009
实验结果表明 ,各因素对实验结果的影响次序为提取次数(C) >提取时间(B) >溶剂用量(A)。本
实验条件下确定超声提取最佳工艺为 A 3B2C3 ,即每次用 20倍量甲醇超声提取 3次 ,每次 20 min。由方差
分析结果看出 ,因素 B超声时间和因素 C 提取次数对试验指标影响具有显著意义 ,溶剂用量对提取质量
影响较小 。按优选的最佳提取条件 , 制备3批样品 , 测定茯苓皮提取物中较大含量6个成分的总含量 ,结
果为 7. 102×10- 2 g 。
3. 3　不同产地的茯苓皮药材的指纹图谱比较
取不同产地茯苓皮药材 1. 0000 g ,分别按上述最佳提取条件得到提取液 ,浓缩干燥 ,并用甲醇将固体
物洗至 10 mL 容量瓶中 ,定容至刻度 。用 0. 45μm 滤膜过滤后 ,在选定色谱条件下进样分析。选定图谱中
峰面积较大 ,稳定且峰形较好的 8号峰作为参照峰(见图 2), 其余各共有峰均按其相对保留时间定性 ,并通
过 Agilent station图谱叠加程序 ,比较了不同茯苓皮提取成分指纹图谱中17个共有峰 ,相对保留时间见表 4。
Fig. 2　Fingerprint graphics of Poria peels triterpene from 10 different places
A-Enshi;B-Shangxi;C-Hunan;D-Yichang;E-Anhui;F-Sichuang;G-Luot ian;H-Yunnan;I-Guangxi;J-Yingshan.
Table 4　Relative retention time of the common peals in fingerprint of Poria peels samples
Peak
number
Sample number
A B C D E F G H I J
RSD(%)
1 0. 2911 0. 2910 0. 2903 0. 2913 0. 2916 0. 2910 0. 2906 0. 2909 0. 2915 0. 2901 0. 168
2 0. 4307 0. 4292 0. 4297 0. 4302 0. 4319 0. 4314 0. 4309 0. 4339 0. 4326 0. 4289 0. 363
3 0. 6466 0. 6444 0. 6469 0. 6454 0. 6476 0. 6479 0. 6466 0. 6509 0. 6496 0. 6465 0. 293
4 0. 7535 0. 7524 0. 7515 0. 7529 0. 7549 0. 7555 0. 7537 0. 7571 0. 7578 0. 7539 0. 267
5 0. 8184 0. 8158 0. 8192 0. 8175 0. 8198 0. 8208 0. 8203 0. 8243 0. 8240 0. 8188 0. 324
6 0. 8412 0. 8379 0. 8416 0. 8403 0. 8425 0. 8434 0. 8436 0. 8473 0. 8469 0. 8414 0. 340
7 0. 9259 0. 9257 0. 9274 0. 9263 0. 9271 0. 9277 0. 9267 0. 9274 0. 9274 0. 9263 0. 076
8 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0
9 1. 1833 1. 1915 1. 1876 1. 1869 1. 1850 1. 1841 1. 183 1. 1761 1. 1785 1. 1851 0. 371
10 1. 2387 1. 2508 1. 2444 1. 2435 1. 2404 1. 2390 1. 2369 1. 2275 1. 2324 1. 2409 0. 519
11 1. 3165 1. 3315 1. 3227 1. 3222 1. 3176 1. 3160 1. 3133 1. 3018 1. 3081 1. 3183 0. 618
12 1. 4696 1. 4876 1. 4769 1. 4759 1. 4701 1. 4677 1. 4649 1. 4497 1. 4584 1. 4707 0. 704
13 1. 5283 1. 5458 1. 5358 1. 5336 1. 5282 1. 5258 1. 5247 1. 5079 1. 5165 1. 5288 0. 676
14 1. 5460 1. 5628 1. 5531 1. 5519 1. 5455 1. 5434 1. 5430 1. 5262 1. 5341 1. 5462 0. 651
15 1. 5933 1. 6099 1. 6008 1. 5994 1. 5928 1. 5916 1. 5917 1. 5739 1. 5808 1. 5940 0. 630
16 1. 6232 1. 6389 1. 6310 1. 6291 1. 6221 1. 6219 1. 6232 1. 6048 1. 6103 1. 6242 0. 600
17 1. 6808 1. 6964 1. 6891 1. 6868 1. 6800 1. 6805 1. 6826 1. 6633 1. 6677 1. 6822 0. 572
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第 6 期 分 析 科 学 学 报 第 22 卷
表 5是不同产地茯苓皮药材 17个共有峰以四川产茯苓皮药材相对应的色谱峰的峰面积为 1 ,计算不
同产地茯苓皮药材的相对峰面积值 。通过比较指纹图谱中共有峰的组成和比例 ,可以了解不同产地茯苓
皮药材质量状况 。比较发现:10个产地茯苓皮主要成分几乎相同 ,但它们的含量(峰面积大小)差异显著 。
四川产茯苓皮整体成分的含量都较其它产地高 ,且色谱峰 3 、4 、6 、7 、8 、12 、14 、15 的峰面积最大;其次安徽
产茯苓皮的色谱峰 5 、9 、11 、13的峰面积为八种产地中最高;湖北罗田产的茯苓皮的色谱峰 1 、16 、17对应
成分的含量居高;而湖北英山茯苓皮的色谱峰中 10号峰和湖南产的茯苓皮 10号峰强度最大 。
Table 5　Relative peak areas of Poria pee ls from different area(*show the biggest peak area)
Peak
number
Sample number
A B C D E F G H I J
1 0. 3895 0. 6936 0. 8274 0. 9319 0. 9823 1 1. 0082* 0. 4680 0. 7700 0. 8894
2 0. 3726 0. 5716 1. 1040 * 0. 8282 0. 9347 1 1. 0794 0. 7143 0. 7598 0. 7541
3 0. 3180 0. 6125 0. 5534 0. 9445 0. 8712 1 * 0. 8810 0. 9677 0. 8032 0. 8858
4 0. 2177 0. 4277 0. 3747 0. 5956 0. 4505 1 * 0. 5353 0. 6584 0. 5024 0. 6422
5 0. 1196 0. 9292 0. 7415 1. 4513 1. 4855* 1 1. 4180 1. 2014 1. 1485 1. 1530
6 0. 3001 0. 3969 0. 5585 0. 6018 0. 5632 1 * 0. 4594 0. 7558 0. 4798 0. 7012
7 0. 3012 0. 6061 0. 4970 0. 8232 0. 6887 1 * 0. 7810 0. 8531 0. 7237 0. 8930
8 0. 3733 0. 5128 0. 8951 0. 7536 0. 8770 1 * 0. 8273 0. 8672 0. 6638 0. 7357
9 0. 4455 0. 8134 0. 7833 1. 0617 1. 2043* 1 1. 0993 0. 9236 0. 9910 1. 1255
10 0. 4176 0. 6217 0. 7183 0. 8851 1. 0556 1 0. 9871 1. 0087 0. 8726 1. 1776 *
11 0. 5210 1. 0063 0. 7527 1. 3189 1. 4950* 1 1. 2426 1. 2058 1. 1445 1. 3516
12 0. 4947 0. 4576 0. 5720 0. 7994 0. 5663 1 * 0. 5512 0. 6878 0. 4105 0. 5495
13 0. 4895 0. 6246 1. 3885 1. 1055 1. 8393* 1 1. 451 1. 5120 1. 0415 0. 6992
14 0. 4523 0. 4418 0. 5690 0. 6213 0. 6230 1 * 0. 7850 0. 7543 0. 6841 0. 8226
15 0. 3152 0. 3392 0. 5942 0. 62913 0. 5967 1 * 0. 5225 0. 8935 0. 5158 0. 6696
16 0. 4475 0. 6076 0. 6540 0. 7649 1. 0125 1 1. 1385* 0. 8888 0. 7550 0. 6716
17 0. 4904 0. 6259 0. 9481 0. 7933 1. 0925 1 1. 1349* 0. 9900 0. 7633 0. 5875
4　结论
(1)目前常用的中药提取方法主要有索氏提取 ,煎煮提取和超声提取等。与前两种方法比较 ,超声提
取具有快速 ,方便 ,不需加热 ,节省时间 ,提取的有效成分含量较高等优点[ 10] 。本实验主要讨论了茯苓皮
药材的超声提取条件的优化。
(2)本文通过实验筛选出以甲醇-水为主成分的洗脱体系 ,比文献用的乙腈-水体系毒性小 ,价格经济 ,
而且分离效果良好。在流动相中加入少量磷酸溶液能有效的防止茯苓皮提取物中三萜酸类成分峰的拖
尾;本文研究者以三萜酸类成分的紫外吸收峰在 242 nm 作为其检测波长 ,大部分组分都具有较强吸收。
(3)茯苓皮药材的成分复杂 ,而且缺乏标准品对照 ,正交设计方案选用茯苓皮色谱图中色谱峰较大的
6个峰对应的总含量作为评价指标。此评价指标能够客观的反应提取条件的优劣 。
(4)试验结果显示 ,10个产地的茯苓皮药材指纹图谱中主要峰群的整体图貌基本一致 ,但各成分的共
有色谱峰面积存在较大差异。此研究为快速鉴别和区分不同来源的茯苓皮药材以及进一步对其进行全面
质量控制研究提供了科学的依据 ,同时对于茯苓皮药材的选购和用药具有一定的指导作用。
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Determination of the Fingerprint of Poria peels by
High Performance Liquid Chromatography
HU Yan , WANG Ming-liang , Q IU Guo-fu , LIANG Shu-cai ,
WANG Jing-zun , HU Xian-ming*
(Collegeo f P harmacy , Wuhan Universi ty , Wuhan 430079)
Abstract:By using the o rthogonal design experiment to optim ize the ex t raction condi tion for Poria
peels , the main components t ri terpene in Poria peels we re effect ively ex t racted and the fingerprint of the
ext racts w ere set up by high-performance liquid chromatography . T he inf luence o f ex t raction solvent and
ext ract ing method on the ex tracting process w as studied. U nder the optimal chromatog rapic and
ext ract ion condi tions , the fingerprints for 24 kinds of to tal ex tracts w ere established , and 10 fingerprints
of Poria peels f rom dif ferent places w ere compared. The result show s that this HPLC fingerprint method
developed here is stable , economical and reliable and can be used for the quality contro l of Poria peels
medicine material.
Keywords:High-pe rfo rmance liquid chromatog raphy;Poria peels Triterpene;Fingerprint
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